THESE DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS VII - DIM-STEM-Pôle ...

UNIVERSITE PARIS VII-JUSSIEU, PARIS
ECOLE DOCTORALE B2T- Biologie et Biotechnologie
Institut Cochin
THESE
Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS VII
Spécialité Hématologie
Présentée et soutenue publiquement par
Sophie DIMICOLI-SALAZAR
Le 25 juin 2010
CONVERSION MYOGENIQUE STRIEE
DE CELLULES HUMAINES NON MUSCULAIRES
Jury composé de :
Pr Christine Chomienne Président
Dr Vincent Mouly Rapporteur
Dr Georges Uzan Rapporteur
Pr Emmanuel Teiger Examinateur
Dr Frédérique Bulle Directeur de thèse
Dr Isabelle Vigon Directeur de thèse
1

INTRODUCTION
2

INTRODUCTION
I- PLASTICITE CELLULAIRE
A- Généralités sur les cellules souches
1- Définitions
Les cellules souches (CS), sont des cellules ayant la capacité d’une part, de s’auto-renouveler
et d’autre part, de donner naissance à des cellules spécialisées matures. Ces cellules restent
dans un état indifférencié quiescent jusqu’à ce qu’il y ait besoin d’engendrer de nouvelles
cellules spécialisées matures. Plusieurs types de CS existent et sont définis suivant leur
capacité fonctionnelle. La seule CS totipotente à ce jour décrite, est l’œuf fécondé ; cette
cellule est capable d’engendrer la totalité des cellules et tissus de l’embryon. La CS
pluripotente est quant à elle, apte à donner naissance aux cellules appartenant aux trois
feuillets embryonnaires (mésodermique, endodermique et ectodermique) ; ces cellules
pluripotentes comprennent les CS embryonnaires (ES) dérivant de la masse interne du
blastocyste, et les cellules embryonnaires germinales (EG). Les cellules pluripotentes sont
nettement plus fréquentes en période pré-natale mais certaines d’entre elles ont également été
identifiées en période post-natale et sont capables de générer des cellules appartenant à
différents types de tissus, indépendemment du feuillet embryonnaire dont elles sont
originaires. Ainsi, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont aptes à se différencier
en cellules osseuses, cartilagineuses, stromales, adipocytaires et possiblement musculaires [1],
ceci, les caractérisant comme pluripotentes. Les CS multipotentes sont des cellules plus
matures capables de donner l’ensemble des cellules d’un tissu donné, comme par exemple, la
cellule souche hématopoïétique (CSH) qui va donner naissance à l’ensemble des cellules du
sang en passant par des étapes intermédiaires de progéniteurs bi- ou mono- potents au
potentiel de différenciation et de prolifération restreints mais qui restent capables de
reconstituer efficacement les cellules spécialisées du tissu hématopoïétique. Les précurseurs,
déjà engagés vers un type de cellules particulier sont plus différenciés et souvent
morphologiquement reconnaissables ; ils ont une durée de vie limitée et sont des cellules
monopotentes ou unipotentes. Ceux sont les cellules les plus fréquentes en période postnatale.
La hiérarchie de ces différentes CS est schématisée dans la figure I-1.
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Figur I 1 : Hiérarchie des cellules souches : progression de ces cellules tout au long du
développement, du stade de totipotence jusqu’au stade de différenciation terminale avec
l’intervention des cellules intermédiaires et des progéniteurs [2].
2- Régulation des cellules souches
Il apparaît donc que l’ensemble des cellules d’un organisme est régi selon un mode
hiérarchique qui est particulièrement applicable en période post-natale. En effet, les cellules
souches adultes (CSAd) ont une capacité d’auto-renouvellement et peuvent générer des
cellules matures aux fonctions spécialisées. Typiquement, les CSAd donnent naissance à des
cellules intermédiaires (progéniteurs puis précurseurs plus différenciés, cf. plus haut) avant
d’atteindre la phase différenciée terminale. Le rôle principal des CSAd est d’assurer
l’homéostasie du tissu auquel elles appartiennent, et dans une moindre proportion elles
permettent de remplacer les cellules perdues lors d’une lésion tissulaire. Ce mode d’évolution
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cellulaire se base donc sur un modèle hiérarchique : tout au long du processus de
différenciation, la CS perd son potentiel de prolifération. Selon le modèle hiérarchique
statique, les CSAd les plus primitives sont quiescentes et lorsqu’elles entrent en cycle sous
l’influence de stimuli du microenvironnement (cytokines, facteurs de croissance…), elles ne
peuvent que se différencier, sans retour à un état plus indifférencié.
Cependant, il a été récemment rapporté que les CS pourraient se diviser selon un mode
asymétrique. Dans ce cas, certaines CS vont générer deux cellules filles différentes
intrinsèquement. L’une va se différencier en cellule de plus en plus mature et l’autre va
contribuer au repeuplement du compartiment souche. Un exemple de ce modèle est celui des
CS musculaires striées squelettiques, les cellules satellites ; ce modèle sera décrit plus loin.
Un autre est celui des CSH. Il a été rapporté que 30% des CSH donnent naissance à deux
cellules filles différentes au niveau de leurs fonctions et leur capacité proliférative [3], [4] [5].
Cette division asymétrique a été confirmée comme d’origine intrinsèque, c’est à dire qu’il ne
s’agit pas d’une modification post-mitotique survenant, sous l’influence de facteurs
extrinsèques, sur des cellules filles initialement intrinsèquement identiques (Beckmann,
Sheitza, giebel blood 2008). Ce modèle de division asymétrique remet en cause certains
points du modèle hiérarchique.
Il se peut donc que ce modèle ‘hiérarchique’ soit en réalité plus ‘souple et cinétique’ faisant
intervenir des modes de divisions asymétriques et/ou symétriques, suivant les types de CSAd
et suivant les besoins du tissu lui-même : la CS quiescente qui entre en cycle peut soit se
différencier, soit ‘retourner’, après une phase de prolifération, à un état quiescent. Dans ce
« modèle cinétique », seules, les cellules proliférantes peuvent retourner à un état plus
immature quiescent ; les cellules ayant initié une différenciation, comme dans le modèle
hiérarchique, ne peuvent pas retourner à un état plus indifférencié ou quiescent. Toutes ces
transitions phénotypiques font suite à de nombreux remodelages chromatiniens permettant
d’activer différents programmes génétiques, soulignant une certaine plastique chromatinienne.
Le ‘modèle cinétique’ de régulation des CSAd peut donc appuyer l’hypothèse que les CSAd
soient dans une certaine mesure et dans certaines conditions, ‘plastiques’ et pourraient se
transdifférencier, c'est-à-dire générer des cellules fonctionnelles matures d’un autre lignage
que celui auquel elles appartiennent, après être passée par une étape moins différenciée puis
indifférenciée avec la possibilité en un second temps d’adopter une nouvelle orientation
cellulaire.
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B- Concept de plasticité
La transdifférenciation est définie comme la conversion d’un type cellulaire vers un autre,
sans que cela passe par un phénomène de dé-différenciation sous-entendant un passage par un
stade plus souche, puis de re-différenciation [6], [7]. Cette définition peut être discutée dans le
sens où, si on obtient une conversion complète de la cellule, cela implique le plus souvent une
extinction du programme initial de cette cellule et donc potentiellement une dé-différenciation
au moins partielle. Dans tous les cas, la mécanistique exacte sous-tendant cette
transdifférenciation, reste peu claire, faisant émerger rapidement le terme de plasticité
reflétant le degré de conversion d’une cellule vers un autre tissu sans préjuger du mécanisme.
De plus, le phénomène de transdifférenciation reste difficile à mettre en évidence. En effet, on
ne peut exclure la différenciation d’une population de CS pluripotentes. Le manque d’étude
clonale et le fait qu’une population cellulaire souche peut être hétérogène, même si elle est
hautement enrichie sont autant d’obstacles pour mettre en évidence un tel phénomène.
Quoi qu’il en soit, le taux de conversion observé dans ces différents modèles de
transdifférenciation varie de manière importante d’une étude à l’autre. En effet, suivant le
type de cellules d’origine (CSH, CSM, moelle osseuse totale…) et les conditions techniques,
pour la réorientation vers le tissu hépatique, ce taux va de 0,07% à 50% [8], [9] pour la
réorientation musculaire striée squelettique il est de 0,2% à 12,5% ([10], [11], [12] et pour la
réorientation pulmonaire, il varie de 1 à 30% [13], [14], [15], [2]. Même si, dans certains cas,
le taux de conversion peut atteindre 50%, en moyenne, il n’excède pas les 2%. Ces résultats
très différents dépendent des modèles de transplantations utilisés, de la nature et l’importance
de la lésion tissulaire, du nombre de lésions, du type de mobilisation des cellules, du
phénotype et de la fonction des cellules injectées, de l’existence ou non d’une irradiation de
l’hôte. Cependant, malgré l’existence dans certains travaux, d’une participation spontanée
efficace des cellules alternes, dans la majorité des cas, le taux de conversion reste faible, en
particulier lorsqu’il s’agit de réorientation vers le tissu neurologique ou cardiaque.
1- Les premiers travaux
Dans les années 2000, plusieurs études de conversion cellulaire tentent de remettre en cause le
dogme selon lequel une cellule nichée dans un tissu donné n’engendre que des cellules
spécialisées de ce tissu et ne peut pas adopter dans sa descendance le destin de deux feuillets
embryonnaires différents. L’un des premiers modèles de conversion s’est basé sur l’utilisation
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de neurosphères, agrégats cellulaires sphériques résultant de la prolifération in vitro de
progéniteurs immatures issus du striatum du cerveau de souris adultes : ces neurosphères, une
fois injectées par voie intra-veineuse dans des souris irradiées sub-létalement, participent à la
production de cellules hématopoïétiques fonctionnelles [16]. D’autres travaux ont montré que
les cellules de la moelle osseuse participaient à la régénération de plusieurs tissus, comme par
exemple, les cellules gliales du cerveau [17], [18], mais aussi les cellules musculaires [19],
[20]. Par la suite, d’autres conversions ont été rapportées : la moelle osseuse donnant du foie
[21], [22], [23], [24] ou du muscle [7], le muscle donnant du sang [25], le sang donnant du
cerveau [26], [27].
2- Controverses
a- Greffon cellulaire hétérogène pouvant ou non contenir des cellules pluripotentes
Toutes ces observations ont donc permis l’émergence du concept de plasticité et de
transdifférenciation, selon lequel une cellule d’un tissu donné peut changer ses
caractéristiques en se transdifférenciant en une cellule d’un autre tissu. Cependant, des
analyses plus rigoureuses ont été réalisées, y compris par les auteurs des publications initiales
remettant en cause ce phénomène de plasticité. En effet, l’hétérogénéité cellulaire peut
expliquer beaucoup des données expérimentales de plasticité : les populations cellulaires
utilisées, notamment les cellules de moelle osseuse, comprennent plusieurs types de cellules
plus ou moins immatures, ou bien contiennent des cellules pluripotentes, pouvant ainsi
contribuer à la régénération de différents tissus, sans qu’aucun phénomène de
transdifférenciation n’en soit à l‘origine. Le greffon peut donc être « contaminé » par des
cellules d’une autre origine tissulaire. Cette possibilité a été évoquée pour expliquer en
particulier, la reconstitution hématopoïétique observée après transplantation de cellules de
muscle squelettique [28], [29]. De plus, il a été montré que certaines CSH peuvent migrer
dans différents tissus, notamment dans le muscle, et contaminer ainsi le greffon utilisé pour le
protocole expérimental.
b- Fusion
Ce phénomène a également remis en cause le phénomène de plasticité. Il est en partie
responsable du chimérisme observé après greffe de moelle osseuse. Dans le modèle murin de
tyrosinémie induite provoquant des atteintes hépatiques sévères, Lagasse et al montrent que
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certaines souris peuvent être traitées par la transplantation de cellules de moelle osseuse et
que le mécanisme de conversion implique un phénomène de fusion cellulaire et non de
transdifférenciation [22]. Plusieurs études ont mis en évidence des phénomènes de fusion dans
des modèles de conversion vers des cellules hépatiques, cardiomyocytaires, neuronales et
musculaires striées squelettiques [30], [22], [31], [32], [33], [30]. La fusion cellulaire peut
donc être considérée comme un mécanisme possible de conversion, distinct du mécanisme de
transdifférenciation. Des travaux plus récents portant sur la contribution des CSH à la
myogenèse striée rapportent également des phénomènes de fusion entre cellules du donneur
et celles du receveur [34], [35], [36], [37]. Des expériences basées sur des modèles de souris
transgéniques exprimant Cre restreinte au lignage hématopoïétique, suggèrent qu’au moins un
des partenaires soit une cellule myéloïde différenciée [34], [35]. Le niveau de maturation de la
cellule musculaire impliquée dans cette fusion n’est pas encore connu. Cependant, dans des
conditions ‘physiologiques’, les myoblastes, progéniteurs musculaires, fusionnent soit avec
d’autres myoblastes, soit avec des myotubes natifs, soit avec des myofibres lésées. C’est
pourquoi, les macrophages ou d’autres cellules inflammatoires, connues pour infiltrer le
muscle lésé [38], sont très certainement exposés à des signaux fusogènes. En effet, les
macrophages sont connus pour être aptes à fusionner : physiologiquement, génération
d’ostéoclastes et pathologiquement, génération de cellules multinucléées gigantocellulaires
[39]. C’est pourquoi, la fusion des cellules musculaires endogènes avec des cellules
hématopoïétiques pourrait être possible.
3- Conversion spontanée et utilité thérapeutique
Que ce soit par un mécanisme de réorientation (transdifférenciation, fusion, autres…), ou
grâce à la présence de CS pluripotentes l’objectif final est de pouvoir à terme utiliser ces
cellules à des fins thérapeutiques. Une fois la fonctionnalité du modèle vérifiée, il faut
s’assurer de son absence de dangerosité (concernant le potentiel oncogénique par exemple) et
évaluer le potentiel immunogène des cellules. Dans tous les cas, il s’avère que le phénomène
de plasticité est rare et difficile à mettre en évidence. De plus, ce type de conversion cellulaire
survient dans des conditions particulières de stress lors d’une lésion tissulaire avec un besoin
urgent de réparation. Cette « plasticité spontanée », contribuant de manière très limitée à la
régénération du tissu lésé a cependant été utilisée dans un but thérapeutique. Par exemple,
dans le domaine de thérapie cellulaire cardiaque, l’effet de l’injection intra-coronaire de
cellules dérivant de la moelle osseuse a été, à plusieurs reprises, analysé. Bien que l’innocuité
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et le bénéfice réel de ce type de thérapeutique n’aient pas été encore démontrés, plusieurs
essais cliniques sont en cours : BOOSTI et II (cellules souches de moelle osseuse) [40], [41],
STEMI (cellules souches de moelle osseuse) [42], [43], REPAIR-AMI (CS de moelle osseuse
et progéniteurs provenant du sang périphérique) [44], REVIVAL-2 (CS de moelle osseuse)
[45], [46], MAGIC (CS périphériques) [47], [48]. L’amélioration globale de la fonction
ventriculaire, lorsqu’elle existe, est modérée et il est admis qu’elle n’est pas liée à une
conversion des cellules transplantées en cardiomyocytes mais plutôt à un effet paracrine du
greffon, ce qui explique probablement la faible efficacité de ce type de thérapie cellulaire.
D’autres essais ont été menés avec d’autres types de cellules telles que les fibroblastes [49],
les cellules musculaires lisses [50], les cellules endothéliales [51], avec, à nouveau, des
résultats modestes. Le transfert de myoblastes squelettiques n’a permis, lui aussi, qu’une
faible amélioration fonctionnelle cardiaque [52], avec un risque d’arythmie cardiaque élevé
nécessitant peut-être, si cette thérapeutique est maintenue, une co-implantation de
défibrillateur et/ou une co-administration prophylactique de pharmacopée [53]. Les résultats
les plus prometteurs sont observés avec les cellules contractiles telles que les cardiomyocytes
fœtaux qui peuvent être orientés vers la cardiomyogenèse adulte dans un environnement
approprié mais qui ne peuvent pas représenter une source cellulaire pour des raisons évidentes
[54]. Ces observations soulignent l’importance de greffer des cellules ayant une fonctionnalité
proche de celle de la cellule mature terminale du tissu lésé. Une étape préalable de
reprogrammation forcée des cellules du greffon, permettrait d’optimiser les effets de la
thérapie cellulaire et de pallier certaines complications inhérentes au type de cellules utilisées.
De plus, s’il est possible de greffer ces cellules reprogrammées provenant du receveur lui-
même, donc en contexte d’auto-greffe, l’immunosuppression ne serait pas nécessaire, et donc
les effets toxiques liées aux agents immunosuppresseurs (infections, néoplasies secondaires,
toxicités organiques notamment rénales) seraient évités.
C- Plasticité forcée et reprogrammation
1- Reprogrammation cellulaire basée sur le transfert de gènes maîtres ou essentiels pour le
développement d’un tissu
On peut espérer réorienter une cellule d’un tissu donné vers un autre type (tissu cible) en
modifiant son programme génétique sous l’effet de l’expression ectopique d’un gène
« maître » pour la détermination des cellules du tissu cible. Il existe plusieurs exemples de
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gènes « maîtres » ou tout au moins, jouant un rôle essentiel dans la détermination vers un tissu
donné : MyoD1 et Myf5 pour la myogenèse striée squelettique ; peroxysome activating
receptor-γ (PPARγ) et CCAAT-enhancer binding protein-α (C/EBP α) pour l’adipogenèse ;
pancreatic-duodenal homeobox gene (Pdx1) [55], [56], Neurogénine 3 (Ngn3) [57], [58] [59],
Hairy and Enhancer-of-split-1 (Hes1) et pancreas transcription factor-1a/p48 (PTF1-p48) pour
le développement pancréatique [60], [61], [62], [63], [64]; Pax6 [65], [66], [67] pour le
développement de l’œil. Ainsi, dans le domaine musculaire strié squelettique chez l’homme,
l’expression ectopique de MyoD1 par les adipocytes [68], les fibroblastes de peau, de muscle
ou de moelle osseuse [69], permet leur conversion myogénique striée squelettique à des taux
nettement plus importants que ceux obtenus dans le cadre de la plasticité (spontanée).
Cependant, MyoD1 entraine une sortie du cycle cellulaire et une différenciation immédiate, ce
qui peut constituer un obstacle pour des fins de thérapie cellulaire en termes de richesse en
cellules et survie du greffon. Concernant Pax6, son expression forcée chez le Xénope ou la
drosophile, permet la formation de structures ophtalmiques différenciées matures
surnuméraires. La présence de multiples marqueurs moléculaires indique l’existence de
cellules rétiniennes matures, de cellules de Muller, de photorécepteurs, de cellules
pigmentaires, similaires à celles observées dans l’œil endogène. La formation des yeux
ectopiques et endogènes peut être supprimée par la co-expression de formes dominantes
négatives de Pax6, soulignant son rôle potentiel dans des thérapies cellulaires de
reprogrammation [66]. De manière analogue, le transfert de PDX-1 dans les CSM humaines
de moelle osseuse induit leur différenciation en cellules produisant de l’insuline et permet
d’améliorer le phénotype de souris diabétique [70]. La neurogénine1 permet la réorientation
des CSM vers le lignage neurologique. Dans des modèles de souris ayant un accident
vasculaire cérébral, l’injection de ces cellules reprogrammées améliore la fonction motrice de
manière significative [71].
Les reprogrammations cellulaires peuvent être basées sur l’utilisation de facteurs non
déterminants pour le développement du tissu mais nécessaires pour l’obtention de certaines
propriétés. Par exemple, l’expression de protéines de jonction telles que la connexine-43 par
les myocytes striés squelettiques en vue de thérapie cellulaire cardiaque, a montré une
protection contre les tachycardies ventriculaires [72]. Ainsi, l’utilisation des myoblastes
squelettiques exprimant de manière ectopique la connexine 43 pourrait également être un outil
thérapeutique intéressant.
10

2- Reprogrammation cellulaire basée sur le transfert, dans des cellules somatiques, de
gènes impliqués dans le caractère souche : modèle des induced pluripotent stem cells (iPS)
La thérapie cellulaire pourrait également se baser sur l’utilisation de CS pluripotentes pour
lesquelles une différenciation particulière serait favorisée : ainsi, un greffon riche serait
obtenu avec plusieurs types de cellules matures selon les besoins. L’équilibre
plasticité/stabilité génétique des CS et des progéniteurs multipotents est fondamental pour leur
orientation [73]. Ce principe est particulièrement applicable aux cellules ES qui ont la
capacité de s’orienter vers tous les types cellulaires de l’organisme et en même temps ont la
capacité de se maintenir dans un état pluripotent dans certaines conditions de culture. L’autorenouvellement
nécessite le maintien d’un programme d’expression génique particulier, qui
est ajusté et modifié lorsque le progéniteur adopte une voie de différenciation. La régulation
positive ou négative des gènes est essentiellement basée sur l’action des facteurs de
transcription et celle des régulateurs épigénétiques comprenant les modificateurs des histones,
de la méthylation et les remodeleurs chromatiniens [74], [75]. C’est le contrôle étroit de
l’expression des gènes au cours du développement qui permet de gouverner la fonction et
l’identité cellulaires, et c’est en connaissant les différents régulateurs que la reprogrammation
cellulaire via une étape de dé-différenciation vers un état souche puis une différenciation
contrôlée vers un type cellulaire défini pourra être réalisée.
Concernant les facteurs de transcription impliqués potentiellement dans l’état souche d’une
cellule, le modèle des cellules ES a permis d’identifier plusieurs facteurs régulant l’état de
pluripotence des ES : Oct4, Nanog, Sox2, que ce soit chez la souris ou l’homme. Ainsi, grâce,
en partie, à ces facteurs de transcription, des cellules ES-like, les iPS, modèle cellulaire de
reprogrammation par dé-différenciation et re-différenciation, ont été obtenues à partir de
cellules somatiques. Il est ainsi possible d’obtenir des CS ayant les mêmes caractéristiques
que les cellules ES sans qu’il soit nécessaire de détruire des tissus embryonnaires, levant ainsi
un obstacle éthique. Takahashi et al ont obtenu des iPS à partir de fibroblastes de souris en les
faisant exprimer de manière ectopique Oct4, Sox2, Klf4 et Myc [76]. Puis, des iPS humains
ont été établies à partir de cellules somatiques en utilisant deux combinaisons de facteurs de
transcription : Oct4, Sox2, Klf4, Myc ou Oct4, Sox2, Nanog, Lin28. Bien que les perspectives
soient intéressantes dans le cadre de la thérapie cellulaire, les facteurs utilisés sont
potentiellement oncogéniques [77]. Il a été cependant montré que Myc n’est pas nécessaire
pour la génération des iPS [78], [79]. Plus récemment, l’utilisation de deux facteurs (Oct4 et
Klf4 ou Myc) a été montrée suffisante pour reprogrammer des CS neurales [80]. Enfin, Oct4
11

