Comparaison de trois méthodes pour la détection de Mycoplasma et ...

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Pour l'urine, il faut commencer par centrifuger 5 min à 3000 rpm. Ajouter 200 µl de Tampon G2 dilué 1/10 10 µl de Protéinase K Ensuite : Faire chauffer 15 min à 56 °C Pour finir : Insérer la carte EZ1 DNA Bacteria dans l'automate. Appuyer sur START Choisir le programme avec 50 µl de volume d'élution Presser sur next jusqu'à ce que l'appareil démarre. 5 4.2.5 Etape de la PCR Pour la PCR en temps réel, nous avons utilisé le Rotor-Gene 3000. Il permet la détection et la quantification de microorganismes pathogènes au moyen de sondes marquées par la fluorescence. Cet appareil utilise le « hot Start » afin de réduire les réactions aspécifiques et d'assurer une sensibilité maximale. 3 Pour commencer, il y a la dénaturation à 95°C. Cela favorise la séparation des brins d'ADN afin d'obtenir un ADN simple brin. 3 Ensuite, il y a l'hybridation à 45°C-65°C. Cette étape permet aux amorces de s'hybrider au brin d'ADN cible afin de servir de point de départ pour la polymérisation du brin d'ADN. 3 Pour finir, vient l'étape de l'élongation à 72°C. L'ADN polymérase va polymériser le brin par ajout successif de désoxyribonucléotides libres par complémentarité : A-T, C-G dans le sens 5'---3'. 3 C'est à ce moment que nous pourrons voir s'il y a le pathogène recherché par fluorescence. En effet, lors du passage de la polymérase, celle-ci vient détacher la sonde présente (si le pathogène est présent) car elle possède une activité exonucléasique en 5'. Le fluorochrome émetteur (Reporter) va se détacher du fluorochrome suppresseur (Quencher) ce qui va donner une fluorescence. 3 11
4.2.6 Matériel : Photo 8 : Sonde TaqMan Rotor-Gene 3000 Premier Mix contenant les amorces et la sonde Deuxième Mix contenant la polymérase, un tampon et les désoxyribonucléotides Les échantillons Les contrôles Malheureusement, nous n'avons aucun détail sur le contenu des Mix ni sur les séquences des amorces et de la sonde. 6 Photo 9 : Rotor-Gene 3000 12
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