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DIAGNOSTIC ANTIGENIQUE DE CRYPTOSPORIDIUM PARVUM
DANS LES FECES DE VEAUX PAR METHODE ELISA
96 échantillons analysés
POURQUIER ELISA CRYPTOSPORIDIUM ANTIGENE MONOCUPULE
Version P00605/03 du 12/07/2006
T
326 rue de la Galéra - Parc Euromédecine - 34097 Montpellier Cedex 5 - France
Tél. 33(0)499.23.24.25 - Fax 33(0)467.04.20.25 - info@institut-pourquier.fr - http://www. institut-pourquier.fr
S.A. au capital de 600.000 € - RC 70B77 Montpellier – SIRET 470 800 772 00027 – APE 246 L – TVA N° FR72470800772

N
INTRODUCTION
Les diarrhées néonatales sont une des causes majeures de mortalité chez les jeunes veaux de moins d'un mois.
Elles sont souvent poly-factorielles. Elles peuvent être la conséquence d'une infection par des virus
(Coronavirus et Rotavirus), des bactéries (Colibacille entérotoxinogène le plus souvent, Salmonella) ou des
protozoaires (Cryptosporidium parvum). Le diagnostic étiologique des diarrhées néonatales passe
obligatoirement par des tests de laboratoire car il n'est pas possible d'identifier l'agent causal sur la base de
symptômes cliniques.
Le test proposé dans cette trousse permet le diagnostic du Cryptosporidium parvum par la mise en évidence des
antigènes par la méthode ELISA. Cette méthode est de mise en œuvre facile, rapide et fiable et se prête
particulièrement bien à l'analyse d'un grand nombre d'échantillons. Les résultats peuvent être évalués
directement "à l'œil nu" ou à l’aide d’un spectrophotomètre.
PRINCIPE DU TEST
Le principe du test proposé est le suivant :
1) Tous les puits de la microplaque ont été sensibilisés par des anticorps polyclonaux dirigés contre les
oocystes de cryptosporidium parvum. Ces anticorps assurent la capture de l’agent à partir des fèces.
2) Les matières fécales sont diluées dans le "Tampon de dilution" et incubées sur la microplaque.
3) Après lavage de la microplaque, le conjugué est ajouté. Celui-ci est un anticorps monoclonal
anti - C. parvum couplé à la peroxydase, spécifique de l’agent pathogène.
N
4) Après lavage de la microplaque, le substrat de l'enzyme (TMB) est mis dans les cupules. En cas de présence
du cryptosporidium parvum dans l'échantillon, le conjugué reste fixé sur les cupules et l'enzyme catalyse la
transformation du chromogène incolore en un produit bleu (lecture à l’œil). La réaction peut être bloquée
avec la solution d’arrêt qui transforme la coloration en jaune et permet la lecture au spectrophotomètre.
L’intensité de la coloration est une mesure du taux d’antigène présent dans l’échantillon à tester.
.
Des échantillons de contrôle positif et négatif sont fournis avec la trousse afin de pouvoir valider les résultats
obtenus
PRECAUTIONS D'EMPLOI
N
1) Ne pas pipeter les réactifs à la bouche.
2) Ne pas utiliser de réactifs provenant d'autres trousses.
3) Bien que le matériel livré avec le coffret ne contienne aucun élément contaminant et que l’échantillon de
contrôle positif soit théoriquement non infectieux, il est toutefois conseillé de décontaminer l’ensemble des
éléments à usage unique utilisé au cours des manipulations. Cette décontamination peut se faire soit par
immersion pendant 1 heure minimum dans l’hypochlorite de sodium à 5% fraîchement préparé avant de
les éliminer, soit par autoclavage à 120°C pendant 1 heure minimum ou par toute autre méthode conforme
à la réglementation en vigueur
4) La "Solution d'arrêt" contenant du H 2 SO 4 * 0,5 M peut causer de graves brûlures en cas de contact
avec la peau, les muqueuses et les yeux.
* L'Institut POURQUIER tient à votre disposition la fiche de toxicité de ce produit.
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MATERIEL NECESSAIRE A LA REALISATION DES TESTS ET NON FOURNI
DANS LE KIT
N
1) Vortex ou similaire
2) Lecteur de microplaques (facultatif)
3) Système de lavage de plaques permettant la distribution de 300 µl par cupule (facultatif)
4) Micropipettes de précision et multicanaux (la précision requise pour la mesure doit être inférieure ou égale
à 10% pour des volumes inférieurs ou égaux à 10µl et à 5% pour tous les autres volumes indiqués)
5) Embouts de pipettes à usage unique
6) Billes de verre
7) Eau distillée : l'eau utilisée pour la préparation de la solution de lavage peut être produite par un système
de distillation conventionnel ou par tout système performant de purification d'eau (osmose inverse,
purification sur résine et charbon actif, ...). Ne pas utiliser d’eau susceptible de contenir des agents
oxydants (hypochlorite de soude) ou des sels de métaux lourds.