est suffisant pour générer des CS pluripotentes à partir de CS neurales de souris [81]. Il faut,
in vivo, que la différenciation de ces iPS soit optimale et contrôlée, de même que leur
fonctionnalité. A ce jour, peu d’études de réparation cellulaire basées sur les cellules dérivant
d’iPS sont décrites mais des cardiomyocytes fonctionnels ont été obtenus à partir d’iPS,
soulignant leur utilisation potentielle dans les thérapies cellulaires cardiaques [82]. D’autre
part, dans le domaine de la myogenèse striée squelettique, le transfert de séquences codant la
dystrophine dans des IPS provenant de patients souffrant de myodystrophies de Duchenne ou
dans des IPS dérivant de souris mdx permet de détecter de la dystrophine et d’améliorer le
phénotype des souris transplantées [83].
3-Facteurs pouvant influencer la reprogrammation cellulaire
a- Régulation épigénétique
La modulation épigénétique influe sur l’accessibilté des facteurs de transcription à l’ADN
[84], [85], soulignant leur rôle potentiel dans la régulation des états souche/différencié.
Par exemple, la méthylation de l’ADN de certaines séquences régulatrices de gènes
particuliers permet la différenciation des cellules et limite leur pluripotence. Les cibles de
méthylation sont les promoteurs de gènes impliqués dans le caractère souche ou des gènes
spécifiques de lignée [86]. Cette observation suggère que la méthylation réprime stablement la
pluripotence et empêche la réactivation aberrante de dé-différenciation au moment de la
maturation du progéniteur. Cette hypothèse est appuyée par le fait que la génération d’iPS à
partir de cellules somatiques est amplifiée par un inhibiteur de méthylation, la 5-azacytidine
[87]. D’autre part, l’exposition des CSM de moelle osseuse à la 5-azacytidine favorise
l’expression de protéines musculaires et de canaux calciques [88], indiquant que ce type de
modulation épigénétique peut concerner plusieurs niveaux de maturité cellulaire.
L’acétylation est un autre mode de régulation épigénétique impliqué dans la balance
pluripotence/différenciation. Il a été récemment montré que les précurseurs
d’oligodendrocytes peuvent être convertis en CS neurales après exposition aux bone
morphogen protein (BMPs), via des phénomènes d’inhibition d’histone déacétylase (HDAC).
L’inhibition des HDAC favorise la plasticité des oligodendrocytes en les rendant plus
‘souches’, via notamment la réactivation de Sox2. Il a été également montré que l’inhibition
des HDAC active l’expression de Sox2, Sox12 ainsi que d’autres facteurs impliqués dans
l’état souche neural et éteint les marqueurs d’oligodendrocytes, soulignant que l’acétylation
12

permet une plasticité neurale [89]. Chez l’homme, des iPS ont été obtenus à partir de
fibroblastes reprogrammés avec la combinaison Oct4 et Sox2 en présence de l’acide
valproïque qui est un agent acétylant [90]. Cela montre que d’une part, certaines molécules
chimiques favorisent à elles seules une reprogrammation et que d’autre part, il est nécessaire
de mieux comprendre l’environnement épigénétique des cellules à reprogrammer.
b- Influence des micro-ARN (miRNA)
Les micro-ARN (miRNA) sont des régulateurs de la traduction récemment identifiés. Ces
petites séquences d’ARN non codant se fixent sur des ARN cibles et répriment leur
traduction. Les miRNA sont impliqués de manière globale dans la régulation de l’ontogénie
de nombreux tissus [91], [92], en particulier le muscle strié squelettique [93], [94] et le
muscle cardiaque [95], à plusieurs stades du développement. Leur rôle dans la régulation
pluripotence/différenciation dans les cellules ES a été souligné par les résultats d’expériences
de gain ou perte de fonction avec des miRNA spécifiques [96]. D’autres travaux récents ont
montré l’association de facteurs de transcription clés des cellules ES (Oct4, Nanog, Sox2 et
TCf3) et des miRNA préférentiellement présents dans les cellules ES [97]. De plus
l’inhibition d’Oct4 résulte en une extinction de ces miRNA [97]. Ainsi, l’inhibition de
certains miRNA impliqués dans l’auto-renouvellement des cellules souches, permettrait de
reprogrammer des cellules somatiques.
4- Synthèse
L’homéostasie tissulaire est assurée par les fonctions des cellules souches spécifiques de ces
tissus. Dans certaines conditions pathologiques, ces cellules souches ne sont pas suffisantes
pour une réparation optimale. Dans ce cas, d’autres cellules provenant d’autres tissus, peuvent
migrer et participer à la régénération tissulaire. Ces cellules alternes peuvent aider en
sécrétant des facteurs de croissance, de survie ou chémoattractants (effets paracrines), ou bien
en se réorientant pour se différencier en cellules matures terminales fonctionnelles du tissu
atteint. Ce phénomène de transdifférenciation suggére une certaine plasticité des cellules, et
son existence reste controversée. Même si elle a été parfois mise en évidence, cette plasticité
spontanée est un mécanisme de réparation marginal.
Le contrôle de l’équilibre stabilité/plasticité génétique des cellules, en particulier celui des
CS, est finement régulé par des facteurs de transcription particuliers, un contexte épigénétique
13

et les miRNA. La meilleure compréhension des marques transcriptionnelles et épigénétiques
des différents états des CS, pluripotence ou état différencié, a permis d’envisager des modèles
de reprogrammation forcée, en présence ou non de régulateurs épigénétiques. Les premiers
travaux d’expression ectopique se sont basés sur l’utilisation des facteurs maîtres essentiels
dans le développement d’un tissu.
Cette étape de reprogrammation forcée préalable des cellules à utiliser potentiellement dans la
thérapie cellulaire pourrait optimiser la régénération du tissu lésé. Dans les expériences de
cette thèse, nous avons utilisé les facteurs de transcription maîtres impliqués à des étapes clés
du développement musculaire strié squelettique ou cardiaque.
Cependant, il faut réfléchir sur l’efficacité de cette reprogrammation et sa durabilité pour un
effet thérapeutique significatif. D’autre part, le site d’intégration du transgène peut être
responsable de survenue de tumeurs liée au site d’intégration, comme cela a pu être observé
avec l’essai clinique de l’équipe d’A. Fisher à Necker qui a consisté en l’auto-greffe de CSH
corrigée génétiquement via un transfert rétroviral du transgène γC (qui est absent chez les
patients présentant le déficit immunitaire de type SCID). Chez trois patients inclus dans cet
essai, cette intégration a été responsable de mutagenèse insertionnelle avec expression
aberrante du gène codant pour LIM domain only 2 (LMO2) menant à une lymphoprolifération
T qui a été responsable de la mort chez un des sujets et qui a pu être contrôlée chez deux
autres sujet uniquement grâce à l’administration de chimiothérapie. Le développement de ces
tumeurs lymphoïdes a pu être également favorisé par l’avantage de survie conféré par la
thérapie génique (apport d’un transgène dont l’équivalent génique dans la cellule lymphoïde
est absent ou muté) aux progéniteurs lymphoïdes, ainsi qu’au protocole lié à l’utilisation du
vecteur lui-même (type de promoteur, existence ou non de séquences insulatrices, utilisation
de gènes suicides) [98].
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II- MUSCLE STRIE SQUELETTIQUE
1- Myogenèse striée squelettique et réparation naturelle
A- Myogenèse striée squelettique embryonnaire
1- Etapes tissulaires de la myogenèse striée squelettique embryonnaire
Le muscle squelettique dérive, dans l’embryon, du mésoderme paraxial, qui se segmente en
somites de part et d’autres du tube neural et de la notochorde selon une progression craniocaudale,
(le somite le plus jeune étant le plus postérieur), [99], cf. figure II 1 ci-dessous.
Chaque somite formé se différencie rapidement en sclérotome ventral et en dermomyotome
dorsal. Le sclérotome, contribue à la formation du cartilage, des os de la colonne vertébrale et
des côtes, alors que le dermomyotome, donne naissance au derme du dos et aux muscles
squelettiques du corps, des membres, et de certains muscles faciaux. Le dermomyotome
epaxial, adjacent au tube neural et à la notochorde, donnera naissance aux muscles épaxiaux
(muscles du tronc) grâce à la formation du myotome [100], [101], [102]. Les autres muscles
(en dehors de la plupart des muscles de la tête) dérivent de l’extrémité hypaxiale du
dermomyotome grâce à la formation du bourgeon des muscles des membres [103], [104] . Les
muscles de la tête dérivent, eux, du mésoderme antérieur paraxial non segmenté ainsi que du
mésoderme préchordal [105].
15

Figure II 1 : Représentation schématique des étapes précoces de la myogenèse squelettique
(Buckingham et al 2006). Le muscle strié squelettique provient du mésoderme paraxial qui se
segmente en somites. Chaque somite se divise en dermomyotome et en sclérotome. Les
structures musculaires proviennent des régions épaxiale (muscle du tronc) et hypoaxiale du
dermomyotome (muscle des membres). Le myotome est la première structure musculaire et
contribue majoritairement aux muscles épaxiaux.
2- Etapes cellulaires de la myogenèse striée squelettique embryonnaire
a- Progéniteurs myogéniques
Les somites contiennent des cellules souches/progéniteurs pluripotents qui donnent naissance
au cartilage, aux cellules endothéliales, aux cellules des tendons, au tissu conjonctif, au derme
et au muscle squelettique [106]. Les premiers progéniteurs prédéterminés pour le muscle
squelettique proviennent de la région centrale du dermomyotome [100]. Ces cellules sont
positives pour les facteurs de transcription Pax3 et Pax7. Une partie de cette population de
progéniteurs Pax3+ et Pax7+ se différencie précocement dans le myotome et donc sortent du
cycle et une autre partie est maintenue en état de prolifération durant le développement
embryonnaire et fœtal des muscles du tronc et des membres [100], [102] et est à l’origine d’un
16

continuum de progéniteurs musculaires de plus en plus matures : les progéniteurs Pax3+
hypaxiaux [107], [108], [109] puis les myoblastes qui expriment les gènes majeurs de
détermination musculaire que sont les Myogenic regulator factors ou MRF (Myf5+ et
MyoD1+). MRF4, a un rôle plus difficile à préciser, mais joue également un rôle déterminant
pour la progression progéniteur/myoblastes pendant la période embryonnaire [110], [111],
[112], [113], [101], [102], [100]. La figure II-2 représente les différentes populations de
cellules myogéniques en fonction du temps, de leur origine et de l’expression des facteurs-
clés.
b- Formation des fibres musculaires
Ces myoblastes prolifèrent dans un premier temps puis se différencient et fusionnent pour
donner des myotubes. Les myotubes sont des syncitia pluri-nucléés formés par la fusion de
plusieurs myoblastes lors de la myogenèse. Les myotubes se différencient ensuite en fibres
musculaires ou myocytes (qui comprennent de multiples myofibrilles) sous l’influence
notamment des MRF. Au cours de cette différenciation, les myofibrilles, (qui composent la
fibre musculaire), s’organisent et s’agencent en sarcomères. Le cytosquelette se réarrange et
les noyaux (provenant des myoblastes) se relocalisent à la périphérie, donnant une nouvelle
architecture au syncitium. Le sarcomère est composé de plusieurs filaments (myosine, actine,
titine) intervenant dans la contraction musculaire. [103], [114]. Cette phase constitue la
myogenèse primaire. Pendant la myogenèse secondaire, les fibres secondaires sont générées à
partir de la fusion de myoblastes entre eux [115], et également avec les myofibres primaires
[116]. Les myotubes secondaires restent en un premier temps attachés aux myofibres
primaires, puis s’autonomisent, s’allongent et se distinguent des myofibres primaires par leur
plus petite taille [117]. De manière générale chez les mammifères, les fibres primaires sont
programmées pour un phénotype lent, alors que les fibres secondaires le sont pour un
phénotype rapide [118], [119].
17

Figure II 2: Représentation schématique des différentes populations de cellules
myogéniques en fonction du temps, de leur origine (partie A) et de l’expression des facteurs
clés (partie B) (selon Sambasivan et Tajbakhsh 2007). Il existe plusieurs vagues de
progéniteurs myogéniques constituant un continuum de cellules myogéniques s’étendant des
progéniteurs somitiques, du dermomyotome (population Pax3+/Pax7+), du myotome (avec
notamment les progéniteurs Myf5+) puis les myoblastes (Myf5+ et Myf5-).
18

3- Régulation du développement musculaire strié squelettique
Comme tout processus de développement tissulaire, celui-ci est contrôlé par deux grandes
voies de régulation : une voie intrinsèque impliquant des facteurs de transcription et une voie
extrinsèque impliquant des facteurs environnementaux.
a- Les facteurs intrinsèques
De nombreux facteurs de transcription interviennent dans le développement musculaire strié
squelettique. On peut citer notamment les facteurs appartenant à la famille des Pax (Pax3,
Pax7), les MRF (Myf5, MyoD1, Mrf4, Myogénine), les protéines de la famille Six, le facteur
SRF. Nous nous intéresserons aux facteurs intervenant dans la spécification et la
détermination myogéniques striés squelettiques : d’une part, les facteurs à homéodomaine
pair-box Pax3 et Pax7 qui sont essentiels dans la spécification des progéniteurs musculaires
[120], [100] et d’autre part, les MRF à domaines bHLH, Myf5, MyoD1, Mrf4 et Myogénine,
qui sont essentiels à la détermination et/ou la différenciation myogénique [114]. Le processus
responsable de l’orientation que va prendre une cellule particulière vers un tissu précis au
cours du développement implique une phase de spécification puis une phase de détermination.
La spécification n’est pas un état permanent et les cellules peuvent encore ‘choisir’ leurs
destinées, sous l’influence d’informations supplémentaires. En revanche, la détermination est
un état dans lequel la cellule s’est engagée de manière irréversible vers un lignage. Ce
processus est sous le contrôle de facteurs environnementaux et intrinsèques et mène à l’état de
différenciation terminale.
i- Les facteurs Pax
Les facteurs Pax3 et Pax7 sont des facteurs de transcription [121], [122] nécessaires à la
spécification des progéniteurs musculaires embryonnaires et/ou adultes [120], [100]. Ils sont
essentiels pour l’émergence et la survie des progéniteurs musculaires puisque les souris
doublement invalidées pour ces gènes présentent un défaut quasi-total en cellules musculaires
[100], [121], [123]. Ces progéniteurs Pax3+/Pax7+ dérivent de la région centrale du
dermomyotome [113] et sont maintenus tout au long du développement musculaire aux stades
embryonnaire et fœtal [101], [100], [102], [124]. Ils prolifèrent et n’expriment pas de
marqueurs musculaires mais ils peuvent initier le programme myogénique en activant les
facteurs Myf5 et MyoD1 [125]. En effet, Pax3 régule directement Myf5 et MyoD1 [121],
[112], [126] en période pré-natale. Dans la période post-natale, les facteurs Pax3 et Pax7
19

égulent la myogenèse via MyoD1 et n’ont pas d’action directe sur Myf5, [100] [121]. Cette
population de progéniteurs musculaires embryonnaires Pax3+/Pax7+ contribuent donc à la
croissance du muscle embryonnaire et fœtal mais intervient également dans l’émergence des
cellules satellites, cellules souches musculaires chez l’adulte [100], [101]. Le facteur Pax3 est
d’abord exprimé dans le mésoderme pré-somitique [127], [128] puis dans l’ensemble du
dermomyotome et enfin, est restreint à la région hypaxiale [127], [129]. Les modèles
d’invalidation totale et conditionnelle de Pax3 montrent que ce facteur est impliqué dans la
musculature hypaxiale et surtout épaxiale [130], [127], [131], [132]. Les progéniteurs des
muscles des membres de ces mutants entrent en apoptose et sont incapables de migrer vers les
bourgeons des muscles des membres [107]. Pax3 est également impliqué dans la formation du
myotome, mais cette fois, de concert avec les facteurs MRF [110]. Enfin, Pax3 n’est pas
exprimé dans les progéniteurs des muscles de la tête [133], [122] contrairement à Pax7 qui y
est détecté, une fois que Myf5 est exprimé [122]. Pax7 intervient également dans la
myogenèse du tronc et des membres. Les progéniteurs Pax7+ assurent le développement
musculaire jusqu’à la taille adulte du muscle [122], [125], [126] et sont à l’origine des cellules
satellites dont la survie est essentiellement assurée par le facteur Pax7.
Figure II 3 : Rôle de Pax3 et Pax7 dans la régulation des progéniteurs musculaires striés
squelettiques pré- et post-nataux (Buckingham et al 2007)
20

ii- Les Myogenic Regulator Factors
Les gènes MRF codent pour des facteurs à domaine bHLH essentiels dans les phases de
détermination (Myf5, MyoD1, Mrf4) et de différenciation (Mrf4, Myogénine) de la
myogenèse striée squelettique au cours du développement embryonnaire et, pour Myf5 et
MyoD1 durant la période post-natale. Le premier facteur MRF à avoir été cloné et étudié est
MyoD1 [134], [135], suivi de Myf5 [134]. Des expériences d’expression ectopique leur ont
conféré la propriété de facteurs maîtres myogéniques striés squelettiques, puisque ces
protéines sont aptes à réorienter de nombreux types cellulaires non musculaires vers le lignage
myogénique strié squelettique (ces résultats seront décrits plus loin). Ces observations ont été
confortées par les résultats des modèles expérimentaux étudiant la myogenèse au cours du
développement embryonnaire et fœtal. Les progéniteurs pré-nataux qui expriment ces facteurs
sont les myoblastes engagés définitivement dans la voie myogénique striée squelettique.
L’induction des MRF dans les cellules Pax3+/Pax7+, reflétant la progression
progéniteur/myoblastes, est régulée par des facteurs extrinsèques environnementaux (qui
seront présentés dans le chapitre suivant). En combinaison avec Pax3, Myf5 est essentiel pour
la myogenèse du tronc [136], [137]. L’expression de Myf5 au niveau de la région dorsoantérieure
des somites, à E8 chez la souris, précède celle de MyoD1 qui a lieu au niveau de la
région dorso-latérale du somite à E9,5 [138], [139]. MyoD1 est un facteur de détermination
myogénique qui agit plus particulièrement dans la myogenèse hypaxiale [140]. Myf5 et
MyoD1 sont des facteurs déterminants de la myogenèse striée squelettique car ils orientent
définitivement les progéniteurs vers le lignage musculaire alors que la myogénine est requise
pour la différenciation musculaire de ces précurseurs engagés. Le rôle de Mrf4 est plus
complexe. Il permet la progression progéniteur/myoblaste uniquement durant la phase
embryonnaire [141], [142], [143], [144], [110]. Mrf4 intervient également dans la
différenciation en activant directement la myogénine. Les souris triplement invalidées pour
Myf5, MyoD1 et Mrf4 sont totalement dépourvues de structures musculaires et de myoblastes
[110], [111]. Les progéniteurs sont en revanche présents et ils adoptent un autre programme
de différenciation ou entrent en apoptose [145]. La différenciation musculaire implique une
sortie du cycle cellulaire, la fusion des myoblastes et la formation des cellules multinucléées
(myofibres). La Myogénine est essentielle pour la maturation musculaire terminale. Dans les
souris invalidées pour la Myogénine, il est observé un grand défaut au niveau de la
différenciation musculaire [146], [147]. De manière surprenante, l’inactivation conditionnelle
de la Myogénine en période fœtale ne résulte pas en une perte complète de cette
différenciation, suggérant qu’il pourrait exister des mécanismes Myogénine-indépendants en
21

période fœtale pour la maturation musculaire terminale [148]. Mrf4 est également détecté
dans les fibres musculaires matures. Il pourrait être impliqué dans le maintien du statut de
différenciation, mais l’inactivation de son gène ne permet pas d’obtenir un phénotype
musculaire particulier [143].
b- Facteurs environnementaux
De nombreux facteurs environnementaux régulateurs de la myogenèse striée squelettique
(Sonic Hedgehog, Wnt, BMP, Myostatine, Notch, FGF, HGF/Met, insuline/IGF1, acide
rétinoïque…) ont été identifiés et étudiés. Par exemple, la Myostatine, qui appartient à la
famille du TGF, régule négativement la masse musculaire en inhibant la prolifération
myoblastique [149], [150], [151], [152]. La voie Notch intervient quant à elle au niveau du
dermomyotome pour favoriser l’orientation vers le lignage musculaire [153], amplifier le pool
de progéniteurs Pax3+/Pax7+ et permettre la prolifération myoblastique [154]. La voie
HGF/Met régule positivement la migration des myoblastes pour la myogenèse hypaxiale
[155]. D’autres acteurs interviennent également tels que les acteurs de la voie Sonic
Hedgehog (Shh), les agents Wnt et les BMP.
i- Voie Sonic Hedgehog (Shh)
La voie Shh est une voie de signalisation importante dans les processus développementaux, le
contrôle de la prolifération, la survie cellulaire et la croissance chez l’embryon et l’adulte. Shh
est une glycoprotéine sécrétée qui fixe et active un récepteur hétérodimérique composé de
Patched (Ptc) et Smoothened (Smo). Il est directement impliqué dans la détermination du
somite embryonnaire [156]. Il est essentiel pour la myogenèse épaxiale, comme le montrent
les résultats obtenus dans les mutants Shh qui perdent leurs myoblastes épaxiaux
(occasionnant la perte de Myf5) [107]. En effet, Shh active l’expression de Myf5 via les
facteurs gli [107] et son absence abolit toute expression de Myf5. Par ailleurs, Shh régule
l’organisation du dermomyotome [157], [158], en favorisant notamment l’émergence des
progéniteurs musculaires et en maintenant l’identité des structures épithéliales nécessaires à la
formation du myotome [159]. Shh intervient également dans la prolifération mais également
dans la différenciation musculaire adulte comme le montrent les expérimentations réalisées
sur des myoblastes de poulet et de souris (C2C12) (Elia, Madhala, Ardon, 2007, BBA).
22

ii- Voie Wnt
Les protéines Wnt sont des molécules sécrétées, hautement conservées, impliquées elles aussi
dans les processus développementaux [160], [161], [162]. Wnt induit les programmes
myogéniques dans le somite [163]. Il existe au moins 19 membres Wnt chez la souris et
l’homme. Chez la souris, les principaux facteurs Wnt sont Wnt1, Wnt7a, Wnt3, Wnt5b [164],
[165]. Les Wnt initient la signalisation via les récepteurs Frizzled (Fz). Le signal wnt est relié
par 2 cascades en aval: La voie canonique principale, implique la stabilisation de la β-caténine
intracytoplasmique puis sa translocation dans le noyau et l’activation des gènes cibles. Les
molécules Wnt interviennent différemment dans la régulation du développement musculaire
strié squelettique. Par exemple, Wnt1 et Wnt3a, via la voie canonique, permettent l’activation
de Myf5 au niveau somitique [166], [167]. D’autres facteurs tels que Wnt7a [168], via une
voie non canonique, agissent sur MyoD1 et régulent la myogenèse hypaxiale [169]. Certains
Wnt interviennent plus tardivement dans la régulation du type de myofibres (lentes ou
rapides), tels que Wnt11 ou Wnt5. Chez la souris, Wnt11, via la voie canonique, intervient
dans l’organisation de l’élongation des myofibres [170]. Enfin, Wnt4 (voie canonique)
favorise la différenciation myogénique chez la souris [171], [172] et chez le poulet [173]. Il a
été également montré des interactions entre les voies de signalisation Notch et Wnt via GSK3
qui est maintenu dans une forme active par Notch et qui est inhibé par Wnt permettant la
progression de la phase expansion/prolifération des progéniteurs musculaires (Notch) vers la
phase de différenciation (Wnt), notamment pendant la myogenèse post-natale [174].
iii- Voie BMP
Les BMP sont des membres de la super-famille des facteurs TGFβ. Ces protéines jouent un
rôle critique dans la chondrogenèse [175], [176]. La voie de signalisation BMP est également
connue pour le blocage de la différenciation adipocytaire et myogénique [177], [178]. Dans le
cadre de la myogenèse somitique, les BMP fournissent des signaux inhibiteurs qui se
coordonnent avec ceux des signalisations Shh et Wnt [179]. La sécrétion de BMP par le
plateau latéral du mésoderme (BMP4) évite l’expression prématurée de MyoD1 au niveau
somitique en agissant via Pax3 [180], [181], [182]. La voie BMP permettrait également de
bloquer la différenciation prématurée des progéniteurs myogéniques hypaxiaux en migration.
L’action des BMP est contrebalancée par celle de Noggin qui est sécrété en réponse à la
signalisation Wnt [183], [163], [179], [184]. La voie de signalisation Shh régule également la
concentration en BMP au niveau des bourgeons des muscles du membre [185]. Certains
23

agents BMP sont également régulés par la follistatine, qui appartient aussi à la famille TGFβ :
chez le poulet, pendant le développement de la myogenèse hypaxiale, la follistatine favorise
l’action de BMP7 et induit la croissance musculaire BMP7-dépendante mais bloque son
action apoptotique [186]. Plus récemment, BMP11 a été décrit comme un inhibiteur de la
différenciation myogénique et par conséquent, comme un régulateur de la masse musculaire
[187].
c- Les mi-RNA
Les micro-RNA interviennent, eux aussi, dans la régulation de nombreux processus
biologiques incluant l’oncogenèse [92], [91], le développement des membres [188], [189], du
poumon, du système hématopoïétique [175].
Plusieurs miRNA ont été caractérisés comme modulateurs de la différenciation myogénique
[94] et il semblerait que certains miRNA soient impliqués dans plusieurs myopathies [190],
[191]. Les miRNA musculaires les mieux caractérisés sont miR-1, miR-206 et miR-133 [93].
Il a été montré que miR-1 et miR-206 régulent positivement la différenciation musculaire
alors que miR-133 favorise la prolifération myoblastique [192], [193]. miR181 aide la
différenciation en bloquant HoxA11, inhibiteur de MyoD1 [194]. En utilisant des techniques
de perte et gain de fonction chez le poulet et la souris, il a été montré que l’expression
ectopique de Myf5, MyoD1, Myogénine, MRF4 dans le tube neural de poulet en
développement induit l’expression de miR spécifiques du muscle (miR-1 et miR-206), alors
que la perte de Myf5 est responsable de la perte d’expression de ces miRNAs. De manière
surprenante, la perte de MyoD1 n’influence pas l’expression des miRNAs [195]. Toutes ces
observations soulignent les inter-régulations complexes entre facteurs intrinsèques et miRNA
qui sont schématisées dans la figure II 4 suivante.
24

MyoD1, Myogénine
HoxA11
miR-181
Myf5
?
miR (lesquels?)
miR-1
miR-206
miR-133
Différenciation
myogénique
Prolifération
myogénique
Figure II 4 : Représentation schématique de l’inter-régulation miRNA/Facteurs de
transcription myogénique. MyoD1 et Myogénine favorisent plutôt la différenciation des
progéniteurs via les miR201 et miR206 alors que Myf5 favorise la prolifération des
progéniteurs mais également leur différenciation. miR133 favorise la prolifération
myogénique et bloque la différenciation. miR181 favorise la différenciation en bloquant
HoxA11, inhibiteur de MyoD1.
B- Myogenèse striée squelettique post-natale : les cellules satellites
La myogenèse striée squelettique post-natale concerne à la fois la croissance physiologique du
tissu et la régénération myogénique post-traumatique. Pour des raisons de facilité
expérimentale, c’est ce dernier volet qui a été le plus étudié, mais les voies de régulation et les
populations cellulaires concernées sont très probablement similaires. Le muscle squelettique
est un tissu stable avec un faible taux de renouvellement des noyaux [196], [197]. Il est estimé
chez le rat que, en dehors d’un contexte de stress, seuls 1 à 2% des noyaux sont remplacés
chaque semaine [197] et chez l’homme, la durée de vie d’un myonucleus est de l’ordre de 15
ans [198]. Cependant, le muscle est également capable de régénération rapide et extensive en
réponse à une lésion sévère, que ce soit au décours d’un traumatisme ou d’un défaut génétique
inné. Dans des conditions physiologiques, la capacité de régénération du muscle adulte est
essentiellement assurée par une sous-population de progéniteurs musculaires particuliers, les
cellules satellites. localisées entre la membrane basale et le sarcolemme des fibres
musculaires matures [199], [200], [201]. Ces cellules représentent l’essentiel des progéniteurs
myogéniques post-nataux. Ce n’est que très récemment que d’autres progéniteurs musculaires
25

post-nataux ont été identifiés : les CS dérivant du muscle (MDSC). Ces cellules sont
difficilement identifiables en terme de phénotype [25], leur potentialité n’étant pas restreinte
au lignage musculaire [202], [203]. Elles seraient notamment aptes à s’orienter vers le lignage
endothélial [204]. Enfin, leur origine reste floue : médullaire osseuse [205], [206], musculaire
[207], [208] ou endothéliale. Toutes ces observations montrent que les MDSC sont une
population cellulaire hétérogène mais qui pourrait contribuer également à la régénération
musculaire [209].
1- Description des cellules satellites
a- Localisation et fonctions
Les cellules satellites ont été initialement identifiées en microscopie électronique, sur la base
de leur localisation anatomique et leur morphologie [199]. Ces cellules mononucléées sont
situées sous la membrane plasmatique de la fibre musculaire et chaque fibre musculaire est
associée à 2 à 7 cellules satellites [199]. Il a été démontré, qu’elles étaient aptes à se
différencier en cellules musculaires striées squelettiques in vitro et in vivo [210], [211], [212]
[213], [214], [215], [216], [217], [218], [37]. De plus, des expériences basées sur l’utilisation
de radio-isotopes ont montré que les cellules satellites participent au muscle en croissance et
qu’après plusieurs mitoses, la moitié des cellules filles des cellules satellites se différencient
en cellules matures terminales et que l’autre moitié continuent à se diviser, suggérant que ces
cellules sont aptes à s’auto-renouveler [213]. Cette capacité d’auto-renouvellement a été
depuis, mieux caractérisée [215], [217], [218]. Ainsi, la double aptitude différenciation/autorenouvellement
permet de qualifier les cellules satellites de cellules souches musculaires
adultes. Leur rôle physiologique principal est de se différencier en cellules myogéniques pour
permettre la croissance et la régénération musculaire post-natales [219], [220]. L’origine
somitique [221], [199], [101], [124] versus endothéliale [222] des cellules satellites reste
débattue.
b- Marqueurs
Ces cellules satellites peuvent être identifiées sur la base de marqueurs particuliers qui varient
selon leur état fonctionnel. Chez la souris, elles sont en majorité quiescentes, elles expriment
de faibles quantités de Myf5 et sont, pour la plupart, positives pour Pax7 [120] la M-
Cadhérine [223], [224] et le CD34 [225], [226]. Parmi ces marqueurs, Pax7 joue un rôle
26

crucial : son expression est requise pour la survie des cellules satellites post-natales [227],
[126]. Les cellules satellites expriment également la vascular cell adhesion molecule-1
(VCAM1) [228], c-Met [224], Syndecan 3 et 4 [229], [230], Foxk1 ou MNF [231], neural cell
adhesion molecule-1 ou CD56. Cependant, ce profil d’expression varie en fonction de l’état
activé ou quiescent des cellules satellites, pouvant rendre leur isolement sur la base de
marqueurs phénotypiques difficile. Chez l’homme, les marqueurs des cellules satellites sont
un peu différents : l’expression de CD34 par les cellules satellites humaines est controversée,
la M-cadhérine n’est pas spécifique et le marqueur le plus fiable chez l’homme est le CD56,
qui marque également une sous-population lymphocytaire qui pourrait coloniser le muscle en
régénération et rendre certaines observations confuses [232].
2- Implication des cellules satellites dans l’homeostasie musculaire
a- Quiescence
Dans des conditions physiologiques stables, la majorité des cellules satellites sont quiescentes,
n’expriment que très peu Myf5 et aucune autre MRF. L’identité myogénique est surtout
assurée par les gènes Pax : les cellules satellites de la plupart des groupes musculaires sont
Pax7+ et, au sein de certains groupes musculaires, elles sont Pax3+ [123], [103]. Certaines
structures chromatiniennes ou du cytosquelette pourraient également contribuer à maintenir
cette identité myogénique, ainsi que les interactions de la cellule satellite avec son
environnement (niche). La voie Notch joue aussi un rôle essentiel dans la régulation de la
phase de quiescence des cellules satellites [154].
b- Maintien du pool de cellules satellites
i- Différents modèles de division cellulaire
La balance auto-renouvellement/différenciation est cruciale pour le maintien des cellules
souches et l’homéostasie tissulaire. Un dysfonctionnement à ce stade peut provoquer une
diminution de l’auto-renouvellement avec une déplétion de la population de CS, alors qu’un
auto-renouvellement non contrôlé résulterait en une surproduction de CS avec un risque
tumorigène. En principe, un des mécanismes qui pourrait assurer cette balance est la division
cellulaire asymétrique qui donne naissance à deux cellules filles différentes : une cellule
destinée à l’auto-renouvellement et l’autre à la différenciation. Un autre mécanisme qui
pourrait maintenir l’homéostasie des cellules souches se ferait via un auto-renouvellement
stochastique dans lequel les deux cellules filles seraient destinées de manière aléatoire à la
27

différenciation ou à l’auto-renouvellement. Enfin, un troisième modèle pourrait exister : le
modèle stochastique modifié dans lequel certaines CS génèreraient exclusivement des cellules
filles destinées à l’auto-renouvellement et d’autres CS donneraient naissance uniquement à
des cellules destinées à la différenciation, ce qui permettrait le maintien d’un pool constant de
CS [233] [234].
ii- Division asymétrique
Plusieurs expériences ont mis en évidence un rôle critique de la division asymétrique pour
l’auto-renouvellement des cellules satellites in vitro et in vivo. Des expériences basées sur
l’utilisation du BrdU montrent que les brins d’ADN les plus vieux vont dans les cellules filles
destinées à l’auto-renouvellement alors que les brins d’ADN les plus jeunes vont dans les
cellules filles destinées à la différenciation [235]. Cette division asymétrique concerne une
sous-population de cellules satellites qui pourrait être à l’origine de l’homéostasie musculaire
[235]. D’autre part, pendant la prolifération des cellules satellites et le développement
musculaire, il a été observé une division asymétrique sur la base de l’expression de Numb : il
a été montré que les cellules filles héritant de Numb recevaient également le vieux brin
d’ADN, suggérant qu’elles étaient destinées à l’auto-renouvellement [236]. Enfin, il a été
montré qu’une cellule satellite Pax7+/Myf5- peut donner naissance de manière asymétrique à
une cellule fille Pax7+/Myf5- qui s’auto-renouvelle ainsi qu’à une cellule fille Pax7+/Myf5+
qui va se différencier in vivo [217]. Ces résultats suggèrent que dans le modèle de division
asymétrique, la population de cellules en auto-renouvellement Pax7+/Myf5- n’exprime jamais
Myf5, contrairement au modèle stochastique, au cours duquel Myf5 va d’abord être
surexprimé dans les cellules en prolifération, puis diminué dans les cellules en autorenouvellement
[217].
iii- Implication des autres modèles dans le maintien des cellules satellites
Même si le chapitre précédent décrit des résultats soutenant le modèle de division asymétrique
pour l’auto-renouvellement des cellules satellites, l’implication des autres modèles n’est pas
exclue. En effet, la dynamique d’expression de Pax7, MyoD1 et Myogénine dans les
myoblastes en prolifération ou en différenciation in vitro suggère un mécanisme stochastique
de retrait du cycle cellulaire contrôlant l’auto-renouvellement des cellules satellites [237],
[238] [239].
28

iv- Auto-renouvellement des cellules satellites dans des conditions de croissance ou de
stress
Il se peut que ces modèles symétrique et asymétrique de division cellulaire reflètent les
comportements des cellules satellites suivant les conditions physiologiques, de croissance, de
stress ou de lésions. Pendant la croissance musculaire et le maintien de la masse musculaire,
une grande quantité de noyaux est renouvelée. Le nombre de cellules satellites et leur capacité
de prolifération diminuent avec l’âge [240], avec une diminution drastique à partir de neuf ans
chez l’homme [241]. Dans des conditions stables, les cellules satellites ne sont pas mobilisées
et n’ont besoin ni de migrer, ni de participer à la régénération musculaire. Dans ce scénario, la
division asymétrique serait l’option ‘économique’, avec à chaque division une cellule fille
pour l’auto-renouvellement et une pour la différenciation. La sortie précoce du cycle cellulaire
de la cellule en auto-renouvellement prévient un raccourcissement des télomères et une
sénescence prématurée. Myf5 n’est pas exprimé dans les cellules en auto-renouvellement
alors qu’il l’est dans les cellules en différenciation [242], [243]. Dans des conditions de lésion
musculaire, la dégénérescence musculaire massive non seulement active les cellules satellites
du muscle lésé lui-même, mais recrute également des cellules satellites provenant de muscles
voisins intacts. Ceci provoque une expansion des cellules satellites des muscles sains ainsi
que, celle dans un moindre degré, d’autres progéniteurs à potentiel myogénique.
c- Cellules satellites et régénération musculaire striée squelettique
Les fibres musculaires lésées produisent des chémoattractants pour les monocytes et les
macrophages (la MP-derived chemokine, la monocyte chemoattractactant protein 1, HGF, la
fractaline qui inhibe la myostatine, le VEGF et les acteurs du système urokinase). Le blocage
de cette phase d'inflammation/infiltration empêche l’activation, la migration des cellules
satellites et donc la régénération musculaire [244], [245], [246], [247]. Des facteurs de
croissance sont également libérés. Ces derniers se fixent sur les protéines de la matrice extracellulaire
telles que les protéohéparane sulfates [248] impliquant ainsi les métalloprotéases
dans la réparation musculaire [249]. L’interaction des cellules satellites avec les cellules
endothéliales voisines est également impliquée dans la régénération, notamment via la
sécrétion de facteurs solubles par les cellules endothéliales tels que l’IGF1, le HGF, le bFGF,
le PDGF et le VEGF [250] qui permettent une activation encore plus efficace des cellules
satellites. Le signal permettant la transition quiescence-activation reste toutefois
incomplètement élucidé. Un signal intrinsèque potentiel est la production de sphingosine-1-
29

phosphate qui est requise pour l’entrée en cycle des cellules satellites et dont l’inhibition
bloque considérablement la régénération musculaire [251].
Au moment de l’activation des cellules satellites, Myf5 est surexprimé. Puis, lors de
l’expansion myoblastique, MyoD1 est exprimé. Au moment de l’initiation de la
différenciation, l’expression de Myf5 diminue puis s’éteint alors que celle de MyoD1 est
maintenue et celle de la Myogénine induite, permettant ainsi la formation des myotubes [234].
d- Conséquences morphologiques tissulaires de la régénération musculaire striée
squelettique
Dans les conditions de ‘stress’ décrites ci-dessus, les cellules satellites activées prolifèrent et
donnent naissance à des cellules contribuant à la régénération musculaire via des étapes de
différenciation/fusion cellulaires [213] [214] permettant la constitution de nouvelles fibres
[252], [253]. Histologiquement, la phase de régénération est caractérisée par la présence de
myofibres fines avec des noyaux centraux. Ces nouvelles myofibres sont basophiles et
expriment des isoformes développementales et embryonnaires de myosin heavy chain (MHC).
Une fois que la fusion des cellules myogéniques est terminée, les nouvelles myofibres
augmentent en taille et les noyaux migrent en périphérie de la fibre musculaire, ce retour à la
périphérie variant suivant l’espèce étudiée et pouvant nécessiter plusieurs mois (souris). Dans
les conditions normales, le muscle en régénération est identique au muscle non lésé en
croissance. Le muscle squelettique adulte a une capacité de régénération remarquable et une
grande quantité de myotubes est formée seulement quelques jours après la lésion musculaire.
e- Niche des cellules satellites
La niche est le microenvironnement local de la CS. Ses principales fonctions sont de
maintenir l’identité de la CS et d’en réguler les fonctions. La fibre musculaire elle-même est
un composant essentiel de la niche et est un régulateur des cellules satellites via des signaux
mécaniques, électriques et chimiques [254] [255] [256]. La membrane basale constituée
essentiellement de laminine, collagène et protéoglycanes et la microvascularisation ont une
fonction essentiellement nourricière des cellules satellites [250]. L’ensemble des acteurs de
cette niche intervient dans la régulation des cellules satellites dans leurs phases de quiescence,
activation ou prolifération. De manière surprenante, la division asymétrique diminue
rapidement avec le temps de culture in vitro [235], [236], suggérant que la niche
environnementale est essentielle pour la division asymétrique. Cette niche régule la division
30

asymétrique des cellules satellites via un mécanisme de polarité cellulaire, les interactions
inter-cellulaires et les interactions cellules/matrice extra-cellulaire. La distribution
asymétrique des récepteurs membranaires cellulaires, des molécules d’adhésion en réponse à
des signaux apico-basaux est la base de la polarité cellulaire qui influence la destinée des
cellules satellites et leurs cellules filles. Par exemple, la cellule fille (de la cellule satellite) qui
est en contact avec la membrane basale s’auto-renouvelle et la cellule fille à distance de cette
membrane basale va se différencier [217].
3- Régulation moléculaire de la prolifération et de la différenciation des cellules satellites
chez l’adulte
Le potentiel myogénique des cellules satellites repose essentiellement sur l’expression des
gènes Pax et MRF. L’activation et la répression séquentielles de Pax3/7 et des MRF sont
requises pour la progression des myoblastes squelettiques à travers les différentes phases de la
myogenèse. La figure II 5 récapitule les phases fonctionnelles des cellules satellites au cours
de la myogenèse adulte, avec les différents facteurs exprimés au cours des phases de
quiescence, d’auto-renouvellement, d’activation et de différenciation.
a- Facteurs Pax
Pax7 joue un rôle clé dans la quiescence [234], le maintien de l’auto-renouvellement et la
prolifération des cellules satellites [120] [257]. Il favorise leur survie en bloquant l’apoptose
[126] et sa dégradation est nécessaire pour une maturation optimale des myoblastes en
myofibres [258]. Cette dernière observation est remise en question par les résultats d’autres
travaux. En effet, des myoblastes sur-exprimant Pax7 ont des taux de MyoD1 et une
prolifération non altérés, voire augmentés [259] De plus, même si elle est retardée, la
différenciation persiste [226]. Pax7 aurait donc plutôt un rôle dans le maintien de la
prolifération des myoblastes et dans l’initiation, au ‘bon moment’, de la différenciation et
dans son bon déroulement [259]. MyoD1 régulerait négativement Pax7 [260].
Pax3 est également détecté dans une sous-population de cellules satellites quiescentes [103] et
également dans de nombreux myoblastes [126]. Pax3 pourrait être enfin impliqué dans la
prolifération des cellules satellites [261]. Cependant, Pax3 ne peut pas compenser l’action de
Pax7 notamment pour la survie des cellules satellites adultes, comme l’atteste le phénotype
des souris invalidées pour Pax7 qui perdent progressivement leurs cellules satellites, même en
présence de Pax3 [227]. Ainsi, contrairement à ce qui est observé pendant le développement
31

musculaire embryonnaire et fœtal, en post-natal seul Pax7 a une action sur la survie des
cellules satellites [121], [100]. En outre, la myogenèse post-natale peut emprunter deux
voies : la voie Pax3/Pax7 agissant sur MyoD1 et la voie Myf5 ne dépendant pas des facteurs
Pax [121], [100].
b- Facteurs MRF
MyoD1 est requis pour la différenciation des myoblastes squelettiques [262], [229] alors que
Myf5 régule leur prolifération et leur homéostasie [242], [243]. De manière surprenante, alors
que Myf5 et MyoD1 peuvent se compenser l’un l’autre pendant l’embryogenèse [111], ils ne
le peuvent plus efficacement chez l’adulte. La perte de Myf5 mène à une perte du pool de
myoblastes en prolifération et la perte de MyoD1 induit une augmentation des myoblastes en
cycle et une nette diminution de leur différenciation. Les facteurs Mrf4 et Myogénine ne sont
pas impliqués dans la régulation des cellules satellites [242] mais l’induction de myogénine
est nécessaire à la formation de myotubes et myofibres. En effet, les souris avec une
recombinaison conditionnelle post-natale de Myogénine présentent une masse musculaire
réduite, suggérant que l’absence de Myogénine empêche les myoblastes de contribuer à la
croissance ou la régénération post-natale [148].
Figure II 5 : Représentation de la myogenèse striée squelettique adulte (Kuang et Rudnicki
2008). Les cellules satellites quiescentes sont Pax7+ et certaines, Pax7+/Myf5+, sont aptes à
s'auto-renouveler. Après activation, suite à des stimuli provenant des myofibres voisines ou
de l'environnement, elles génèrent des myoblastes exprimant Pax3/Pax7, Myf5 et MyoD1.
Une fois la différenciation initiée, ces cellules myogéniques n'expriment plus Pax3, ni Pax7,
l'expression de Myf5 restant controversée. Les cellules Myogénine+ vont complètement
32

maturer et fusionner. Mrf4 joue ensuite un rôle dans l'hypertrophie des fibres nouvellement
générées.
Une définition exacte de la cellule satellite reste difficile ; cependant, sa localisation
anatomique unique semble rester le critère de référence pour les caractériser.
2- Thérapie cellulaire et réparation musculaire striée squelettique
Au cours de pathologies musculaires acquises, le pool de CS musculaires du patient peut ne
pas suffire à une bonne régénération. De plus, dans le domaine myologique, il n’existe pas de
traitement médicamenteux chimique efficace. C’est pourquoi, la thérapie cellulaire semble
une piste prometteuse. Ce type de thérapie consiste en l’injection de cellules dans le but de
prévenir, traiter ou atténuer une maladie. Il s’agit de réparer des tissus lésés grâce à de
nouvelles cellules qui vont les reconstruire. Ces dernières peuvent être des cellules
différenciées fonctionnelles, des cellules précurseurs ou des cellules souches.
La meilleure connaissance des progéniteurs musculaires permet d’envisager l’utilisation de
ces cellules dans le cadre de thérapie cellulaire. Comme on le verra ci-dessous, cette
démarche n’a pas été couronnée des succès attendus et a mené à l’utilisation de cellules non
myogéniques. Cependant, devant la faible efficacité de ce type de thérapie, certaines
recherches se sont orientées vers la reprogrammation forcée de cellules non myogéniques
avant greffe.
A- Utilisation de progéniteurs musculaires post nataux
Les différents progéniteurs post-nataux qui ont été testés sont les CS musculaires post-natales
(MDSC et cellules satellites) et les myoblastes dérivant des cellules satellites. La plupart des
travaux ont été réalisés chez la souris sauf en ce qui concerne les myoblastes pour lesquels des
essais cliniques ont été réalisés.
1- Transplantation de myoblastes dérivant de cellules satellites
Historiquement, les myoblastes ont été les premières cellules utilisées pour les expériences de
thérapies cellulaires des myodystrophies. Plusieurs travaux ont étudié le potentiel myogénique
33