8) Couvercles pour plaques, aluminium ou adhésifs.
CONTENU DU KIT ET CONSERVATION
Il est recommandé de travailler avec la totalité des réactifs ramenés à +21°C (± 5°C). Pour cela, il est conseillé
de sortir les réactifs de l’enceinte réfrigérée au moins une heure avant le test (à l'exception du conjugué et des
échantillons de contrôles).
!
COMPOSANT QUANTITE CONSERVATION ET REMARQUES
Microplaque sensibilisée
monocupule
Solution de Lavage
Concentrée 20 X
1 +5°C (± 3°C)
- Si une microplaque n'est pas utilisée en totalité, elle pourra
être utilisée dans les 3 mois si elle a été refermée
immédiatement de façon étanche avec le sachet déshydratant
et conservée à +5°C (± 3°C).
1 flacon de 100 ml +5°C (± 3°C)
- Présente des précipités à +5°C (± 3°C) qui disparaissent
rapidement à +21°C (± 5°C), une légère agitation de temps
en temps accélère la dissolution des cristaux.
- Peut aussi être conservée à +21°C (± 5°C) jusqu'à un mois, si
les flacons sont refermés de façon étanche, afin d’être
immédiatement disponibles.
- Après dilution, peut être conservée 3 jours à +5°C
(± 3°C).
- Identique pour tous les kits de l'Institut POURQUIER et peut
donc être utilisée indifféremment dans un kit ou dans un
autre
Tampon de dilution 8 1 flacon de 50 ml +5°C (± 3°C)
Echantillon de contrôle positif 1 flacon de 0,5 ml +5°C (± 3°C)
(verdâtre)
Echantillon de contrôle 1 flacon de 0,5 ml +5°C (± 3°C)
négatif
(marron)
Conjugué anti
1 flacon de 1,2 ml +5°C (±3°C)
Cryptosporidium-peroxydase (vert)
- La solution de conjugué dilué ne peut être conservée
N
Solution d'arrêt
(solution H 2
SO 4
0,5 M)
Solution de révélation 5 prête
à l'emploi (TMB)
Mode d’emploi
1 flacon de 120 ml +5°C (± 3°C)
- Peut aussi être conservée à +21°C (± 5°C) jusqu'à un mois,
si les flacons sont refermés de façon étanche, afin d’être
immédiatement disponible
- Identique pour tous les kits de l'Institut POURQUIER, elle
peut donc être utilisée indifféremment dans un kit ou dans un
autre.
1 flacon de 30 ml +5°C (± 3°C)
- Peut être laissée sur la paillasse à +21°C (± 5°C) d'une
utilisation à l'autre jusqu'à une semaine si le flacon est
refermé de façon étanche.
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LECTURE A L’OEIL
MODE OPERATOIRE
1) DEPÔT DES ECHANTILLONS
N
a) Distribuer (cf figure 1):
- Echantillon de contrôle :
- 100 µl d’échantillon de contrôle négatif pur dans le puits A1
- 100 µl d’échantillon de contrôle positif pur dans les puits B1 et C1
- Echantillon à tester :
- 50 µl de "Tampon de dilution 8"par puits
- 50 µl de matières fécales dans chaque puits contenant le "Tampon de dilution 8" (cf note).
b) Couvrir la plaque (couvercle, papier aluminium ou adhésif)
c) Incuber la plaque pendant 30 minutes (± 3 mn) à +21°C (± 5°C).
Note :
Si la consistance de l'échantillon rend l'homogénéisation difficile, ajouter des billes de verre dans le récipient et déliter les
fèces en agitant vigoureusement l'ensemble. Ne pas centrifuger. Dans ce cas, il est aussi possible de diluer l’échantillon au
1/4 voire au 1/10 dans le "Tampon de dilution 8" tout en utilisant les échantillons de contrôle négatifs et positifs purs.
A N 6 14
B P 7 15
N = Echantillon de contrôle
négatif
P = Echantillon de contrôle
positif
C P 8 1 = Echantillon à tester n°1
D 1 9 2 = Echantillon à tester n° 2
E 2 10 …
F 3 11 …
G 4 12
H 5 13 Figure 1 : dépôt des échantillons
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2) LAVAGE
a) Diluer au 1/20 la "Solution de lavage concentrée 20X" dans de l'eau distillée ou déminéralisée. Cette
solution est désignée par la suite "Solution de lavage".
Cette dilution peut être réalisée avant la disparition des cristaux apparus à + 5°C (± 3°C) à condition
d'utiliser la totalité des 100 ml du flacon.
b) Vider le contenu de la plaque par retournement ou préférentiellement par un dispositif manuel ou
automatique.
c) Remplir la totalité des puits de la plaque avec la "Solution de lavage" puis les vider à nouveau.
d) Renouveler deux fois l'opération c) (soit 3 lavages au total) en évitant tout particulièrement la formation de
bulles dans les cupules.