de ces cellules [263], [264] [265], [266]. Lorsqu’elles sont injectées à des souris
myodystrophiques elles permettent la restauration de l’expression de la dystrophine chez ces
souris en fusionnant avec des myoblastes du donneur. Des expériences similaires ont été
effectuées également chez des primates non humains pour évaluer la capacité régénérative de
telles cellules. Les myoblastes de primates s’intègrent aux structures musculaires lorsqu’une
thérapeutique immunosuppressive est utilisée, et ce, de manière prolongée, jusqu’à un an
après greffe, mais aucune amélioration fonctionnelle n’est mise en évidence [267], [268],
[269], [270], [271]. Des essais cliniques de greffe de myoblastes ont été également menés
chez des patients souffrant de myopathies [272], [273], [274] et se sont avérés décevants
[275], [276], [277], [278], [279], [280], [281], [282]. Il faut souligner que les myoblastes ont
une capacité de migration très limitée, ce qui impose des injections répétées à différents sites
musculaires. Considérant que les patients souffrant de myopathies dégénératives ont à terme
des atteintes diaphragmatiques et cardiaques, l’injection locale de myoblastes à ces sites
semblent difficilement envisageable. De plus, cela nécessiterait des traitements
immunosuppresseurs prolongés s’il s’agit d’une allogreffe de myoblastes.
2- Transplantation de cellules souches musculaires post-natales
a- Les cellules satellites
Il est possible d’obtenir une population enrichie en cellules satellites de souris [218].
L’injection de ces cellules dans un muscle de souris dystrophique, a permis d’observer une
restauration significative de l’expression de la Dystrophine et une participation jusqu’à 17%
au pool de cellules satellites. Cependant, l’amplification de ces cellules reste difficile, ce qui
compromet l’obtention d’un greffon riche en cellules. De plus, elles ont un faible potentiel de
migration. Leur administration systémique n'est pas possible, ce qui justifie, si elles sont
utilisées à des fins thérapeutiques, de multiples sites d’injections. Enfin, leur culture ex vivo
réduit considérablement leur potentiel de régénération, probablement en rapport avec une
perte d’identité cellulaire [218]. Ces premiers résultats ont été améliorés par la greffe de
myofibres associées à ces cellules satellites, ce qui permet d’obtenir plus d’une centaine de
myofibres avec des milliers de noyaux [216], contrairement à la greffe de cellules satellites
isolées qui est beaucoup moins efficace. Ces cellules satellites associées à la myofibre sont
aptes à participer à plusieurs cycles de régénération et reconstituent également un pool de
cellules satellites quiescentes. Cependant, le potentiel migratoire de ce greffon reste faible et
ce type de greffon est peu utilisable en pratique clinique pour des raisons pratiques telles que
34

la difficulté d’isoler des fibres intègres chez l’homme ou la difficulté d’implantation. Ces
observations ne permettent pas non plus d’envisager cette alternative dans le cadre d’une
thérapie cellulaire optimale.
b- Les cellules MDSC
Les cellules MDSC, comme il a été énoncé plus haut, constituent une population cellulaire
hétérogène et mal définie tant sur le plan phénotypique, ontogénique que fonctionnel. Leur
potentiel de régénération musculaire a été testé chez la souris : après injection intramusculaire
ou dans la circulation, les MDSC contribuent à la régénération musculaire et
permettent l’expression de la Dystrophine avec une efficacité dix fois plus importante que
celle des myoblastes, mais sans amélioration phénotypique nette [283], [282], [208]. D’autre
part, chez l’homme, une étude récente étudie le potentiel myogénique de cellules souche
dérivant du muscle prélevées à partir de biopsies musculaires exprimant CD133+. Après
greffe intra-musculaire dans des muscles de souris immunodéprimées Rag2-/- et γc-/- ayant
préalablement eu une cryolésion, ces cellules humaines participent à la régénération
musculaire et au repeuplement du pool de cellules satellites de manière plus efficace que les
myoblastes dérivant des cellules satellites et se dispersent mieux dans le muscle injecté [209].
La sous-population de MDSC CD133+ qui exprime CD34 a des capacités de prolifération, de
fusion et de maintien du pool de cellules satellites quiescentes plus importantes que la souspopulation
CD34-. Les MDSC CD133+/CD34+ constituerait donc une population de cellules
souches alternative à fort potentiel myogénique [209]. Compte tenu de l’hétérogénéité du
marquage CD56, cette population de MDSC n’est probablement pas homogène. Son aptitude
à migrer dans le muscle après injection par voie systémique n’a pas encore été testée. Bien
que ces résultats soient encourageants, la méconnaissance de la nature exacte de ces cellules
remet en cause pour l’instant leur application clinique.
B- Utilisation de cellules non myogéniques
Les résultats rapportés avec l’utilisation des CS musculaires en thérapie cellulaire musculaire
strié squelettique n’étant pas satisfaisants, d’autres travaux ont utilisé de cellules non
musculaires à potentiel myogénique. A la différence des myoblastes cités plus haut, aucun
essai clinique n’a été réalisé avec des cellules non musculaires. La majorité des expériences a
été réalisée dans des modèles de souris myodystrophiques.
35

1- Transplantation de cellules Side-Population musculaires
La population cellulaire dite « Side Population » (SP) est définie par la capacité de ces
cellules à exclure le colorant Hoechst 33342 (via le transporteur ABC Bcrp1/ABCG2). Elle
est donc par nature hétérogène [20], [284]. Les cellules SP isolées à partir de la moelle
osseuse (bmSP) ou à partir du muscle strié squelettique (mSP), ne peuvent pas se différencier
en cellules musculaires matures in vitro, mais après transplantation intra-musculaire, elles
peuvent donner naissance à des myocytes et à des cellules satellites [20], [285], [286]. Des
études comparant le potentiel de régénération musculaire des mSP versus celui des bmSP
montrent que ces populations cellulaires sont similaires pour leur contribution à la réparation
musculaire [20]. Ces cellules SP ne contribuent pas à la régénération à long terme ; de plus, la
prise de greffe reste modeste [287], [288], après greffe par voie systémique. Les mSP ont
également été isolées chez l’homme [289]. Leur origine, leur position dans le continuum des
cellules à potentiel myogénique et leur rôle exact ne sont pas encore clairement précisés. Ces
cellules sont rares, participent peu à la régénération musculaire et ne sont donc pas encore
utilisables à des fins thérapeutiques. Cependant, concernant la précision d’un rôle plus
spécifique des cellules SP de muscle, des expériences réalisées chez la souris ont permis
d’éclaircir certains points. Des mSP particulières, CD31- et CD45-, aux propriétés
‘mésenchyme-like’ (aptitude à se différencier en cellules adipeuses, osseuses et musculaires),
permettent, après co-transplantation, l’expansion des myoblastes greffés ainsi que leur
migration via la régulation de certaines métalloprotéases telles que la matrix
metalloprotéinase-2 [290]. C’est pourquoi, même si l’utilisation seule des mSP semble
prématurée dans un cadre de thérapie cellulaire, elles peuvent représenter un atout lorsqu’elles
sont co-transplantées avec les cellules particulières aux propriétés myogéniques.
2- Transplantation de cellules de moelle osseuse
La transplantation de cellules souches de moelle osseuse ou CSH est réalisée pour repeupler
le compartiment médullaire et produire de nouvelles cellules hématopoïétiques. Dès les
années 1960, il a été identifié une population de cellules circulantes avec un potentiel
myogénique, présente dans la moelle osseuse. Dans le but d’éviter de multiples injections
intra-musculaires, Ferrari et al [19] ont injecté le greffon cellulaire via la circulation et ont
montré que les cellules gréffées pouvaient, à des taux très faibles, adopter une orientation
36

myogénique et participer à la régénération musculaire après lésion. En outre, la greffe de
cellules dérivant de la moelle osseuse a permis de restaurer l’expression de la Dystrophine à
long terme [20]. Cependant, d’un point de vue quantitatif cette restauration n’est pas
significative d’un point de vue thérapeutique puisque 0,5% des cellules en régénération sont
d’origine du donneur [10], [291]. La greffe de CSH de sang de cordon n’est pas non plus
efficace [11], [12].
3- Transplantation de cellules souches mésenchymateuses
Les CSM correspondent à des populations cellulaires très hétérogènes suivant leur origine
tissulaire et leur mode d’isolement. Les CSM dérivant de la moelle osseuse sont capables de
produire des ostéoblastes, des chondroblastes et des adipocytes et, pour certains auteurs, des
cellules musculaires striées squelettiques [292] [293]. Des travaux basés sur l’utilisation de
ces cellules montrent qu’elles peuvent participer à la régénération musculaire avec cependant
une efficacité modeste (environ 2%) [294]. On peut citer aussi les CSM issues des membranes
synoviales humaines qui, après injection intra-musculaire dans le jambier antérieur de souris
myodystrophiques, permettent la restauration de l’expression de la Dystrophine dans 50% des
fibres et contribuent au pool de cellules satellites en persistant jusqu’à 6 mois après greffe.
Les CSM de membrane synoviale humaine expriment spontanément Pax7, M-Cadhérine et
CD34, ce qui suggére une origine musculaire de ces cellules [295]. On peut aussi citer
l’utilisation de CSM de tissu adipeux brun qui participent à la régénération musculaire avec
une efficacité de 10 à 20% [296]. Ces différents travaux utilisant la greffe de CSM sont
encourageants et leur utilisation potentielle en clinique est envisageable du fait de leur
plasticité, bien que leur potentiel de migration reste faible, imposant de multiples sites
d’injection.
4- Transplantation de cellules souches associées aux vaisseaux
a- Les mésangioblastes
En 1999, De Angelis et al mettent en évidence une population de cellules souches résidant
dans l’aorte dorsale avec des marqueurs endothéliaux et myogéniques (De Angelis et al
1999). Les cellules myogéniques dérivant de l’aorte dorsale peuvent se différencier en
myoblastes primaires in vitro et, après transplantation dans le jambier antérieur, contribuer à
la régénération musculaire (De Angelis et al 1999). Les explants d’aorte dorsale permettent de
37

produire 50 fois plus de cellules satellites que les explants somitiques (De Angelis et al 1999).
Des travaux ultérieurs ont montré le potentiel multipotent de ces CS associées aux vaisseaux,
les définissant comme des mésangioblastes [297] [298]. Des travaux plus récents montrent
que Pax3 est impliqué dans l’orientation myogénique des mésangioblastes [299], [300].
D’autres études utilisant des souris invalidées pour l’α-sarcoglycane montrent qu’après
injection intra-artérielle, les mésangioblastes sont aptes à migrer à travers l’ensemble de la
vascularisation, permettant une amélioration morphologique et fonctionnelle du phénotype
des cellules musculaires dystrophiques [300], [301]. Cette contribution a été améliorée par le
pré-traitement des mésangioblastes avec le stromal-derived factor 1 (SDF1) et le tumor
necrosis factor (TNF), qui augmentent leur migration vers les sites musculaires [302]. La
combinaison TNF, SDF1 et l’expression de l’α4 intégrine permettent un taux d’incorporation
remarquable de 50% des mésangioblastes injectés par voie artérielle. Ces derniers sont
présents au niveau des muscles jusqu’à 4 mois après la greffe avec une expression de près de
60% d’α-sarcoglycane par rapport à une souris sauvage. Ce sont donc des cellules
prometteuses en termes de participation myogénique durable et d’absence de réaction
immunologique, et leur équivalent humain a été mis en évidence (Delavalle 2007).
b- Les progéniteurs CD133+
Chez l’adulte, la mise en évidence du marqueur CD133 présent sur les cellules
hématopoïétiques et endothéliales a permis d’isoler une population cellulaire à partir de sang
humain capable, après co-culture avec des cellules myogéniques ou exposition à des cellules
produisant des facteurs Wnt, d’adopter un destin rappelant celle des cellules satellites [303].
Ces cellules expriment également l’antigène CD44, le lymphocyte function-associated
antigen1 (LFA1), la P-sélectine, le very late antigen-4 (VLA4) et la L-sélectine. Ces travaux
ont rouvert le débat d’une population hématopoïétique à potentiel myogénique. L’expression
de la Dystrophine après leur injection intra-artérielle ou intra-musculaire reste limitée (0,3 à
10% de contribution). En outre, le marqueur CD133 est également exprimé par une souspopulation
de MDSC à potentiel myogénique démontré [209], rendant difficile la
compréhension de l’identité de ces progéniteurs.
c- Les péricytes
Les péricytes sont des cellules récemment identifiées (Delavalle et al 2007 et 2009). Elles
sont localisées sous la membrane basale des vaisseaux, dans le compartiment interstitiel. Ces
38

cellules régulent la contractilité des micro-vaisseaux et peuvent inhiber la prolifération des
cellules endothéliales [304]. Les péricytes peuvent se différencier en cellules musculaires
lisses, ostéoblastes et adipocytes, en fonction de conditions de culture particulières [305]
[306], ce qui les rend comparables aux CSM. D’autre part, la co-expression CD146, NG2 et
PDGF-R ainsi que l’absence des marqueurs endothéliaux CD144 (VE-Cadhérine), von
Willebrandt factor, CD34, CD31 et Ulex europaeus lectin ligand, des marqueurs
hématopoïétiques ou musculaires, permettent de les identifier plus précisément [307]. Ces
cellules périvasculaires isolables à partir de tissus musculaires et non musculaires, ont un
potentiel myogénique in vitro et acquièrent des marqueurs musculaires dans des conditions de
culture particulières. Elles pourraient donc être assimilées à une population de CSM [307].
Des expériences in vivo dans des souris scid-mdx (immunodéprimées et myopathes) montrent
que les péricytes sont capables de reconstituer l’expression de la Dystrophine après
administration systémique intra-artérielle ou par voie intramusculaire. Dans des expériences
de co-culture, ces péricytes se différencient en cellules musculaires différenciées sans
synthèse des MRF mais avec expression de protéines de maturation terminale comme les
myosin heavy chain, avec une efficacité de différenciation de 20 à 40%.
Les péricytes, qui sont des cellules possédant de multiples potentialités et pour lesquelles un
phénotype assez précis a été récemment décrit, sont aptes à participer de manière active à la
régénération musculaire et à migrer, ce qui les rend intéressantes. Cependant, leur localisation
n’est pas encore très claire ce qui rend difficile leur prélèvement.
5- Transplantation de cellules ES
De petites quantités de cellules musculaires squelettiques ont été obtenues à partir des cellules
ES de souris il y a 15 ans [308]. Depuis, des travaux ont visé à améliorer la production de
cellules musculaires à partir de cellules ES, notamment en faisant du ciblage génique [308],
[309]. Les ES ont été également utilisées pour étudier les différentes étapes de la myogenèse
squelettique [310], [311], [312], [313], [314]. Une étude a montré un bénéfice thérapeutique
potentiel des cellules myogéniques dérivant de CSM obtenues à partir de cellules ES
humaines [315]. L’obtention de cellules myogéniques à partir des CSM nécessite une étape de
co-culture avec d’autres cellules myogéniques, un milieu de culture conditionné par des
myoblastes ou l’adjonction de 5-Azacytidine. Ces travaux n’étudient pas la contribution de
ces cellules au pool de cellules satellites, ni leur potentiel myogénique in vivo. A ce jour, il
39

n’existe pas encore de méthode standardisée et reproductible permettant d’obtenir des
quantités suffisantes de cellules myogéniques fonctionnelles. De plus, se pose le problème
éthique représenté par l’utilisation de ces cellules en clinique humaine. Enfin, un risque
tumoral existe avec ces cellules notamment par la formation de tératomes.
Pour résumer ce paragraphe, la figure II 6 représente les diverses populations cellulaires qui
ont pu participer à la régénération musculaire.
Figure II 6 : Diversité des populations cellulaires participant à la régénération musculaire.
Abréviations: mSP (Muscle Side Population), MDSC (Muscle Derived Stem Cell), HSC
(Hematopoietic Stem Cell) (Price et al 2007).
Au total, dans une grande majorité de cas, la participation des cellules alternes à la
régénération musculaire reste modeste, en termes de prise de greffe à long terme et
d’amélioration fonctionnelle. La réorientation vers les lignages musculaires striés pourrait être
facilitée par une étape préalable d’expression forcée de facteurs clés intervenant dans ces
tissus, tels que les MRF ou les Pax, notamment en reprogrammant des cellules plus
plastiques, ayant un potentiel de survie et de migration meilleur, et capables d’être cultivées et
amplifiées ex vivo avant greffe.
40

C- Plasticité forcée dans le cadre de la myogenèse striée squelettique
L’expression des gènes Pax3, Myf5 et MyoD1 au cours de la myogenèse striée squelettique, a
encouragé de nombreuses équipes à tenter d’induire la conversion de cellules non musculaires
en cellules musculaires en leur faisant exprimer de manière ectopique l’un de ces gènes. La
majorité des expérimentations concerne MyoD1 et à un moindre degré Myf5 (dont les
principaux résultats sont rapportés plus loin). Ces expériences ont été réalisées pour identifier
le rôle déterminant de ces facteurs dans le développement musculaire strié squelettique, et ne
répondent pas forcément à toutes les questions posées dans le cadre d’une démarche de
thérapie cellulaire (voies d’injection du greffon, prise et survie du greffon, efficacité de
régénération à court et moyen terme, immunotolérance, tumorigénicité…). Les résultats
obtenus sont cependant encourageants et ouvrent la voie de la thérapie cellulaire par
reprogrammation forcée.
1- Cellules exprimant Pax3 de manière ectopique
Comme il a été décrit précédemment, le facteur Pax3 est exprimé dès le stade pré-somitique et
intervient très précocement dans la spécification musculaire striée squelettique ainsi que dans
la régulation de plusieurs populations de progéniteurs musculaires au cours de
l’embryogenèse. Son efficacité a été étudié dans la lignée murine mésenchymateuse MSCB9,
dans des cellules endothéliales murines et dans la lignée fibroblastique de souris 10T1/2
[316]. Il a été observé une différenciation myogénique uniquement dans la lignée
mésenchymateuse qui n’était, par ailleurs, plus apte à donner des cellules osseuses,
cartilagineuses et adipocytaires. Ces résultats soulignent que Pax3 n’est pas suffisamment
déterminant pour le muscle squelettique, puisque d’une part, les résultats positifs ont été
obtenus avec des cellules mésenchymateuses déjà connues pour leur plasticité et d’autre part,
la lignée de référence 10T1/2, moins plastique, n’est pas ‘sensible’ à son action, alors qu’elle
l’est avec MyoD1 ou Myf5.
2- Cellules exprimant MyoD1 ou Myf5 de manière ectopique
Comme décrit précédemment, les facteurs Myf5 et MyoD1, sont déterminants pour le
développement embryonnaire musculaire strié squelettique. En période post-natale, Myf5 et
41

MyoD1 interviennent dans la régulation des cellules satellites : Myf5 dans l’activation,
l’expansion et l’initiation de la différenciation de ces cellules, MyoD1 dans leur
différenciation seulement.
a- Cellules exprimant MyoD1 de manière ectopique
Dans la myogénèse strié squelettique, la plupart des expériences d’expression ectopique qui
ont été réalisées in vitro, ont utilisé MyoD1 dans des cellules primaires ou des lignées
cellulaires provenant de souris, de rat, de poulet ou d’homme ; elles sont rapportées dans le
tableau II 1 qui met en évidence le taux de conversion myogénique dans plusieurs systèmes
cellulaires pouvant varier, selon les travaux, de 5 à 60% des cellules [317], (Braun et al 1989),
[135], [318], [319]. La variabilité du taux de conversion peut être liée au type de cellule mais
également au niveau d’expression ectopique induit dans les cellules cibles. Il existe également
des cellules non permissives comme les lignées cellulaires NIH-3T3 transformées par les
oncogènes H-ras, src et fos, dans lesquelles aucune réorientation musculaire n’est constatée,
mais MyoD1 entraîne un blocage du cycle et de la croissance cellulaires ce qui peut nuire à la
prise et/ou le développement du greffon [320]. La transfection de la lignée TE85 (sarcome
ostéogénique) avec MyoD1 permet d’obtenir une conversion myogénique pour une partie des
cellules, améliorée après exposition à la 5-Azacytidine [321]. Par ailleurs, compte-tenu du fait
que les modèles expérimentaux in vivo sont peu nombreux [322], [69], [68], la fonctionnalité
des cellules reprogrammées n’a pas été testée de manière optimale. Néanmoins, deux études
visant à étudier l’apport thérapeutique de MyoD1 en utilisant des cellules fibroblastiques de
peau, de muscle et de moelle osseuse [69], ainsi que des cellules adipocytaires [68] montrent
des résultats encourageants. Cependant, MyoD1 entraine une sortie de cycle cellulaire rapide,
ce qui représente un obstacle pour l’obtention d’un greffon riche en cellules et durable après
transplantation. Un modèle a été récemment publié permettant d’outre-passer ce problème.
Des fibroblastes de peau de sujets atteints de myodystrophies ont été ‘immortalisés’ grâce au
transfert du gène codant pour la télomérase, ce qui leur confère une forte capacité de
prolifération. En un second temps, ces fibroblastes sont transduits avec une construction
lentivirale contenant une forme inductible de MyoD1 [323].
42

Types cellulaires testés Modèles Conversion myogénique Auteurs
10T1/2 In vitro OUI (30-50%) Tapscott et al, 1988
Braun et al, EMBO, 1989
MCA Cl15 In vitro OUI (30%) Tapscott et al, 1988
Braun et al, EMBO, 1989
BC3H1 In vitro OUI (25%) Brennan et al, The journal of
Fibroblastes de peau In vitro
In vitro
In vitro et in vivo (thérapie
cellulaire)
Fibroblastes de muscle In vitro et in vivo (thérapie
cellulaire)
Fibroblastes
osseuse
de moelle
In vitro et in vivo (thérapie
cellulaire)
Cell Biology, 1990
OUI (5-60%) Weintraub et al, PNAS, 1989
Choi et al, PNAS, 1990
Lattanzi et al, J Clin Invest,
1998
OUI (20-40%) Lattanzi et al, J Clin Invest,
1998
OUI (5%) Lattanzi et al, J Clin Invest,
1998
Chondroblastes In vitro OUI (5-30%) Choi et al, PNAS, 1990
Cellules musculaires lisses In vitro OUI (5-30%) Choi et al, PNAS, 1990
Lignée adipocytaire In vitro OUI (30%) Weintraub et al, PNAS, 1989
Adipocytes matures In vitro et in vivo (thérapie
cellulaire)
Cellules épithéliales
pigmentaires rétiniennes
OUI (50%) Kocaefe et al, Exp Cell
Research, 2005
In vitro OUI (1-5%) Choi et al, PNAS, 1990
Lignée hépatique In vitro OUI (?) Weintraub et al, PNAS, 1989
Lignée kératinocytaire
HaCat
Lignée mélanocytaire
(melanoma)
Lignée neurale
(neuroblastome)
In vitro OUI modérément en
presence de 5AZA
Boukamp et al, The Journal
of Cell Biology, 1992
In vitro OUI (?) Weintraub et al, PNAS, 1989
In vitro OUI (?) Weintraub et al, PNAS, 1989
Crête neurale de poulet In vivo OUI (?) Delfini et al, Development,
2003
Tableau II 1 : Les modèles de transdifférenciation forcée basée sur l’expression ectopique
de MyoD1
43

- Cellules exprimant Myf5 de manière ectopique
Myf5 a aussi été décrit pour son potentiel de conversion de cellules non musculaires en
cellules myogéniques. Ce facteur agit en amont de MyoD1 et favorise la prolifération des
progéniteurs musculaires, alors que MyoD1 bloque le cycle cellulaire. En outre, Myf5 joue un
rôle différent de celui de MyoD1 dans l’homéostasie musculaire post-natale via son action sur
les cellules satellites, et on peut donc s’attendre à une efficacité de conversion myogénique
peut-être meilleure que celle provoquée par MyoD1. Cependant, les travaux concernant
l’utilisation de Myf5 sont peu nombreux et intéressent uniquement des cellules de lignées
fibroblastiques (expérimentation in vitro) et un modèle d’embryon de poulet (expérimentation
in vivo) et transgénique avec myf bovin. En ce qui concerne les lignées fibroblastiques 10T1/2
et MCA Cl15, une conversion myogénique est observée dans plus de 50% des cellules avec
des changements morphologiques de type myotubes fusionnés [134]. Dans le cas de
l’embryon de poulet, l’expression forcée de Myf5 dans des cellules de crêtes neurales, conduit
à une extinction du programme transcriptionnel neural et à l’expression de marqueurs
musculaires tardifs tels que la myosine heavy chain [322]. Enfin, dans des souris
transgéniques pour Myf5 bovin, on observe une activation des gènes de détermination
musculaire squelettique endogènes dans le cœur et le cerveau des animaux transgéniques
[324]. Une myogenèse squelettique incomplète au niveau cardiaque résulte alors en une
cardiomégalie avec des régions de cardiomyopathie. Au niveau cérébral, la myogenèse est
plus avancée avec observation de zones peuplées de myotubes multinucléés striés exprimant
l’actine, la desmine et la myosine. Ces expériences soulignent le rôle de Myf5 dans la
détermination musculaire au cours de l’embryogenèse et appuient le fait que Myf5 est un gène
maître de la myogenèse striée squelettique. Enfin, la nécessité d’avoir un greffon riche en
cellules en vue de thérapie cellulaire, renforce le projet de l’utilisation de Myf5 qui favorise
l’expansion du pool des myoblastes alors que MyoD1 induit une sortie de cycle cellulaire et la
différenciation. Les propriétés de ce facteur sont donc plus particulièrement décrites dans ce
dernier paragraphe.
44

D- Propriétés de Myf5
1-Propriétés moléculaires de Myf5
a- Appartenance à la famille MRF
Le facteur de transcription Myf5 appartient à la famille des Myogenic Regulator Factor ou
MRF. Ce sont des facteurs de transcription de type bHLH (basic Helix Loop Helix) de classe
II (tissu-spécifiques) capables de s’homodimériser ou de s’hétérodimériser avec des facteurs
de transcription bHLH de classe I. Ces derniers incluent les protéines E HEB/HTF4, E3-
2/ITF-2 et E12/E47, et sont exprimés de manière ubiquitaire dans différents tissus au cours du
développement embryonnaire.
b- Description de la structure du facteur Myf5
Chez l’homme, le gène de Myf5 est situé sur le chromosome 12q21 et code pour une protéine
de 255 acides aminés. La figure II 7 représente schématiquement la structure du gène Myf5.
La région N-terminale basique est requise pour la fixation à l’ADN, alors que le domaine
HLH, en C-terminal de la protéine, permet la dimérisation avec d’autres bHLH. Tous les
dimères bHLH se fixent sur une séquence consensus de l’ADN, la E-box, comprenant la
séquence CANNTG, où chaque moitié du dimère reconnaît la séquence correspondante
(Blackwell 1990).
Transactivation domain
DNA biding
domain
bHLH domain
(dimerisation)
Figure II 7 : Représentation schématique de Myf5 humain
Transactivation domain
100 kb 140 kb
45

2- Rôle de Myf5 dans la myogenèse striée squelettique
a- Expression de Myf5
Chez la souris, Myf5 est le premier facteur MRF exprimé au jour embryonnaire E8. Les
protéines Myf5 sont d’abord observées dans la région dorso-médiale du somite à E8, puis
dans le myotome à E9 [137]. A E9,5, son expression est détectée dans le dermomyotome
ventral et dans les arcs branchiaux. Au fur et à mesure que les muscles des membres se
développent, l’expression de Myf5 augmente dans la zone centrale des masses prémusculaires
et non au niveau des progéniteurs en migration [325], [326]. Pendant la fusion
des myoblastes, son expression est maintenue dans toutes les masses musculaires
squelettiques puis diminue dans les phases tardives de gestation. En période post-natale,
Myf5 est détecté dans les cellules satellites lors de leur phase d’activation et de leur expansion
[327].
b- Rôle dans la détermination musculaire striée squelettique
L’expression de Myf5 au niveau de la région dorso-proximale du somite est à l’origine des
futurs muscles du tronc et muscles intercostaux (muscles épaxiaux) [112]. Myf5 est également
impliqué dans la formation du bourgeon des muscles des membres ou muscles hypoaxiaux
[112]). L’expression de Myf5 permet également l’émergence des myoblastes puisque la
double invalidation de Myf5 et MyoD1 est responsable de leur absence [111]. L’invalidation
de Myf5 permet en revanche le développement musculaire, mais avec des anomalies au
niveau du tronc [111], [139]. Ces observations montrent l’existence d’au moins deux types de
populations de myoblastes [328], [329] : des myoblastes Myf5-dépendants et des myoblastes
Myf5-indépendants (MyoD1 positifs).
c- Implication de Myf5 dans le système nerveux central
De manière surprenante, certaines cellules neuronales localisées dans des régions particulières
du système nerveux central des souris, expriment les transcrits Myf5 au cours du
développement embryonnaire et de la vie adulte [129] : la région mésencéphalique ventrale
dès le jour embryonnaire E8,5, puis à la région prosencéphalique à E10. Une séquence
enhancer spécifique existe en effet à 2,9 kb du promoteur, entre 56,6 et 53,7 kb en amont de
Myf5, et cible spécifiquement l’expression de Myf5 dans le système nerveux central [330].
46

Cette séquence régulatrice agit en synergie avec une séquence plus proximale à 422 bp – 0,7
kb [326] pour l’expression de Myf5 dans le tube neural. Les transcrits de Myf5 sont
correctement épissés dans le cerveau mais la protéine Myf5 n’est pas détectable in vivo dans
les neurones [331]. Des travaux récents ont montré une régulation dépendante des miRNA
permettant la non traduction de Myf5 au niveau du système nerveux central, prévenant ainsi le
développement de structures myogéniques au sein de tissus neuronaux [330]. L’implication
exacte de ces observations n’est pas claire : la non détection de la protéine Myf5 est-elle liée à
un problème technique ? les transcrits de Myf5 jouent-ils un rôle régulateur dans des
processus développementaux en particulier neuraux ? les transcrits sont-ils un ‘reliquat’ lié à
l’évolution ? Myf5 a-t-il d’autres rôles que myogéniques ?
d- Rôle dans la régulation des cellules satellites en post-natal
Kassar-Duchossoy et al [110] ont permis de mieux déterminer le rôle de Myf5, notamment en
période post-natale. Les souris invalidées pour Myf5 sont viables et présentent une myopathie
progressive ainsi que des troubles au niveau de la régénération musculaire avec hypertrophie
des fibres restantes, accumulation des adipocytes, fibrose, avec un aspect de myopathie
‘chronique’ progressive. Ces défauts de réparation musculaire sont exacerbés dans un
contexte de stress [242]. Des doubles mutants conditionnels Myf5/Dystrophine ont un
phénotype plus sévère que les simples mutants. Ces observations montrent que Myf5
intervient également dans la régulation des cellules satellites et l’homéostasie musculaire en
post-natal [242]. Certains travaux soutiennent que la population de cellules satellites
Pax7+/Myf5-positive représente des progéniteurs déjà engagés alors que la population
Pax7+/Myf5-négative représente la population souche quiescente des cellules satellites aptes à
s’auto-renouveler et à s’engager [217]. Dans les situations de réparation musculaire striée
squelettique, Myf5 intervient dans l’activation et la prolifération [243] des cellules satellites
en favorisant leur progression en G2, contrairement à MyoD1 qui induit un blocage du cycle
cellulaire [332]. Myf5 induit également l’initiation de la différenciation de ces cellules [121].
Les cellules satellites de souris en prolifération expriment Myf5, mais son expression disparaît
lors des étapes tardives de la différenciation au moment de la fusion en myotubes [333],
[334].
47

3- Voies de régulation
a- Régulateurs environnementaux
Les signaux des tissus environnants régulent l’expression des bHLH, dont Myf5, au niveau
somitique : les signaux de Shh provenant de la notochorde [335], Wnt provenant du tube
neural et BMP4 provenant du mésoderme latéral adjacent [168], [107], [336]. La voie Shh
active Myf5 également au niveau de la détermination musculaire épaxiale [107]. L’ensemble
de ces signaux régulateurs ont pour but de restreindre la myogenèse aux futures régions
musculaires du dermomyotome [160]. La manière dont ces signaux sont intégrés pour la
régulation de Myf5 n’est pas complètement éclaircie.
b- Eléments cis-régulateurs
La régulation intrinsèque de Myf5 a été étudiée via l’utilisation de multiples modèles de
souris transgéniques [337], [338], [339], [339] [326] [340] [341], [342] [239]. Une multitude
de séquences enhancer régule l’activation de Myf5 à différents temps et dans différentes
régions anatomiques (Carvajal et al 2008). Une carte de ces sites enhancers est proposée sur
la figure II 8 ci-dessous.
-140 Kb
SOMITE
ARCS BRANCHIAUX
-59 Kb -31 Kb
FUSEAU MUSCULAIRE
ARCS BRANCHIAUX
CELLULES SATELLITES CELLULES SATELLITES
CERVEAU
DERMOMYOTOME
MUSCLE DU
MEMBRE INFERIEUR
-8,8 Kb
0 Kb
Mrf4 Myf5
ARCS BRANCHIAUX
5,4 Kb
ARCS BRANCHIAUX
SOMITE VENTRAL
Figure II 8 : Cartographie des séquences cis-régulatrices de Myf5 avec les fonctions
correspondantes (selon Carvajal et al 2008)
STRUCTURES EPAXIALES
SYSTEME NERVEUX
48

De nombreux enhancers existent sur plusieurs centaines de kilobases dans le locus Myf5, et
chacun d’entre eux régule Myf5 à des stades particuliers du développement [342], [339]. Un
enhancer nécessaire pour l’expression épaxiale est régulé par les facteurs Gli et est plus
particulièrement sensible à la voie Shh [156], [335] et à la voie canonique de Wnt [164]. Il
existe également un enhancer de 145 pdb, localisé à -57,5 kb du gène Myf5, régulé par Pax 3
et par les protéines Six1/Six4 [343]. D’autres types de séquences régulatrices moins
classiques sont impliquées dans la régulation de Myf5 : les ‘transcription balancing
sequences’ (TRABS) qui agissent comme des promoteurs cryptiques et qui sont des
séquences intergéniques avec lesquelles les enhancers interagiraient également, en plus de
leur interaction classique avec le promoteur principal [344].
c- Eléments trans-régulateurs
i- Antagonistes de Myf5
Des protéines inhibitrices ont été identifiées comme fixant de façon compétitive les protéines
E ou les MRF ou en agissant au niveau des séquences enhancer/promoteurs des gènes des
MRF. La plupart de ces inhibiteurs sont eux-même des bHLH. On peut citer les facteurs Id,
Twist, MyoR et Mist-1.
ii- Activateurs de l’expression de Myf5
Dans des expériences de culture de cellules satellites, en utilisant des techniques d’analyse
basées sur les siRNA, les précipitations de chromatine et la cytométrie de flux, il a été montré
que Pax7 active directement Myf5, en recrutant un complexe d’histone méthyl-transférase
(McKinell 2008). Le facteur Pax3 régule également Myf5 via la fixation à un site se situant à
proximité de la région enhancer -58/-56kb [112] notamment pour la myogenèse au niveau du
somite hypaxial [112] et au niveau des muscles des membres [345]. Les facteurs Pax activent
les MRF de manière indirecte également, notamment via la voie FGFR4/Sprouty [346].
49

d- Modulation épigénétique et post-traductionnelle
i- Remodeleurs chromatiniens
Les complexes remodeleurs chromatiniens SWI/SNF [347] ou NCoR/SMRT [348] agissent
avec Myf5 pour l’activation de ses gènes cibles. Par ailleurs, la méthyl-transférase Ash2L-
MLL2 s’associe avec Pax7 pour réguler l’expression de Myf5, soulignant un niveau de
régulation particulier de Pax7 sur Myf5 [349].
ii- Régulation par les miRNA
La présence de transcrits Myf5 au niveau du système nerveux central chez la souris, implique
l’existence de systèmes de régulation négative pour prévenir la myogenèse dans les régions
neuronales. Les mécanismes répressifs, en particulier post-transcriptionnels, sont donc vitaux.
Des miRNA sont détectés au niveau du système nerveux central chez la souris et le poissonzèbre
[350], [351]. Chez le poisson-zèbre, ces miRNA sont également détectés à la périphérie
des somites, mais pas dans la région centrale du myotome [351]. Il a été montré que le miR-
31 est détectable dans plusieurs sites embryonnaires. miR-31 est présent dans le cerveau et à
la périphérie du dermomyotome, régions où Myf5 n’est pas exprimé [352]. En revanche, miR-
31 n’est pas détecté dans le myotome qui requiert absolument l’expression de Myf5 pour son
développement [330]. Cette observation montre que Myf5 est régulé par des miRNA,
notamment pour le blocage de son expression au niveau du système nerveux central.
iii- Phosphorylation et dégradation
Myf5 est également régulé au niveau protéique. Il peut en effet être dégradé par des
phénomènes de phosphorylations et ubiquitination, comme décrit dans un modèle de Xénope
[353].
4- Gènes cibles de Myf5
Les gènes cibles de Myf5 ont peu été étudiés. Cependant, plusieurs gènes cibles ont été
suggérés : desmine et probablement Mef2c [111], [354], FGF4 et FGF6 [355], la myosin
heavy chain [111], [356], les protéines contractiles dans leur ensemble [357], [356]. Par
ailleurs, Myf5 peut réguler et/ou activer MyoD1 en post-natal, probablement de concert avec
les facteurs Pax3/Pax7 [100]. D’autres facteurs interagissent avec Myf5 ou le régulent pour
50

activer certains de ces gènes cibles : les facteurs Six1 et Six4 [358], [359], [360], SRF [361],
Mef2 [362], [363], Pbx-Meis [364], les protéines musculaires LIM (MLP) qui interagissent
avec les MRFs.
5- Pathologies humaines impliquant Myf5
Au cours des rhabdomyosarcomes, il a été constaté que les MRF sont globalement plus
activés mais ils ne paraissent pas initiateurs dans l’émergence de la tumeur [365]. De plus, il
semblerait que le mécanisme oncogénique soit plutôt lié à une compétition de dimères de
bHLH menant à un blocage de l’activité des MRF avec pour conséquence un blocage de la
différenciation de ces cellules : en effet, l’expression forcée de l’hétérodimère MyoD1/E12
restaure efficacement la différenciation des cellules du rhabdomyosarcome [366]. Dans le
sarcome des tissus mous, l’expression de Myf5 a été mise en évidence mais sans qu’un réel
rôle tumoral n’ait été montré (Stockwin et al 2009).
51

III- MUSCLE STRIE CARDIAQUE
1- Cardiomyogenèse et réparation naturelle
Dans ce chapitre, nous allons tout d’abord faire une description cellulaire de la
cardiomyogenèse en insistant sur les différentes sources de précurseurs cardiaques, les
champs cardiaques et le continuum complexe des précurseurs cardiaques eux-mêmes. Nous
allons ensuite essayer de comprendre les différents niveaux de régulation de la
cardiomyogenèse : l’environnement, les miRNAs et les facteurs de transcription. Puis, nous
discuterons de la régénération cardiaque, avec les différents concepts, controverses que cela
implique et les travaux de régénération cardiaque basée sur l’utilisation de cellules alternes
non cardiaques qui en découlent. Enfin, ces différentes informations nous permettront de faire
ressortir les facteurs intrinsèques particuliers, essentiels dans le développement cardiaque, que
nous présenterons plus en détail, à savoir, Nkx2.5, Gata4 et Tbx5, appuyant ainsi notre choix
pour leur utilisation dans la reprogrammation des cellules non musculaires vers le lignage
cardiaque.
A- Cardiomyogenèse
1- Différentes sources de précurseurs cardiaques
Le cœur est composé de divers types de cellules, musculaires et non musculaires : les
myocytes cardiaques atriaux et ventriculaires, les cellules du système de conduction, les
cellules musculaires lisses et endothéliales des artères et veines coronaires, les cellules
endocardiques, les composants valvulaires et ceux du tissu conjonctif. Pendant le
développement cardiaque, diverses vagues de précurseurs cardiaques sont observées, aux
définitions fonctionnelles, phénotypiques et anatomiques variées.
En effet, il existe au moins trois grandes sources de précurseurs cardiaques : le mésoderme
cardiaque, les crêtes neurales cardiaques et l’organe pro-épicardique. Les progéniteurs
cardiaques murins du mésoderme cardiaque sont initialement identifiés dans la région précéphalique
à E7,5 puis ils migrent vers la ligne médiane pour former le tube cardiaque linéaire
puis les 4 chambres cardiaques. Après l’incurvation du tube cardiaque à E8,5, les progéniteurs
des crêtes neurales cardiaques migrent pour former le tube neural dorsal qui englobe la crosse
52

aortique et contribuent aux cellules musculaires lisses vasculaires de l’outflow tract à E10,5.
Elles contribuent également aux composants essentiels du système nerveux autonome
cardiaque [367] [368]. Au même moment, les précurseurs proépicardiques joignent le cœur en
développement, et génèrent le manteau épicardique et contribuent aux vaisseaux coronaires
[369], [370]. Le proépicarde est à l’origine de la majorité des cellules mésenchymateuses du
cœur.
La figure III 1 résume chez la souris, ces différentes étapes de la cardiogenèse en soulignant la
contribution de chaque source de progéniteurs cardiaques (schéma A), ainsi que les différents
lignages cellulaires provenant de ces trois sources de précurseurs cardiaques (schéma B).
Figure III 1 : Origine et relation des différentes populations cellulaires cardiaques
(Laugwitz et al (2008)). Les abréviations : HF = région pré-céphalique, ML = ligne médiane, OFT =
outflow tract, PT = tronc pulmonaire, Ao = aorte, Cr = cranial, Ca = caudal, RV = ventricule droit, LV =
ventricule gauche, IVS = septum interventriculaire, LA = oreillette gauche, RA = oreillette droite, PhA = arcs
pharyngés, PLA = oreillette gauche primitive, PRA = oreillette droite primitive. Les couleurs : la couleur rouge
correspond aux cellules provenant du mésoderme, la couleur violette à celles provenant des crêtes neurales
cardiaques et la couleur jaune à celles provenant de l’épicarde.
53

Différentes ‘couches cellulaires’ composent le cœur : l’endocarde, le myocarde et le
péricarde. Le myocarde est composé principalement de cellules musculaires spécialisées
appelées les myocytes cardiaques ou cardiomyocytes. Les cardiomyocytes sont des cellules
mononucléées qui ont une membrane cellulaire ou sarcolemme et des tubules T impliqués
dans la conduction, un réticulum endoplasmique, réservoir calcique nécessaire pour la
contraction, des éléments contractiles, des mitochondries. L’unité fonctionnelle contractile du
cœur est le sarcomère composé de filaments d’actine et de myosine. Les cardiomyocytes
comptent environ pour 25% des noyaux, mais du fait de leur taille, concernent 90% du
volume myocardique. Le reste des cellules incluent les cellules endothéliales et
fibroblastiques. Chaque cardiomyocyte interagit avec son voisin via des jonctions
intercellulaires spéciales dont les gap junctions qui, lorsqu’ils sont absents ou lésés, sont
responsables d’arrythmies cardiaques. Il existe des cardiomyocytes spécialisés dans la
conduction (le nœud sino-atrial, le nœud auriculo-ventriculaire, le faisceau de His et les
branches ventriculaires droites et gauches). L’ensemble de ces cardiomyocytes, qu’ils soient
ventriculaires ou auriculaires, dérive du mésoderme et c’est sur cette différenciation que nous
allons nous concentrer.
2- Les différents champs cardiaques
Des études récentes ont montré que le mésoderme cardiogénique est composé de deux
populations ou deux champs de précurseurs cardiaques qui contribuent aux différentes régions
cardiaques mais qui ont une origine commune [371] [372].
La population cardiaque la plus précoce est le champ cardiaque primitif. Il apparaît pendant la
phase de la gastrulation en réponse à des signaux inducteurs de l’endoderme adjacent et
provient du mésoderme splanchnique antérieur. Ces précurseurs se mettent en clusters pour
former un croissant cardiaque qui migrent et fusionnent en un tube cardiaque linéaire,
constitué d’une couche interne endocardique et d’une couche externe myocardique. Ce tube
mature ensuite pour générer les oreillettes et le ventricule gauche [373] [374] [375].
La seconde région cardiaque, ou champ cardiaque secondaire, se situe à proximité du tube
cardiaque et dérive du mésoderme pharyngé proche du croissant cardiaque. Les cellules du
champ cardiaque secondaire donnent naissance aux gros vaisseaux, au ventricule droit et au
tissu atrial [376] [377]. La figure III 2 montre la contribution cardiaque de chaque champ
(région cardiaque verte = champ cardiaque secondaire, région cardiaque rouge = champ
cardiaque primitif).
54

Figure III 2: Contribution cardiaque des deux champs cardiaques (Laugwitz et al 2008)
3- Hiérarchie complexe des progéniteurs cardiaques
Au cours du développement, l’apparition des progéniteurs cardiaques est déterminée par
l’expression de facteurs particuliers. Plusieurs auteurs ont décrit différentes populations de
progéniteurs dont une synthèse est présentée ici. L’identification précoce de ces progéniteurs
est basée sur l’expression de marqueurs spécifiques.
L’expression du facteur T-box Brachyury (Bry) [378] détermine les précurseurs
mésodermiques très précoces, avant la transition vers le mésoderme pré-cardiaque. Lors de
cette transition, apparaissent les précurseurs pré-cardiaques exprimant Mesp1 [379] [380].
Suit l’étape de migration [380] pendant laquelle ces précurseurs qui n’ont pas encore adopté
irréversiblement le lignage cardiaque prolifèrent massivement pour former le croissant
cardiaque [381]. Le facteur Bry est à l’origine des hémangioblastes (Bry+/Flk1+) [382] et
d’une population exprimant Mesp1 capable de migrer et proliférer pour former le croissant
cardiaque. Puis, au niveau du mésoderme cardiaque, des progéniteurs
(Bry+/Mesp1+)/Islet1+/Flk1+ génèrent des progéniteurs Islet1+/Nkx2.5+ à l’origine du
lignage cardio-vasculaire, et des progéniteurs Islet1+/Flk1+ à l’origine des cellules
endothéliales et vasculaires musculaires lisses [383]. Les progéniteurs Islet1+/Nkx2.5 vont
donner ensuite naissance aux progéniteurs plus matures Nkx2.5/Gata4/Mef2c qui vont générer
55

d’une part, des cardiomyocytes précoces Nkx2.5+/MLC2a/v+, permettant l’apparition des
cardiomyocytes atriaux (sarcolipine+/MLC2a+, cTnT+) et ventriculaires (MLC2v+, cTnT+),
et d’autre part, aux cellules vasculaires musculaires lisses et aux cellules du système de
conduction [384]. Une population plus tardive de progéniteurs bi-potents ckit+/Nkx2.5+
permet la génération des cardiomyocytes et des cellules vasculaires musculaires lisses [385].
Les progéniteurs exprimant Isl1 et Flk1 contribuent à une part des cellules vasculaires
musculaires lisses et aux cellules endothéliales dont une proportion provient également des
hémangioblastes [386] [387], [382]. Des analyses des transcriptomes des différentes
populations de progéniteurs mettent en évidence des variations d’expression de facteurs clés
tels que Tal1, Prrx1, Prrx2, Msx2, Nkx2.5 (…), diverses voies de signalisation (BMP,
calpaïne, protéine G…) soulignant la complexité hiérarchique et relationnelle des populations
cellulaires cardiaques. Un schéma de Laugwitz et al (2008) (figure III 3 ci-dessous page 62)
représente la pyramide de ces populations de progéniteurs/précurseurs cardiaques [388].
4-Régulation du développement cardiaque
La détermination, maturation et différenciation de l’ensemble des lignages cellulaires
contribuant à la cardiogenèse sont sous la régulation de multiples facteurs, qu’ils soient
environnementaux provenant des structures embryonnaires avoisinant l’aire cardiaque, ou
qu’ils soient intrinsèques comme les facteurs de transcription ou les miRNA.
56

Mesp1+/
Gata4+/Mef2+
Figure III 3 : Hiérachie des progéniteurs cardiaques au cours de la cardiogenèse (selon
Laugwitz et al (2008)) Abrévaitions : Bry = brachyury, MLC2a = atrial myosin light chain 2 = Myl7,
MLCV2 = ventricular myosin light chain 2 = Myl2, cTnT = cardiac troponon T = Tnnt2, Hcn4 =
hyperpolarization-activated cyclic nucleotid-gated K+4, sm-actin = smooth muscle actin, SM-MHC = smooth
muscle myosin heavy chain, VE-Cadh = VE-Cadhérine.
a- Facteurs environnementaux
Au cours du développement cardiaque embryonnaire, les cellules précurseurs sont soumises à
l’influence de facteurs paracrines dont les plus étudiés sont les BMPs, les acteurs de la voie
Notch et ceux de la voie Wnt.
i- BMP
Les BMP jouent un rôle critique dans le développement cardiaque [389] [390] au moment de
la formation des chambres cardiaques [391] [392] [393] [394] [395] [396] mais également
dans la régulation du développement septo-valvulaire et la formation de l’endocarde [397]
[398], [399] [400]. Le rôle des BMP a également été étudié dans la maturation des cellules
souches cardiaques. L’auto-renouvellement des cellules à l’état pluripotent, exprimant
57

POU5F1 (Oct4), Sox2 et Nanog [401] est régulé par les BMP [402]. En effet, les BMP
stimulent l’expression d’inhibiteurs de différenciation tels que le facteur Id [403], qui à leur
tour réduisent les niveaux de certaines MAPKinases (MAPK1 et MAPK14), elles-mêmes
impliquées dans le maintien des cellules dans un état indifférencié. Différents niveaux
d’expression de BMP sont requis pour la maturation optimale des cellules cardiogéniques,
avec une diminution transitoire de BMP aux phases précoces de maturation via l’action de
Noggin (inhibiteur de BMP) [404] [405]. Après cette inhibition transitoire, les BMP stimulent
l’expression de Nkx2.5 et Gata4, favorisant ainsi la transition pré-cardioblastes/cardioblastes
[406]. La dernière étape de maturation des cardioblastes en cardiomyocytes requiert à
nouveau la signalisation BMP via l’activation SMAD/MAP3K71 qui active l’expression de
gènes codant pour des protéines sarcomériques telles que la MYH7 ou βMYHC [406]. La
figure III 4 ci-dessous récapitule les différentes étapes de la maturation des cellules souches
cardiaques en cardiomyocytes en soulignant le rôle essentiel des BMP.
Figure III 4 : Rôle des BMP dans la différenciation des cellules souches embryonnaires en
cardiomyocytes (van Wijk et al 2007)
ii- La voie NOTCH
La voie Notch contrôle des processus développementaux embryonnaires tels que le choix
d’orientation, la prolifération et la différenciation [407]. Concernant le développement
cardiaque, les principaux agents Notch sont Notch1 et Notch2 [408] [409]. De nombreux
modèles de perte ou de gain de fonctions de différents acteurs de la voie Notch montrent son
rôle essentiel dans le développement cardiaque. En effet, la voie Notch est impliquée dans de
nombreuses étapes de la cardiogenèse, notamment au cours du développement du myocarde,
de l’endocarde [410] [411], de l’outflow tract et du système de conduction [412]. Au cours de
58

la cardiogenèse, des mutations inactivant la voie Notch ont été impliquées dans plusieurs
malformations cardiaques [413] [414] [415]. Les différentes malformations comprennent les
valvulopathies, les dysplasies ou hypoplasies ventriculaires, des défauts au niveau septal…
Chez l’homme, des mutations responsables de l’inactivation de Jagged1, principal ligand de
notch au cours de la cardiogenèse, sont responsables du syndrome d’Alagille, un désordre
autosomique dominant responsable de multiples malformations dont celle du cœur. Ce type de
syndrome peut se développer également suite à des mutations de Notch2.
iii- Signalisation Wnt
Rôle de Wnt au cours de la spécification cardiaque et la différenciation précoce
Des études réalisées chez le poulet ou la grenouille ont montré que la spécification cardiaque
dépend d’un équilibre entre activateurs et répresseurs de Wnt. L’activation de la voie
canonique de Wnt dans le mésoderme antérieur inhibe l’expression de gènes cardiaques
précoces comme Nkx2.5 et Gata4 dans le croissant cardiaque [416] [417]. Les agents
canoniques Wnt1 et Wnt3a, exprimés dans le plateau neural et le tube neural dorsal, inhibent
la spécification cardiaque dans le mésoderme postéro-proximal. Des inhibiteurs de Wnt, tels
que crescent (frzb2), sont exprimés dans l’endoderme sous-tendant le mésoderme cardiaque
[417]. L’expression de crescent ou Dkk dans le mésoderme cardiaque postérieur induit
l’expression et l’apparition de cardiomyocytes battants [416] [417]. L’inhibition de la voie
canonique de Wnt favorise donc la spécification des précurseurs cardiaques dans le
mésoderme antéro-latéral qui forme le croissant cardiaque. Dans des modèles utilisant les
cellules ES, l’activité de la voie canonique Wnt est bi-phasique avec une action pro- ou anticardiogénique
[418] [419], son rôle pro-cardiaque s’effectuant précocément. En effet, l’agent
Wnt2a et possiblement son homologue Wnt2b jouent un rôle important dans la spécification
cardiaque dans le mésoderme précoce [420]. L’ensemble de ces données montrent que la voie
canonique Wnt a un rôle bi-phasique dans l’induction cardiaque : Wnt régule positivement
dans les phases précoces puis inhibe la différenciation cardiaque à des stades tardifs.
Concernant la voie non canonique de Wnt, des expressions d’invalidation ou d’expression
ectopique, réalisées chez le poulet, la grenouille ou dans des cellules ES de souris, montrent
que Wnt11 joue un rôle critique positif dans l’induction cardiaque [421], [422] [423], [424]
[417].
59

Rôle de Wnt dans la spécification et l’expansion des progéniteurs du champ cardiaque
secondaire
Des expériences de blocage de la voie Wnt/β-caténine montrent que cette voie est impliquée
dans le maintien et l’expansion des progéniteurs Isl1+ [157] [425] [426] [427] [428]. La β-
caténine se fixe directement sur le promoteur du gène codant pour Islet 1 et active son
expression [428], mais agit également via les agents FGF [429].
Autres rôle de Wnt pour le tissu cardiaque
La voie Wnt/β-caténine joue également un rôle dans le développement vasculaire (Cattelino
et al 2003, Liebner et al 2004), endothélial (Wang et al 2007) et épicardique (Merki et al
2005).
b- miRNA
La régulation transcriptionnelle du développement cardiovasculaire nécessite un contrôle
spatiotemporel de l’expression de gènes précis [430] [431] [432] [433]. Parmi ces régulateurs,
plusieurs miRNA ont un rôle spécifique dans la cardiogenèse [95].
Le micro-ARN miR-1 favorise l’émergence du mésoderme et bloque le développement de
l’ectoderme et celui de l’endoderme puis il est impliqué dans l’induction cardiaque [95]. Le
micro-ARN miR-1 régule négativement la croissance cardiaque en inhibant l’expression de
Hand2, une bHLH impliquée dans l’expansion des cardiomyocytes ventriculaires. Des souris
sur-exprimant miR-1 présentent un phénotype comparable à celui des souris invalidées pour
Hand2, à savoir une trabéculation ventriculaire diminuée et une hypoplasie ventriculaire
[434]. A l’inverse, la délétion de miR1 est responsable de multiples arythmies cardiaques chez
les souris mutantes [430]. En effet, l’absence de miR1 provoque l’augmentation du facteur de
transcription Iroquois homeobox (Irx)5 qui contrôle la repolarisation ventriculaire en inhibant
l’expression de gènes codant pour les canaux potassiques tels que Kcnd2 [435] provoquant les
troubles de rythme. Dans un modèle d’infarctus de rat, l’administration d’oligonucléotides
antisens visant à diminuer les miR-1 diminue le développement d’arythmies [436]. La même
équipe a identifié les cibles directes de miR-1 qui sont GJA1 codant pour la protéine gap
junction connexine 43 et KCNJ2 codant pour la sous-unité Kir2.1 du canal potassique,
protéines toutes deux impliquées dans l’homéostasie électrique cardiaque [436]. Le micro-
ARN, miR-133 joue un rôle essentiel dans le développement musculaire strié squelettique
60

mais est également impliqué dans la régulation du système de conduction. Dans des modèles
de gain de fonction, les souris mutées présentent une augmentation des dépolarisations et re-
polarisations ventriculaires provoquant des troubles du rythme [437]. Le micro-ARN miR-138
est un miARN hautement conservé à travers les espèces et est mis en évidence dans plusieurs
régions de l’embryon. Cependant, au niveau du cœur du poisson-zèbre, il est spécifiquement
détecté dans les ventricules [438]. L’inhibition de miR-138 est responsable de l’augmentation
d’expression des gènes spécifiques du canal atrio-ventriculaire au niveau des ventricules eux-
mêmes, empêchant la maturation complète des ventricules. Le micro-RNA miR-208 est
impliqué dans la régulation des changements d’isoformes de myosin heavy chain. Les souris
déficientes en miR-208 ne produisent pas de MyHC, exprimé par les cardiomyocytes, en
période de stress et ne développent pas d’hypertrophie cardiaque [439] [440] [441]. Ces
observations sont liées à l’inhibition de la thyroid receptor-associated protein THRAP1, un
co-régulateur transcriptionnel du récepteur thyroïdien [440]. En plus de la régulation du
développement des cardiomyocytes, celle des structures angiogéniques/endothéliales est
essentielle pour le développement cardiaque. Le miRNA miR-126 est un régulateur clé de la
signalisation endothéliale et vasculaire in vivo [442] [443] [444]. Il joue un rôle positif dans le
développement vasculaire en bloquant notamment la Sprouty related protein 1 (Spred1) [442]
[444]et la sous-unité de la phosphatidyl-inositol 3-kinase p85β (ou PIK3R2), qui sont des
régulateurs négatifs des voies de signalisation MAPK et PI3K dépendantes de VEGF et
d’autres facteurs de croissance. Le miR-143 semblerait impliqué dans la régulation du
développement des cellules vasculaires lisses (communication orale Srivastava et al 2009).
La figure III 5 ci-dessous résume les différents micro-RNA et leurs implications dans les
développements, cardiaque, vasculaire et musculaire lisse.
61

Figure III 5 : Représentation schématique des principaux miRNA régulant le système
cardio-vasculaire (les flèches représentent une induction, les traits représentent un blocage,
les gènes en rouge sont des cibles directes des différents miRNA, qui sont tous régulés
négativement)
c- Facteurs intrinsèques
Chez les vertébrés, le développement cardiaque est complexe et débute avant la gastrulation,
avec l’orientation des cellules du plateau antéro-latéral du mésoderme vers le lignage
cardiaque, puis leur migration et leur organisation en croissant cardiaque. Cette orientation
cardiaque dépend de signaux provenant de l’endoderme, incluant les BMP, les bFGF et les
protéines Wnt. Puis, apparaît le tube cardiaque grâce à la fusion de précurseurs cardiaques
provenant du croissant cardiaque. Une anomalie survenant au stade de fusion en tube
cardiaque est responsable de cardia bifida. Les premiers facteurs intervenant à ce stade sont le
facteur Gata4 [445] [446] en synergie avec Nkx2.5 [447]. Au fur et à mesure du
développement cardiaque, le tube cardiaque subit de nombreux remaniements, incluant la
spécification des chambres, la septation, la trabéculation et la formation des quatre chambres.
Plusieurs modèles murins ont permis de souligner le rôle de plusieurs facteurs de transcription
pour chacune de ces étapes développementales et sont représentés dans la figure III 6.
62

Figure III 6 : Représentation schématique des différentes étapes de la cardiogenèse chez la
souris (Nemer 2008). Abréviations : a, atria; ao, aorta; la, left atrium; lv, left ventricle; ot, outflow tract; pa,
pulmonary aorta/trunk; ra, right atrium; rv, right ventricle; sv, sinus venosus; v, ventricle.
Chez l’Homme, des défauts de compartimentalisation et de communication entre les
différentes chambres ont été retrouvés dans la majorité des cardiopathies congénitales.
L’étude de ces cardiopathies a permis d’identifier un groupe de gènes responsables codant
principalement pour des facteurs de transcription du développement cardiaque. Ces facteurs
régulent les différentes étapes du développement cardiaque comme la valvulogenèse, le
développement du système de conduction et la formation et maturation des chambres
cardiaques (figure III 7).
63

Figure III 7 : Cartographie des principales anomalies structurales observées dans les
cardiopathies congénitales (Nemer 2008). Abréviations : ASD, atrial septal defect; AV block,
atrioventricular block; AVSD, atrioventricular septal defect; DORV, double outlet right ventricle; PS, pulmonary stenosis;
PTA, tricuspid atresia; TOF, tetralogy of Fallot; VSD, ventricular septal defect.
La cartographie des mutations cardiaques permet de noter que Nkx2.5, Gata4 et Tbx5 sont
fréquemment associés aux maladies cardiaques congénitales, soulignant leur rôle fondamental
dans la cardiogenèse [448] [449]. Gata4 est impliqué dans la plupart des cardiopathies
congénitales, Nkx2.5 est responsable de défauts atrio-septaux, de tétralogie de Fallot, de
défauts ventriculaires septaux et Tbx5 de défauts atrio-septaux, de tétralogie de Fallot, de
défauts septaux ventriculaires. Ces observations sont appuyées par le fait que ces gènes
interviennent très précocement dans le développement cardiaque, dès l’émergence des champs
cardiaques primitif et secondaire (cf. chapitres précédents et figure III6) et par plusieurs
modèles d’invalidation de ces gènes chez la souris.
B- Régénération musculaire striée cardiaque
Jusqu’à une période récente, les cardiomyocytes étaient considérés comme des cellules
considérées comme non renouvelées. Des études ont à présent mis en évidence que certains
cardiomyocytes sont aptes à se diviser [450], [451], [452], [453]. De nouveaux
64

cardiomyocytes sont ainsi générés tout au long de la vie [454]. La sur-expression des gènes
IGF1 [455], télomérase [456], cycline D [457], bcl-2 [458], et cdk2 [459] dans les
cardiomyocytes est accompagnée d’une augmentation du nombre de cellules et d’une plus
grande tolérance aux conditions pathologiques. De plus, le nombre de myocytes dans le cœur
augmente de plusieurs fois par rapport à la naissance et un turn over est observé tout au long
de la vie comme l’attestent les expériences basées sur l’incorporation du BrdU, du Ki67 ou de
la thymidine tritiée [454]. Enfin, l’identification récente de populations de progéniteurs
cardiaques en période post-natale est également en faveur d’un renouvellement
cardiomyocytaire.
1- Progéniteurs chez la souris
Trois populations de progéniteurs cardiaques ont été identifiées dans le cœur des souris sur la
base de l’expression de différents marqueurs. Ces trois populations de progéniteurs cardiaques
(Islet1+, cKit+, Sca1+) sont phénotypiquement différentes et expriment certains marqueurs
cardiaques de manière différentielle mais sont toutes trois Nkx2.5+ et Gata4+ [460], [461],
[462], [463].
a- Les progéniteurs Islet1+ identifiés par Laugwitz et al (2005)
Cette population isolée à partir de cœur de souris post-natal exprime Islet1 et est apte à se
différencier en cardiomyocytes matures [462]. Islet1 est un facteur de transcription à LIMhoméodomaine
[464] qui est impliqué dans les voies de régulation cardiaque mais également
neurales et pancréatiques.
b - Les progéniteurs ckit+ identifiés par Beltrami et al (2001, 2003)
Cette population, isolée à partir de souris adultes, possède des propriétés de clonogénicité,
d’auto-renouvellement et peut se différencier en cardiomyocytes, cellules vasculaires
musculaires lisses et cellules endothéliales [453]. Ce type de progéniteurs peut être amplifié in
vitro en enrichissant les milieux de culture avec Jagged1 suggérant que la voie Notch1
favorise la prolifération des cardiomyocytes, avec réexpression de Nkx2.5 [465].
c- Les progéniteurs Sca1+ identifiés par Oh et al (2004)
65

La population de progéniteurs Sca1+ de cœur adulte, n’exprime ni les protéines structurelles
cardiaques, ni Nkx2.5, ni les marqueurs endothéliaux ou hématopoïétiques. En revanche ces
progéniteurs sont positifs pour GATA4, Mef2C et Tef1. Ces progéniteurs peuvent se
différencier en cardiomyocytes après exposition à la 5-azacytidine. Une heure après leur
injection intra-veineuse au décours d’une lésion myocardique, ils sont détectés au niveau de la
lésion ischémique [466]. L’injection de ces progéniteurs cardiaques directement dans la zone
infarcie a permis d’obtenir une amélioration à court terme de la fonction cardiaque mais avec
une différenciation cardiomyocytaire limitée.
2- Progéniteurs cardiaques du cœur fœtal et adulte chez l’Homme
De manière analogue, chez l’homme, plusieurs populations de progéniteurs cardiaques postnataux
ont été identifiés (Islet1+, ckit+ et Sca1+) et ont en commun d’exprimer, comme chez
la souris, Nkx2.5 et/ou Gata4.
a- Les progéniteurs Islet1+ identifiés par Laugwitz et al (2005)
Une population de progéniteurs cardiaques exprimant Isl1 a été détectée en période néonatale
mais aussi chez l’adulte. Elle est uniquement présente de manière faible, au niveau de
l’oreillette droite. Son rôle physiologique n’est à ce stade pas clair [462] [467].
b- Populations de progéniteurs ckit+
Les progéniteurs cardiaques ckit+ ont été identifiés par plusieurs équipes et diffèrent selon les
auteurs. Le groupe de Messina et al [468] a isolé une population hétérogène, de par son
origine cellulaire et son potentiel de différenciation, à partir de biopsies réalisées au niveau
des oreillettes et ventricules humains. En culture in vitro, ces cellules peuvent former des
amas sphériques de cellules, les cardiosphères. Les cellules situées au centre des
cardiosphères expriment ckit et les cellules périphériques expriment des marqueurs cardiaques
et endothéliaux. Les cellules provenant de ces cardiosphères ne se contractent qu’en présence
de cardiomyocytes de rats néonataux. Le groupe d’Urbanek et al [452] a identifié une
population endogène cardiaque ckit+ (prélevés au niveau de la région cardiaque proche de
l’outflow tract) chez des patients ayant une sténose aortique ou au décours d’une
transplantation cardiaque. Ces cellules expriment également Sca1 et sont capables de se
différencier en cardiomyocytes, cellules vasculaires musculaires lisses et cellules
endothéliales in vitro et après greffe chez des souris immunodéprimées [469].
66

c- Les progéniteurs Sca1+ identifiés par Van Vliet et al (2008)
Cette population (CD45-/CD34-) est localisée dans les oreillettes, la région atrio-ventriculaire
et l’épicarde, et est capable de se différencier en cardiomyocytes battants in vitro en présence
de 5-Azacytidine [470].
Ces différents progéniteurs cardiaques peuvent être isolés à partir de biopsies myocardiques
minimes en vue d’une expansion in vitro. Cependant, aucune étude clinique n’a pour le
moment été entreprise. De plus, de nombreuses questions restent en suspens : leur culture in
vitro peut-elle avoir une incidence sur la qualité de la différenciation après injection in vivo ?
Ces différentes populations de progéniteurs sont-elles intrinsèquement différentes ou
correspondent-elles à différentes étapes de différenciation d’une même population ? Y-a-t-il
lieu de penser que ces progéniteurs cardiaques dérivent d’artefacts expérimentaux ?
C’est pourquoi, de nombreuses équipes ont axé leurs travaux sur l’utilisation de cellules
alternes non cardiaques pour améliorer la régénération cardiaque.
En plus des progéniteurs de cardiomyocytes à proprement parler, la matrice conjonctive
cardiaque est essentielle pour une régénération cardiaque optimale. Les fibroblastes
cardiaques génèrent la matrice extra-cellulaire permettant la fonction élastique du cœur. Les
fibroblastes cardiaques n’expriment aucun marqueur cardiaque, ni endothélial, ni neural mais
ils expriment le dicoïde domaine receptor 2 et Thy-1 [471]. Ils dérivent de la région
épicardique réalisant la transition epithélio-mésenchymateuse pendant la cardiogenèse. Ces
cellules sont également à l’origine des cellules vasculaires musculaires lisses et des cellules
endothéliales. L’épicarde régule le développement du myocarde, des coronaires, des fibres de
Purkinje et des structures fibreuses du cœur [472]. Si les fibroblastes récapitulent les
propriétés essentielles des cellules dérivant de l’épicarde dans des situations pathologiques, il
se peut que l’épicarde soit à l’origine de certains progéniteurs cardiaques chez l’adulte [473].
67

2- Thérapie cellulaire et réparation musculaire cardiaque
A- Utilisation de cellules atypiques ou alternes pour la régénération
cardiaque
1- Transplantation de myoblastes squelettiques
L’une des premières stratégies de thérapie cellulaire cardiaque a été l’autogreffe de
myoblastes squelettiques dans la région cardiaque lésée.
Dans des modèles de souris et/ou rats, une nette amélioration de la fonction cardiaque a été
observée après transplantation de myoblastes squelettiques [474], [475], [476], [477], [478],
[479], sans qu’un phénomène de transdifférenciation ait pu être démontré [480], [481], [482].
Des essais cliniques chez l’homme de greffe intra-cardiaque de myoblastes squelettiques ont
été réalisés [483], [484], [485]. Les myoblastes se différencient cependant en myotubes in
vivo, et non en cardiomyocytes [486]. De plus, ces myoblastes transplantés ne forment pas de
‘gap junctions’ avec les cardiomyocytes avoisinants et ne battent pas de manière synchrone
avec le reste du cœur [487] [488] [489]. Ce découplage électro-mécanique limite l’efficacité
fonctionnelle de ce type de greffe et peut être à l’origine de troubles du rythme sévères.
L’amélioration de la fonction ventriculaire n’est pas le résultat d’une fonction contractile des
myoblastes mais plutôt d’une amélioration du remodelage du ventricule gauche grâce à la
présence des myoblastes transplantés. Compte-tenu des ces observations, une bonne part des
essais cliniques ont été prématurément arrêtés pour manque de réel bénéfice clinique.
1- Transplantation de cellules dérivant de la moelle osseuse
Les premières études visant à étudier la capacité des cellules de moelle osseuse à se réorienter
vers le lignage cardiomyocytaire ont été celles qui ont utilisé les CSH [490] dans des modèles
d’infarctus chez la souris. La transplantation de CSH prélevées d’une souris mâle et injectées
dans le cœur d’une souris femelle, montre que ces progéniteurs sont aptes à participer à la
régénération cardiaque [491]. Chez l’animal, des expériences de transplantation de moelle
osseuse avec des cellules hématopoïétiques marquées dans le cœur infarci montrent que les
cardiomyocytes dérivant des cellules greffées existent mais à un taux très faible [492]. Une
68

amélioration de la mobilisation des cellules hématopoïétiques via le G-CSF [493], [494],
[495] ou c-met/HGF, SDF1/CXCR4 [496] a été observée dans des modèles murins.
Cependant d’autres études n’objectivent pas de différenciation des progéniteurs
hématopoïétiques vers le lignage cardiaque [490], [497], [498], [499], [288] et ne révèlent
qu’une légère amélioration fonctionnelle cardiaque. La possibilité que des progéniteurs de
moelle osseuse, notamment la sous-population hématopoïétique, puissent se différencier en
cardiomyocytes reste très discutée [500], [501]. Chez l’homme, de nombreuses études
cliniques (REPAIR-AMI, TOCPARE-CHD, ASTAMI) ont utilisé des cellules mononucléées
de moelle osseuse, non triées dans la majorité des cas, dans leurs protocoles de greffe, dans
des conditions d’ischémie aiguë, et ont obtenu peu ou pas de bénéfice de la fonction cardiaque
à long terme [502], [503], [504]. Dans le faible nombre de cas pour lesquels un bénéfice est
rapporté, les mécanismes de cette amélioration clinique ne sont pas identifiés mais ils
n’impliquent probablement pas une différenciation cardiomyocytaire. La libération de
facteurs de croissance et de cytokines par les cellules greffées expliquerait ce bénéfice
lorsqu’il existe, comme le montre l’étude REPAIR-AMI [502]. L’utilisation d’agents
mobilisateurs tels que le G-CSF dans le protocole de greffe ne semble pas, dans la plupart des
études, améliorer la prise de greffe ni la régénération cardiaque [505]. Dans les essais
cliniques utilisant des cellules de moelle osseuse ou des cellules endothéliales, dans un
contexte de cardiopathie ischémique chronique, il semblerait que les résultats soient plus
encourageants que dans un contexte d’ischémie aiguë, mais à nouveau, les effets à long terme
sont peu convaincants [506], [507], [508], [509], [510], [511], [512].
2- Transplantation de cellules souches mésenchymateuses
Les CSM sont obtenues à partir de la moelle osseuse, du tissu adipeux [4], [513], [514], [515],
[516], [517], ou du sang de cordon (Chen et al 2003, Kadivar et al, Kodama et al 2005). Ces
cellules ont la propriété de pouvoir se différencier en adipocytes, en ostéoblastes et en
chondrocytes. Elles ont pour avantage d’avoir une faible immunogénécité, permettant une
thérapie cellulaire allogénique [518]. In vitro, elles se différencient en cardiomyocytes [519],
[520] contractiles, exprimant des marqueurs cardiaques précoces et tardifs [521]. Dans le but
d’augmenter la conversion cardiaque, des agents déméthylants tel que la 5-Azacytidine ont été
utilisés et permettent d’augmenter la participation de ces cellules à la réparation cardiaque
[522], [523], [524], [525] et d’obtenir parfois jusqu’à six fois plus de cellules de type
69

cardiaques in vitro [526]. La culture des CSM dans un milieu contenant Jagged1 favorise leur
orientation vers le lignage cardiaque in vitro. Afin d’augmenter leur potentiel thérapeutique,
des expériences d’expression ectopique ont été réalisées dans des CSM sur-exprimant des
facteurs de survie, des facteurs angiogéniques ou de homing [520], sans effet bénéfique
notable. Même si la greffe de ces cellules permet une amélioration de la fonction cardiaque, le
taux de conversion en cardiomyocytes reste faible et implique plutôt leur capacité à sécréter
de manière paracrine des facteurs de croissance et/ou de support pour d’autres cellules
présentes dans le cœur lésé [499], [527], [520], [528], [525]. La figure III 8 ci-dessous résume
les principaux mécanismes potentiels par lesquels la greffe de CSM permet une amélioration
de la réparation cardiaque.
Figure III 8 : Représentation des différents mécanismes d’action permettant une
reparation cardiovasculaire grâce aux CSM (Psaltis et al 2008)
Les CSM peuvent avoir des effets paracrines via le relargage de cytokines/facteurs de
croissance ou via des interactions directes avec les cellules cardiaques résidentes. Le
phénomène de transdifférenciation en cardiomyocytes fonctionnels est probablement un
évènement rare.
70

3- Transplantation de cellules endothéliales
Les progéniteurs endothéliaux sont obtenus à partir de moelle osseuse et de sang de cordon. Il
a été montré que ces cellules participent efficacement à la réparation cardiaque [529] [530].
Cependant, le mécanisme de contribution des cellules endothéliales à la régénération
cardiaque et leur potentiel de différenciation en cardiomyocytes sont très discutés. Certains
auteurs observent une activation du programme transcriptionnel cardiaque [531], alors que
d’autres montrent leur participation prédominante à la néoangiogenèse [532], [533], [530]. En
plus de contribuer directement à cette vascularisation, permettant l’approvisionnement du
cœur en nutriments, les cellules endothéliales fournissent des signaux paracrines de survie aux
cardiomyocytes [534].
Des observations similaires ont été faites avec des cellules endothéliales apparentées, les
cellules CD133+, dans des expériences in vitro et in vivo [535], l’amélioration étant le plus
souvent liée également, à des mécanismes de néoangiogenèse [535]. Une étude clinique
utilisant des cellules CD133+ de moelle osseuse et réalisée chez 10 patients a permis une
certaine amélioration de la fonction cardiaque [536].
Le mésangioblaste est un progéniteur récemment décrit comme étant associé aux vaisseaux
[297], [537], [538]. Il est capable de s’auto-renouveler et de se différencier in vitro en
plusieurs types cellulaires mésodermiques (cellules endothéliales, cellules musculaires lisses
et cellules musculaires cardiaques). Galli et al ont montré que les mésangioblastes sont aussi
efficaces que les cellules mononucléées de moelle osseuse pour la réduction de la dysfonction
cardiaque gauche, via la sécrétion de facteurs anti-apoptotiques et angiogéniques.
4- Transplantation de cellules ES
Les cellules ES sont aptes à se différencier en de nombreux types cellulaires présents dans
l’organisme adulte. Elles sont notamment capables de régénérer complètement le myocarde.
Les grands obstacles à leur utilisation en thérapie cellulaire sont d’ordre éthique mais
également physiologique avec un risque de rejet immunologique et d’apparition de tératomes
[486], [539]. Cependant, grâce à une meilleure compréhension des voies de régulation de la
différenciation cardiaque des cellules ES, on peut contrôler leur orientation vers le lignage
71

cardiomyocytaire, et les faire différencier ex vivo en cardiomyocytes avant injection in vivo,
limitant ainsi le risque de développement de tératome : les cellules ES différenciées en
cardiomyocytes étant sélectionnées avant l’injection [540], [541]. Ainsi, il a pu être montré
que la génération de cardiomyocytes à partir de cellules ES est régulée par plusieurs facteurs
de croissance tels que BMP2 [542], [543], TGFβ [542], [541], TNF [544], [545], [546], FGF
[547], [541] et l’Erythropoïétine [548], [549]. Ces facteurs de croissance, une fois fixés à
leurs récepteurs, permettent l’expression de facteurs de transcription impliqués dans les étapes
précoces de la cardiomyogenèse tels que Nkx2.5 et GATA4. Par ailleurs, les cellules ES
différenciées peuvent survivre et améliorer la fonction myocardique en présence de facteurs
de survie [540]. La différenciation cardiaque des cellules ES peut également être induite par
un système de co-culture avec des cellules de la lignée endodermique END2 [550] qui sécrète
des facteurs facilitant la différenciation cardiaque. La même équipe montre qu’en bloquant la
voie P38MAPK, l’orientation vers le lignage cardiaque est amplifiée [551]. Des modulateurs
épigénétiques ont également été utilisés pour le contrôle de la différenciation
cardiomyocytaire, en particulier la 5-Azacytidine [526] [470]. Enfin, moduler les miRNA
pourrait également influer sur l’orientation cardiaque des cellules ES.
5- Cas des cellules souches pluripotentes induites (iPS)
A partir de cellules iPS provenant de fibroblastes embryonnaires de souris, il est possible de
générer des progéniteurs Flk1+ capables de se différencier en cellules des lignages
cardiovasculaires [552] [553] et hématopoïétiques. Ces progéniteurs sont aptes à se
différencier en cellules endothéliales et, par co-culture avec des cellules stromales OP9, en
cardiomyocytes [553]. Le potentiel de différenciation des iPS in vitro est comparable à celui
des ES (lignée D3) dans des techniques de culture de corps embryonnaire ou en présence de
collagène de type IV [552], bien que pour certaines équipes cette différenciation soit un peu
moins performante que celle des ES [82]. Le potentiel de différenciation cardiaque a
également été évalué pour des iPS lignées humaines [554] et comparé à celui des cellules ES.
Cette analyse comparative a porté sur l’expression de marqueurs cardiaques, sur
l’organisation sarcomérique, l’activité électrique et la signalisation β-adrénergique et montre
que les iPS humaines ont un potentiel de différenciation comparable à celui des ES.
Récemment, l’administration de la descendance d’iPS humaines dans des cœurs infarcis,
greffe correctement et permet la régénération de cellules cardiaques, musculaires lisses et
endothéliales avec une amélioration de la contractilité ventriculaire et une bonne stabilité
72

électrique [555]. Bien que l’utilisation des iPS n’en soit qu’à ses débuts, les résultats sont très
prometteurs. Il faudra cependant rester vigilant quant au risque tumorigène de ces cellules.
6- Conclusion
De nombreuses cellules ont donc été utilisées, avec des résultats très mitigés. La figure III 9
ci-dessous résume les différentes sources cellulaires ayant été testées et les questions posées,
notamment en termes de capacité contractile, aptitude angiogénique et immunogénicité. Ainsi,
les premières études de plasticité développementale utilisant les cellules souches
hématopoïétiques ont été à l’origine de multiples essais cliniques visant à tester l’efficacité
des cellules mononucléées de la moelle osseuse dans la réparation cardiaque au décours des
ischémies cardiaques aiguës. Par la suite, d’autres études n’ont pas rapporté de manière
évidente de phénomène de transdifférenciation des CSH en cardiomyocytes, mettant en
évidence des phénomènes de fusion. En outre, les essais cliniques basés sur la greffe de
moelle osseuse montrent un petit effet bénéfique de la greffe sur la fonction ventriculaire, sans
qu’aucune néocardiomyogenèse ait pu être mise en évidence et sans qu’aucun réel effet à long
terme ait pu être démontré.
Par ailleurs, de nouvelles populations cardiaques souches ont été identifiées, offrant
potentiellement de nouvelles perspectives thérapeutiques. Cependant, ces cellules sont rares,
difficilement cultivables ex vivo et leur identification reste difficile du fait de l’existence de
plusieurs populations, aux phénotypes variés. De plus, leur réelle contribution à la
régénération cardiaque reste à déterminer.
Wollert et al soulèvent les différents axes d’étude permettant d’améliorer les conditions d’une
éventuelle thérapie cellulaire dans le domaine de la réparation cardiaque. La figure III 10 cidessous
résume les différents niveaux de réflexion : comment améliorer la différenciation
cardiomyocytaire ? Utiliser les effets paracrines ? Utiliser la niche environnementale ?
Améliorer la résistance des cellules résiduelles, diminuer leur apoptose ?
Pour améliorer la contribution fonctionnelle des cellules non cardiogéniques à la réparation
musculaire cardiaque, plusieurs équipes ont travaillé sur la re-programmation forcée de ces
cellules par expression ectopique de facteurs particuliers avant transplantation. Ces données
sont discutées dans le paragraphe suivant.
73

Figure III 9 : Représentation schématique des différentes sources cellulaires utilisées pour
l’étude de leur contribution à la régénération cardiaque et/ou amélioration fonctionnelle de
ce tissu [556],
74

Figure III 10 : Hypothèses de travail pour la thérapie cellulaire cardiaque [557]
B- Plasticité forcée et myogenèse cardiaque
1- Fibroblastes transduits avec GATA4
Les expériences de souris invalidées pour GATA4 soulignent l’importance de ce facteur de
transcription dans le développement cardiaque. Bian et al [558] ont souhaité étudier les effets
potentiels de GATA4 dans des expériences de gain de fonction. Des fibroblastes cardiaques
sont ainsi stablement transfectés avec GATA4 ou GFP témoin, puis transplantés dans le cœur
de rats Lewis un mois après la ligature des coronaires. A 6 semaines de la transplantation il
apparaît que, dans le groupe GATA4, la fonction cardiaque est meilleure par rapport au
groupe GFP : le remodelage fibreux est moindre et, histologiquement en zone périlésionnelle,
les cardiomyocytes sont de plus grande taille. De plus, le nombre de cellules exprimant la
75

myosine cardiaque est supérieur dans le groupe GATA4. L’administration vectorielle de
GATA4 pourrait ainsi avoir un bénéfice fonctionnel cardiaque significatif.
2- Cellules souches mésenchymateuses co-transduites avec Nkx2.5 et GATA4
Yamada et al [559] ont co-transduit des CSM de la lignée 9-15c (connues pour pouvoir se réorienter
vers le lignage cardiaque après exposition à la 5-AZA) avec Nkx2.5 et GATA4.
Après exposition à la 5-AZA et 4 semaines de culture, l’expression de la troponine I et du
peptide natriurétique est augmentée dans les cellules 9-15c co-transduites par rapport aux
cellules non transduites. De plus, cette expression peut être augmentée si les cellules sont
cultivées sur fibronectine, en présence de PDGF et d’acide rétinoïque. Ces résultats sont
retrouvés, en l’absence de 5-AZA, dans des systèmes de co-culture de cellules 9-15c GFP+
transduites et non transduites avec GATA4/Nkx2.5 avec des cardiomyocytes de
souris (augmentation également de cellules battantes GFP+).
3- Fibroblastes cardiaques transduits avec la myocardine
Van Tuyn et al [560] ont prélevé des fibroblastes cardiaques des zones fibrosées d’un cœur
lésé suite à un infarctus. Ces cellules expriment GATA4 et la connexine 43 et ont un potentiel
de différenciation adipocytaire. Ils ont transduit ces fibroblastes cardiaques avec un vecteur
lentiviral contenant la séquence codante de la myocardine (qui est un facteur de transcription
cardiaque). Ces fibroblastes transduits expriment alors des protéines cardiaques spécifiques,
comprenant des composants sarcomériques, des facteurs de transcription, des canaux
ioniques, ainsi que certains marqueurs de cellules musculaires lisses. Ces fibroblastes
modifiés sont également capables de transmettre un potentiel d’action et d’aider ainsi des
cardiomyocytes déficients dans leur fonction de conduction.
4- Fibroblastes cardiaques transduits avec MyoD1
Eltzion et al (Circulation 2002) ont transduit des fibroblastes cardiaques issus de cœurs
infarcis de rats avec MyoD1 ou GFP témoin. Dans les expériences in vitro avec MyoD1, ces
fibroblastes adoptent une morphologie allongée avec présence de myotubes multinucléés et
aspect strié en microscopie électronique. D’autre part, ces cellules expriment la myosin heavy
chain, l’actinine et l’actine sarcomérique. Ces cellules de type myogéniques sont transplantées
76

(1,5x10 6 cellules) dans la zone myocardique infarcie 7 jours après la lésion. Un mois après
transplantation, les fibroblastes convertis génèrent des amas de cellules myogéniques
positives pour la myosin heavy chain, l’actinine et l’actine sarcomérique. Cependant, une très
faible quantité de cellules, désorganisées, provenant de ces fibroblastes modifiés expriment la
connexine 43. Eltzion et al montrent donc que les fibroblastes cardiaques transduits par
MyoD1 ne génèrent pas de cardiomyocytes in vivo dans un modèle d’ischémie cardiaque
chez le rat : ces fibroblastes ne génèrent, majoritairement, que des myocytes squelettiques.
5- Fibroblastes de peau co-transduits avec MyoD1 et connexine-43
Kizana et al [561] [562] ont obtenu, après co-transduction de fibroblastes de peau par MyoD1
et connexine 43, des myocytes avec des flux calciques synchrones, reflétant la capacité de ces
fibroblastes doublement modifiées à avoir un couplage électromécanique efficace.
6- Cellules mésodermiques de souris transduites avec Gata4 et Tbx5 en présence de
l’agent remodelant chromatinien Baf60
Très récemment, Takeuchi et Bruneau ont pu obtenir des cardiomyocytes battants en
transduisant des cellules de mésoderme de souris, y compris le mésoderme non cardiogénique
postérieur et le mésoderme extra-embryonnaire, avec Gata4 et Tbx5 et en présence de Baf60
qui est un agent remodelant de la chromatine. Gata4 et Baf60 induisent l’initiation de la
cardiomyogenèse et Tbx5 permet la différenciation en cellules cardiomyocytaires battantes et
répriment le programme transcriptionnel non cardiaque [563].
En conclusion, les données recueillies concernant le développement cardiaque, la régénération
cardiaque ainsi que les travaux de thérapie cellulaire et les modèles expérimentaux de
reprogrammation forcée nous ont menés à opter pour les trois facteurs Nkx2.5, Gata4 et Tbx5,
qui constituent nos outils de reprogrammation et que nous décrivons plus en détail dans le
chapitre suivant.
77

C- Facteurs de transcription Nkx2.5, Gata4 et Tbx5
1 - Nkx2.5
a- Description de Nkx2.5
Csx/Nkx2.5 est un facteur de transcription conservé dans l’évolution, initialement identifié
chez la drosophile [564]. Dans cette espèce, son orthologue appelé NK4 ou tinman appartient
à une famille de gènes à homéobox composé de 4 membres. Le facteur NK4 est exprimé dans
le mésoderme et est requis pour la formation du vaisseau dorsal, l’équivalent du cœur des
vertébrés, ainsi que les muscles viscéraux [565], [566], [567]. Chez les mammifères,
Nkx2.5/Csx (Csx : ‘cardiac-specific homeobox’) est caractérisé par son rôle spécifique dans
les lignages myocardiques [568], [569]. La protéine Nkx2.5/Csx (voir Figure III 11) comprend
un homéodomaine ainsi que le domaine NK-2 spécifique en C-terminal (NK2-SD) [564].
L’homéodomaine de Nkx2.5/Csx est un motif de type hélice-boucle-hélice qui reconnaît et
fixe une séquence consensus de l’ADN 5’T(C/T)AAGTG3’ [570]. Les fonctions du domaine
NK2-SD sont de masquer l’activité transcriptionnelle [564] et d’agir comme une plateforme
pour l’interaction protéine-protéine. La fonction du domaine TN n’est pas connue.
Figure III 11 : Représentation schématique des différents domaines de Nkx2.5
Chez l’homme, le gène de Nkx2.5 est localisé en 5q34, est composé de deux exons et code
pour une protéine de 318 acides aminés. L’homéodomaine forme 3 hélices et la troisième
hélice est responsable de la fixation sur les séquences régulatrices des gènes cibles. Les autres
78

égions conservées sont la région TN du domaine de transactivation et le domaine NK2
impliqué dans l’autorégulation.
b- Rôle dans la cardiogenèse
i- Principales fonctions dans le développement cardiaque
La protéine Nkx2.5 a été détectée dans de nombreux tissus pendant le développement fœtal :
rate, estomac, foie, langue, larynx [571], mais c’est dans le coeur que Nkx2.5/Csx est le plus
fortement exprimé, que ce soit dans le champ cardiaque primitif ou secondaire [569], [568,
571, 572]. Nkx2.5/Csx est également impliqué à des phases plus tardives de la cardiogenèse,
notamment au moment de la maturation des cardiomyocytes ventriculaires [573], dans le
développement et la maturation du système de conduction [574], [575], [576] et dans la
différenciation post-natale des fibres de Purkinje [575], [576].
ii- Rôle dans la détermination cardiaque
Des expériences de surexpression et de délétion de Nkx2.5 soulignent son rôle dans la
détermination cardiaque. La surexpression est responsable d’hyperplasie cardiaque [577],
[578], [579]. En revanche, la perte de fonction de Nkx2.5 provoque la létalité à E9-E10, avec
arrêt de la morphogenèse du tube cardiaque [580], [581], [582]. Cependant, la détermination
cardiaque persiste, puisqu’il y a formation du tube cardiaque reflétant soit l’existence d’un
facteur en amont de Nkx2.5 pour l’initiation de la cardiogenèse, soit une redondance
fonctionnelle parmi les facteurs Nkx [583], [584], [585], [586], [587] [588], [589], [590].
iii- Gènes dérégulés dans les modèles murins impliquant Nkx2.5
Les modèles de mutant Nkx2.5 ont également permis, d’identifier certains de ses gènes
comme cibles directes ou indirectes, qui sont répertoriés dans le tableau III 8 et de souligner
son rôle dans la régulation d’un ensemble de gènes spécifiques cardiaques essentiels pour la
différenciation du myocarde embryonnaire au-delà de l’étape de la boucle cardiaque.
79

Tableau III 1 : Gènes dérégulés dans les cœurs des souris invalidées pour Nkx2.5. [591]
c- Régulation de Nkx2.5
Le taux d’expression de la protéine NKX2.5 est régulé par différents mécanismes soit au
niveau génique, soit au niveau protéique. Ils sont définis comme suit.
i- Eléments cis-régulateurs
Plusieurs séquences cis-régulatrices (AR1, AR2, AR3, UH4, UH5, UH6, séquence à 14kb et
séquence à 6 kb) ont été décrites pour Nkx2.5. Chacune d’entre elles régule finement
l’expression de Nkx2.5. Cette régulation se fait en fonction de l’étape du développement
cardiaque (tube, croissant et boucle cardiaques), et par région cardiaque (ventricules,
oreillettes, canal atrio-ventriculaire, septum interventriculaire, outflow tract) (figure III 12).
80

Expression
20 kb 15 kb 14 kb 10 kb 9 kb 6 kb 5 kb 3 kb
UH4 UH5 UH6 AR1 AR3 AR2
Langue, Langue, Chi Chi 2005 2005
Oreillettes, Chi Chi 2005 2005
Croissant cardiaque
CAV, ventricules,
Tanaka Tanaka 1999 1999
VD, Septum IV
CAV, Chi Chi 2005 2005
Nkx2.5
Figure III 12 : Expression spatio-temporelle de Nkx2.5 en fonction des éléments cisrégulateurs
ii- Eléments trans-régulateurs
Plusieurs facteurs sont décris comme régulateurs directs de Nkx2.5. Il existe plusieurs sites
GATA au niveau des différents enhancers AR1 [592], AR2 [593] et AR3 [594], [595] qui sont
reconnus par les facteurs Gata (4, 5, 6) pour la régulation de l’expression de Nkx2.5 aux
stades précoces du développement cardiaque. Des sites de fixation pour les facteurs Smad4
[593], [596], [597] et Ying et Yang 1 (YY1) [595] ont également été identifiés. La synergie
Gata/ Smad4/YY1 est essentielle pour l’expression de Nkx2.5 dans les champs cardiaques
primitifs et secondaires [595]. Chez la souris, il a récemment été montré que Nkx2.5 est
régulé par NFAT seul ou NFAT en association avec d’autres facteurs, comme Gata4, au cours
de la cardiogenèse.
iii- Modulation épigénétique
Les observations faites sur des souris invalidées pour le gène codant Rae 28 qui appartient au
groupe Polycomb, montrent que ce facteur est impliqué dans la régulation de l’expression de
Nkx2.5 [598]. L’activité de Nkx2.5 est augmentée grâce au rôle co-facteur de p300 qui
Boucle cardiaque
VD, Lien Lien 1999 1999
VD, Tanaka Tanaka 1996 1996
Outflow tract, Reecy Reecy 1999 1999
Croissant cardiaque
Tube cardiaque
Outflow Outflow tract, Searcy Searcy 1998 1998
81

permet un remaniement conformationnel du domaine C-terminal de Nkx2.5 [599]. L’activité
HDAC1, potentiellement régulée par la voie Wnt semble essentielle pour l’activité de
Nkx2.5 : des expériences de surexpression montrent que Wnt3 et Wnt3a, ainsi que la β-
caténine et Lef1 diminuent l’activité HDAC1, favorisant l’expression de Nkx2.5 [600].
iv- Régulation post-traductionnelle
La protéine Nkx2.5 peut être sumoylée, ce qui a pour effet de stabiliser la formation des
complexes protéiques avec Nkx2.5, favorisant la fixation à l’ADN et renforçant ainsi l’
activité transcriptionnelle [601].
v- Régulateurs environnementaux
Au cours du développement cardiaque précoce, les cellules myocardiques du champ
cardiaque primaire et secondaire sont sous l’influence des facteurs BMP (Bone Morphogenic
Factors), des FGF (fibroblast growth factors) et des protéines de la famille Wnt. Ces trois
grandes familles initient l’expression d’une cascade de facteurs de transcription dont Nkx2.5.
Concernant BMP2 et BMP4, dans des expériences d’expression ectopique [389],
d’invalidation chez la souris [602], [603], d’utilisation de dominants négatifs [604] ou
d’inhibiteurs de la voie BMP (tel que Noggin) [605], il a été montré que ces deux agents sont
des activateurs cardiogéniques régulant positivement l’expression de Nkx2.5.
Les effets de la voie Wnt, canonique ou non canonique, sur Nkx2.5 sont complexes : suivant
le type d’espèce, le stade de maturation cardiogénique et le type de voie Wnt, cet agent peut
avoir un effet répresseur [606], [417], [416], [607] ou activateur [424], [608].
La famille FGF est également impliquée dans la régulation de Nkx2.5 dont l’expression est
activée par FGF8, et majorée en présence de BMP [609].
d- Gènes cibles de Nkx2.5
La plupart des gènes cibles de Nkx2.5 sont spécifiques des cellules cardiaques comme
l’indique le tableau III 2 ci-après. Les produits de ces gènes interviennent soit aux étapes
précoces de la cardiogenèse (Hop, Mef2c, myocardine, Pitx2) et soit aux étapes plus tardives
(Nppa, connexine 40, CARP…).
82

Tableau III 2: Gènes cibles de Nkx2.5 [591]
e- Modèles murins de Nkx2.5
La délétion de Nkx2.5 est responsable de létalité chez la souris à cause d’anomalies au niveau
de l’étape de boucle cardiaque [580], alors que l’hémizygotie peut résulter en une hypoplasie
du système de conduction, avec différents niveaux de pénétrance, menant à des troubles de
conduction atrio-ventriculaire (Jay 2004). Un modèle d’invalidation de Nkx2.5 restreint aux
ventricules établit le rôle de ce facteur dans la formation, la maturation et le maintien du
système de conduction [573]. Bien qu’il n’y ait pas d’anomalies structurelles cardiaques
pendant le développement embryonnaire, toutes les souris adultes présentent des
83

cardiomyopathies progressives avec un bloc cardiaque complet et une hypertrophie du muscle
trabéculaire.
f- Cardiopathies congénitales humaines liées à Nkx2.5
Chez l’Homme, 21 mutations hétérozygotes et deux délétions de Nkx2.5 ont été répertoriées
chez des patients souffrant de cardiopathies congénitales [610], (figure III 13). La majorité de
ces mutations touche la moitié C-terminale de la protéine contenant l’homéodomaine. Les
protéines mutées ont une capacité de fixation à l’ADN diminuée et la capacité d’interaction
avec les partenaires est variable [610]. Elles restent localisées dans le noyau mais avec une
localisation sub-cellulaire anormale [610].
Dans les pathologies cardiaques non familiales, les anomalies concernant Nkx2.5 sont rares
mais ces mutations somatiques existent et apparaissent aux étapes précoces du développement
cardiaque [611] [612] [613].
L’ensemble de ces observations ne met pas en évidence de corrélation claire entre le génotype
et le phénotype. Les patients souffrent essentiellement de troubles de conduction atrioventriculaires,
avec un spectre variable de malformations cardiaques (Benson 1999). Ces
malformations cardiaques regroupent essentiellement des défauts atrio-septaux, des tétralogies
de Fallot, des défauts septaux ventriculaires, des anomalies de l’arche aortique, des
transpositions des gros vaisseaux, des coarctations de l’aorte, des hypoplasies du cœur
gauche. Cette hétérogénéité phénotypique est expliquée par l’hétérogénéité génétique de
Nkx2.5, le mosaïcisme au sein du tissu malade et des anomalies somatiques additionnelles
[614] [615].
84

Figure III 13 : Représentation des différentes mutations de Nkx 2.5 chez l’homme [591]
g- Nkx2.5 dans des pathologies non cardiaques
De rares cas de LAL-T (leucémie aiguë lymphoblastique) avec translocation t(5 ;14),
impliquant Nkx2.5 ont été rapportés [616], [617], [618]. La translocation t(5 ;14) met en
relation le suppresseur de tumeur BCL11B (Kruppel family zinc, tumor suppresor gene) avec
TLX3 et Nkx2.5 qui ont un effet inhibiteur sur BCL11B le rendant ainsi oncogénique.
Nkx2.5 a également été détecté dans des tumeurs solides : cinq cas de myxomes et un cas de
liposarcome du médiastin ont été rapportés [619]. Le rôle oncogène de Nkx2.5 dans ces deux
néoplasies n'est absolument pas éclairci et ces situations tumorales restent rares.
2- GATA4
a- Description de Gata4
GATA4 appartient à la famille des facteurs de transcription GATA qui comprend 6 membres,
sub-divisés en deux sous-groupes : GATA-1, -2, -3, impliqués dans l’hématopoïèse et GATA-
4, -5, -6, exprimés au niveau de l’endoderme et au niveau du tissu cardiaque [620], [621].
Chez l’homme, le gène de Gata4 est situé en 8p23.1-p22 et contient 7 exons. Des analyses
structure-fonction ont mis en évidence l’existence de deux domaines particuliers dans la
structure de la protéine GATA4 (figure III 14) : le domaine de liaison à l’ADN qui contient 2
domaines à doigt de zinc et le domaine d’activation transcriptionnelle. Au niveau des
85

promoteurs des gènes cibles, le doigt de zinc, côté C-terminal, est impliqué dans la fixation à
l’ADN (5’-(A/T)GATA(A/G)-3’ ) alors que le doigt de zinc du côté N-terminal influence la
stabilité de la fixation à l’ADN. La plupart des interactions protéine-protéine se fait via le
doigt de zinc du côté C-terminal, alors que le doigt de zinc du côté N-terminal interagit avec
Friend of Gata (FOG).
Zinc Finger domains
DNA binding domain
Nkx 2.5
NH 2 - -COOH
Transcriptional
Activator Domain
NLS
443 amino acids
Figure III 14 : Schéma des différents domaines de Gata4 (abréviation : NLS : signal de
localisation nucléaire)
b- Rôle dans la cardiogenèse
i- Principales fonctions dans la cardiogenèse
Au cours de la cardiogenèse, GATA4 est l’un des facteurs les plus précoces, puisqu’il est
détecté dès le 7 ème jour post-coïtum chez la souris, au niveau du mésoderme pré-cardiaque.
Cette protéine est également détectée pendant l’incurvation du tube cardiaque, dans
l’endocarde, le myocarde et le mésoderme pré-cardiaque [622], [623], [624] ainsi qu’au
niveau du pro-épicarde (Watt et al 2004). Il est également détecté chez l’adulte au cours de
l’hypertrophie cardiaque dont la pathogénie peut rappeler certaines régulations
développementales cardiaques [625].
ii- Rôle dans la différenciation cardiaque
GATA4 a un rôle essentiel dans la différenciation cardiaque comme l’attestent les expériences
réalisées in vitro sur la lignée P19 [626], [627]. Lorsque GATA4 est bloqué ou absent, la
différenciation cardiaque terminale est affectée et l’apoptose des cellules pré-cardiaques est
favorisée, alors que la surexpression de GATA4 induit des cardiomyocytes battants, même en
l’absence de DMSO. Il semblerait que dans les P19, GATA4 agisse en amont de Nkx2.5 :
GATA4 est détecté avant Nkx2.5 et la surexpression de GATA4 induit une augmentation de
86

Nkx2.5. Il faut toutefois rester prudent dans l’interprétation de ces résultats en raison du
modèle utilisé et de l’existence éventuelle de boucles régulatrices positives [628]. Des
expériences réalisées sur des explants de Xénope (analyse par RT-PCR), appuient néanmoins
l’idée que Nkx2.5 est régulé positivement par GATA4 [629].
iii- Gènes dérégulés dans les modèles murins impliquant Gata4
Les phénotypes observés dans les différents modèles murins invalidant Gata4 permettent de
soutenir le rôle de Gata4 dans la morphogenèse du ventricule droit et du canal atrioventriculaire
[630]. De plus, il a été montré que la régulation cardiaque Gata4-dépendante est
fonction des concentrations de Gata4 [631] ce qui permet d’expliquer les différents
phénotypes observés dans les modèles murins.
c- Voies de régulation
i- Eléments cis-régulateurs
Il existe un enhancer G2 à 45kb en amont du site d’initiation de la transcription du gène
GATA4 chez l’homme dont l’activation peut être atténuée par Noggin, dans les embryons
invalidés pour BMP4.
ii- Eléments trans-régulateurs
Plusieurs facteurs trans-régulateurs ont été décrits. Le membre FOG2 de la famille de facteurs
de transcription Friend of GATA, réprime l’activité de Gata4 [632] [633], ce qui est
nécessaire pour certaines étapes de la cardiogenèse notamment pour le développement
coronaire [633]. Il est également un co-activateur de certains gènes cardiaques cibles de
Gata4. Les facteurs de transcription Hey 1 et Hey2 régulent également Gata4 en réprimant sa
transcritpion. Enfin, il existe des séquences cibles de Tbx au niveau du gène Gata4, suggérant
que Gata4 est une cible directe des facteurs Tbx, tels que Tbx5. Cette hypothèse est appuyée
par le fait que les souris déficientes en Tbx5 n’expriment pas GATA4 [634].
iii- Régulateurs environnementaux
L’importance de la voie BMP dans la régulation de Gata4 au cours des étapes précoces de la
cardiogenèse a été démontrée dans les embryons de souris invalidés pour BMP4 [635]. Par
ailleurs, il a été montré que la voie canonique de Wnt régule négativement GATA4 [629].
87

iv- Modification post-traductionnelle de la régulation de Gata4
Phosphorylations
Gata4 est régulé au niveau post-traductionnel par des phénomènes de phosphorylation
(Sérine 105). Lorsqu’il est phosphorylé, Gata4, plus stable [636], a une capacité de fixation à
l’ADN augmentée [637], [638], [639], [640], [641], [642]. Les extracellular signal-regulated
kinase (ERK) (Liang et al 2001), la p38MAPK [640], la GTPase RhoA [640] sont impliquées
dans ces phénomènes de phosphorylation.
En revanche, lorsque le protéine GSKβ phosphoryle la région N-terminale de Gata4, cette
phosphorylation a un effet négatif sur la transcription Gata4-dépendante en favorisant l’export
extra-nucléaire de Gata4 par l’exportine Crm1 [637]. L’inactivation de GSKβ est corrélée
avec une augmentation de NFAT, qui est un co-facteur de Gata4.
Acétylations
Gata4 peut être également régulé par des phénomènes d’acétylation via son interaction avec
p300 [643], [644].
Sumoylations
La protéine PIAS1 cible plus particulièrement le site de sumoylation au niveau de la lysine
366 de GATA4 et permet une augmentation de l’activité transcriptionnelle de Gata4 [645].
d- Gènes cibles de Gata4
Plusieurs gènes cibles ont été identifiés parmi lesquels : ANP, BNP, la corine, les canaux
échangeurs Na+/Ca++, le récepteur à l’acétylcholine M2, CARP, le récepteur à l’adénosine
A1, la carnitine palmitoyl-transférase-1[646] [647] [648] [649] [650] [651] [652]. Des motifs
Gata ont été observés dans le promoteur de Nkx2.5 et Gata4 est nécessaire pour l’activité du
promoteur de Nkx2.5 au cours du développement cardiaque [593] [592].
Dans des modèles animaux de stress cardiaque chronique ou d’hypertrophie cardiaque, les
cibles identifiées sont : la MyHC, le récepteur à l’angiotensine II de type 1 [653],
l’endothéline 1 et indirectement l’ANP et le BNP [654].
e- Modèles murins d’invalidation de Gata4
Les souris invalidées pour Gata4 arrêtent leur développement entre E7 et E9,5 du fait de
malformations sévères. Ces embryons sont dépourvus de tube cardiaque et de structures
88

digestives. Concernant la cardiogenèse, ces embryons développent le mésoderme
splanchnique qui se différencie en cardiomyocytes primitifs exprimant des protéines
contractiles. Cependant, ces cellules cardiaques ne parviennent pas à migrer au niveau de la
ligne médiane. Le tube cardiaque ne peut alors pas être constitué et des structures
cardiogéniques anarchiques sont observées au niveau des régions antérieures et postérolatérales
de l’embryon [624], [623]. La délétion précoce de Gata4 s’accompagne d’un
myocarde peu développé, d’une absence de cellules mésenchymateuses au niveau des
bourgeons endocardiques et d’une hypoplasie du ventricule droit. L’invalidation tardive de
Gata4 est responsable d’anomalies du ventricule droit avec un myocarde peu développé et une
diminution de la prolifération cardiomyocytaire. Les phénotypes des mutants GATA4 sont
parfois peu sévères et ne peuvent être expliqués uniquement par la redondance entre les
différents membres GATA et notamment entre GATA6 et GATA4 [624], [623], [655]. En
effet, la co-délétion de GATA4, GATA5 et GATA6 est responsable de cardia bifida sans
troubles majeurs de la maturation myocardique, phénotype comparable à celui des souris
invalidées pour GATA4 seul [656], encore que la double invalidation hétérozygote
GATA4/GATA6 est responsable chez la souris de létalité à E 13,5 avec de nombreux défauts
cardio-vasculaires incluant un myocarde peu développé, des défauts septaux, une diminution
de la prolifération des cardiomyocytes et un développement vasculaire lisse anormal [657].
f- Cardiopathies congénitales humaines liées à Gata4
Des études cliniques ont indiqué un rôle de GATA4 dans certaines cardiopathies congénitales
humaines [658], [659], [660], [661], [662], [663]. Des analyses par FISH chez des patients
ayant des cardiopathies congénitales avec délétion au niveau du chromosome 8p23.1 ont
révélé une hémizygotie de Gata4 [658]. Une mutation (G296S) hétérozygote à proximité de la
région C-terminale du doigt de zinc, a été retrouvée chez des membres d’une famille de
patients présentant des défauts septaux et valvulaires. La protéine mutée a une capacité de
fixation à l’ADN diminuée [659]. Une autre famille de patients présentant des troubles
septauxatriaux avaient également des anomalies au niveau de GATA4 (mutation entraînant un
décalage du cadre de lecture au codon 359), responsables d’une forme tronquée de la protéine.
Les principaux phénotypes cardiaques observés impliquent des anomalies de l’endocarde, des
défauts septaux atriaux et/ou ventriculaires, des malformations du ventricule gauche [659].
Plus récemment, Tomita-Mitchell et al [664] ont identifié 4 mutants faux-sens (Gly93Ala,
Gln316Glu, Ala411Val1, Asp425Asn). Toutes ces mutations soulignent l’importance de
Gata4 dans le développement cardiaque et les cardiopathies congénitales.
89

g- Implication de Gata4 dans des pathologies non cardiaques
Chez la souris adulte, GATA4 est également détecté au niveau des gonades, du poumon, du
foie et de l’intestin grêle [665].
De manière analogue, chez l’homme, en plus de son rôle dans la cardiogenèse, Gata4 est un
régulateur important du développement hépatique, des gonades, de l’épithélium digestif et du
poumon (cf. revue de [621], ce qui implique potentiellement Gata4 dans des pathologies
congénitales non cardiaques.
3- Tbx5
a. Description de Tbx5
Tbx5 appartient à la famille de facteurs de transcription ayant le domaine conservé ‘T-box’.
Le facteur T-box originel est le facteur T ou brachyury qui a été décrit chez la souris. Depuis,
de nombreux membres de cette famille ont été décrits chez les vertébrés et les invertébrés de
l’hydre à l’humain. Les facteurs T-box peuvent être activateurs, répresseurs ou les deux, en
fonction du contexte cellulaire. Ils peuvent interagir avec d’autres facteurs de transcription
[634], [659], [666], [667], [668], [669], [670], [671], ainsi qu’avec des co-activateurs et des
co-répresseurs [672], [670]. Le facteur Tbox décrit comme essentiel pour la cardiogenèse est
Tbx5.
Chez l’homme, le gène codant pour la protéineTbx5 est sur le chromosome 12. Tbx5 contient
un motif T-box, impliqué dans la fixation à l’ADN et dans les interactions inter-protéiques, un
domaine de transactivation (acides aminés 339-379) et un domaine de signalisation nucléaire
(NLS), situé au niveau de la séquence KRK en 325-327, (figure III 15). La Tbox se fixe au
niveau de la séquence consensus GGTGT sur les gènes cibles [673]. [674] et agit comme un
activateur transcriptionnel [634].
Transactivation dom ain
T B o x d o m a in N L S
Figure III 15: Représentation schématique des différentes régions de Tbx5
518
90

. Rôle dans la cardiogenèse
Chez la souris, Tbx5 est exprimé dans le croissant cardiaque, indiquant sont rôle dans la
cardiogenèse précoce, avec ensuite un gradient d’expression présentant son maximum au
niveau de la région sino-atriale [675], [676]. Ce gradient est établi selon la signalisation liée à
l’acide rétinoïque qui est connu comme essentiel pour le développement sino-atrial [677],
[678]. Une expression persiste également au niveau du ventricule gauche, de la moitié gauche
du septum interventriculaire et des travées du ventricule droit [675]. Ce gradient de
concentration de Tbx5 est essentiel pour l’identité des différentes régions cardiaques,
notamment pour la morphogenèse des chambres [677], [679]. Les embryons invalidés pour
Tbx5 n’ont pas de ventricule gauche et les régions sino-atriales sont hypoplasiques [634].
Tbx5 a également un rôle dans le contrôle de la prolifération des cellules cardiogéniques aux
étapes précoces de la cardiogenèse en favorisant la progression du cycle cellulaire, mais
également dans la migration de ces cellules [680], [681]. Tbx5 est aussi important pour le
développement du système de conduction [682], [683], [684], [573].
c. Voies de régulation
Les co-facteurs tels que Tip60 qui est une histone acétyl transférase [672], Baf60c, un
composant du complexe de remodelage chromatinien Swi-Snf [685], Taz, une protéine β-
caténine like, se fixant sur un domaine-WW particulier de Tbx5, sont des régulateurs de Tbx5.
Taz s’associe directement à Tbx5 pour activer les promoteurs cibles de Tbx5 en interagissant
avec les histones acétyl transférase p300 et PCAF. Yap, une protéine apparentée à Taz,
stimule aussi Tbx5 en formant un hétérodimère avec Taz [686].
d. Gènes cibles de Tbx5
Dans les poissons-zèbres invalidés pour Tbx5 on observe une diminution d’expression de
l’αmyosin heavy chain, de myosin heavy chain et cmlc2 [687]. Des analyses
transcriptomiques d’une lignée cellulaire cardiaque de souris 1H [688] transduite avec Tbx5, a
permis de mettre en évidence certains gènes up-régulés par Tbx5 comme ANF (nppa), la
cadhérine du photorécepteur, la brain creatin kinase, le heary/enhancer of split related 2 et la
gelsoline [689]. Tbx5 permet également l’expression de l’isoforme 2a de l’ATPase
sarcoendoplasmique calcium-dépendante (Atpa2a2) en activant directement le promoteur de
Atpa2a2. Les troubles de relaxation ventriculaire observés dans les souris mutées pour Tbx5
sont liés à un défaut d’activation d’Atp2a2 par Tbx5, qui est responsable d’anomalies au
niveau des flux calciques [690].
91

A ce jour, les gènes cibles décrits de Tbx5 sont encore peu nombreux mais certains sont
spécifiques cardiaques tels que Nppa, l’Atpa2a2, la myosin chain. D’autres n’interviennent a
priori pas dans le développement cardiaque ou sont produits au décours d’un stress cardiaque.
e. Modèles murins d’invalidation deTbx5
Des souris invalidées de manière homozygote pour Tbx5 meurent précocement à E9,5. Celles
qui ont une délétion hétérozygote présentent des anomalies cardiaques et squelettiques des
membres antérieurs [634]. La sur-expression de Tbx5 sous le contrôle du promoteur de la
MyHC inhibe le développement ventriculaire et entraîne la perte d’expression de gènes
spécifiques ventriculaires [677]. Ces observations soulignent le rôle essentiel de Tbx5 dans le
développement cardiaque.
f. Cardiopathies congénitales humaines liées à Tbx5
Le syndrome de Holt Oram (HOS) (1 naissance sur 100.000) est un désordre génétique
héréditaire causé par des mutations du gène codant pour Tbx5, situé en 12q24 [691], [692].
Cliniquement, ce syndrome associe des malformations congénitales squelettiques des
membres supérieurs et de multiples malformations cardiaques telles que des défauts du
septum atrial, du septum ventriculaire, du septum atrio-ventriculaire, la tétralogie de Fallot,
des troubles de conduction et des anomalies des veines pulmonaires [693]. Certains
syndromes atypiques de Holt-Oram (troubles du rythme atrial, défauts squelettiques mineurs)
sont liés à une mutation conduisant à une surexpression de Tbx5 [694].
Jusqu’à présent, plus de 60 mutations différentes de Tbx5 ont été répertoriées [695], (cf. aussi
figure III 16). Une grande majorité de ces mutations (non-sens, décalages du cadre de lecture,
mutations ponctuelles) résulte en l’apparition précoce de codons stop menant à une forme
tronquée de la protéine Tbx5 [696], [697]. Les mutations survenant au niveau de la T-box
touchent la capacité de fixation à l’ADN ainsi que les interactions avec Nkx2.5, résultant en
une activation réduite des cibles géniques impliquées dans le système de conduction [698].
D’autres mutations sont responsables d’un blocage de l’interaction de Tbx5 avec Gata4,
responsables de défauts du septum cardiaque [659]. D’autres mutations encore empêchent la
translocation nucléaire de Tbx5, causant une haploinsuffisance fonctionnelle liée à une
délocalisation de la protéine Tbx5 avec perte fonctionnelle [698]. Tandis que le taux de
mutations de Tbx5 dans les HOS avoisine les 74% [699],des mutations somatiques (mutation
92

faux-sens) ont été décrites dans des malformations cardiaques n’appartenant pas aux HOS
[615].
Figure III 16 : Schéma représentant certaines mutations de Tbx5 responsables de
syndrome de Holt-Oram.
4- Coopération fonctionnelle Nkx2.5 / Gata4 / Tbx5
Comme Nkx2.5, GATA4 et Tbx5 jouent un rôle clé dans la cardiogenèse et sont impliqués
dans des cardiopathies congénitales. Par ailleurs, de plus en plus de gènes cibles de la triple
interaction Nkx2.5/GATA4/Tbx5 sont rapportés.
Nkx2.5 et Gata4 interagissent directement l’un avec l’autre via l’homéodomaine de Nkx2.5 et
les doigts de zinc de Gata4 [646], [700], [701], [447]. L’homéodomaine de Nkx2.5 interagit
directement avec la boite Tbx de Tbx5 [634], [667]. Ces interactions peuvent être synergiques
comme par exemple Nkx2.5/Gata4 pour l’activation de Nppa [447]. Ces différentes corégulations
sont séquencielles pour l’expression de gènes particuliers. Un modèle récent de
régulation de Nppa a été proposé : l’initiation de l’expression de Nppa est favorisée par la
coopération Gata4/SRF/Tbx5 [702] et le maintien de son expression, notamment au niveau
atrial, est contrôlé par l’association Nkx2.5/Gata4 [702], alors que cette expression est
modulée négativement par Tbx2 qui empêche l’interaction Tbx5/ Nkx2.5 au niveau du canal
atrio-ventriculaire et de l’outflow tract.
93

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