3) DEPÔT DU CONJUGUE
a) Diluer au 1/10 le conjugué dans le "Tampon de dilution 8".
b) Distribuer la solution de conjugué dilué à raison de 100 µl par puits
c) Incuber la plaque à + 21°C (± 5°C) durant 30 minutes (± 3 mn) de préférence sous agitation.
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4) LAVAGE
a) Vider le contenu de la plaque par retournement ou par un dispositif de lavage manuel ou automatique
b) Remplir la totalité des puits de la plaque avec la solution de lavage puis les vider à nouveau
c) Renouveler 2 fois l'opération b) (soit 3 lavages au total).
!
Notes :
1) Le soin apporté au dernier lavage est capital pour la bonne réalisation du test.
2) Si le lavage est manuel, il est conseillé, après le dernier lavage, de tapoter la plaque à l’envers sur un support
absorbant afin de vider complètement les puits.
5) REVELATION
a) Distribuer la "Solution de révélation 5" à raison de 100 µl par puits.
b) Incuber 10 minutes à +21°C (± 5°C) à l’abri de la lumière.
Note :
Le temps de révélation n'est donné qu'à titre indicatif. Il peut être conditionné par différents facteurs (la qualité des
lavages, la précision des pipetages, les conditions de température des réactifs). En fonction des conditions de travail,
l'utilisateur peut être conduit à réaliser la lecture quelques minutes plus tôt ou plus tard que prévu.
VALIDATION DU TEST
Les résultats de chaque plaque sont considérés comme valides si :
→ les échantillons de contrôle positifs présentent une couleur bleue bien marquée
→ l’échantillon de contrôle négatif ne présente aucune couleur, ou une couleur bleue pâle
INTERPRETATION DES RESULTATS
Dans la mesure où la plaque est validée :
→ est positif tout échantillon présentant une couleur bleue plus foncée que celle de l’échantillon de
contrôle négatif
→ est négatif tout échantillon présentant une couleur équivalente ou plus pâle que celle de l’échantillon
de contrôle négatif
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N
LECTURE AU SPECTROPHOTOMETRE
MODE OPERATOIRE
1) DEPÔT DES ECHANTILLONS
a) Distribuer (cf figure 1):
- Echantillon de contrôle :
- 100 µl d’échantillon de contrôle négatif pur dans le puits A1
- 100 µl d’échantillon de contrôle positif pur dans les puits B1 et C1
- Echantillon à tester :
- 50 µl de "Tampon de dilution 8"par puits
- 50 µl de matières fécales dans chaque puits contenant le "Tampon de dilution 8" (cf note).
b) Couvrir la plaque (couvercle, papier aluminium ou adhésif)
c) Incuber la plaque pendant 30 minutes (± 3 mn) à +21°C (± 5°C).
Note :
Si la consistance de l'échantillon rend l'homogénéisation difficile, ajouter des billes de verre dans le récipient et déliter les
fèces en agitant vigoureusement l'ensemble. Ne pas centrifuger. Dans ce cas, il est aussi possible de diluer l’échantillon au
1/4 voire au 1/10 dans le "Tampon de dilution 8" tout en utilisant les échantillons de contrôle négatif et positif pur.
A N 6 14
B P 7 15
N = Echantillon de contrôle
négatif
P = Echantillon de contrôle
positif
2) LAVAGE
C P 8 1 = Echantillon à tester n°1
D 1 9 2 = Echantillon à tester n° 2
E 2 10 …
F 3 11 …
G 4 12
H 5 13 Figure 1 : dépôt des échantillons
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
a) Diluer au 1/20 la "Solution de lavage concentrée 20X" dans de l'eau distillée ou déminéralisée. Cette
solution est désignée par la suite "Solution de lavage".
Cette dilution peut être réalisée avant la disparition des cristaux apparus à + 5°C (± 3°C) à condition
d'utiliser la totalité des 100 ml du flacon.
b) Vider le contenu de la plaque par retournement ou préférentiellement par un dispositif manuel ou
automatique.
c) Remplir la totalité des puits de la plaque avec la "Solution de lavage" puis les vider à nouveau.
d) Renouveler deux fois l'opération c) (soit 3 lavages au total) en évitant tout particulièrement la formation de
bulles dans les cupules.
3) DEPÔT DU CONJUGUE
a) Diluer au 1/10 le conjugué dans le "Tampon de dilution 8".
b) Distribuer la solution de conjugué dilué à raison de 100 µl par puits
c) Incuber la plaque à + 21°C (± 5°C) durant 30 minutes (± 3 mn) de préférence sous agitation.
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4) LAVAGE
!
a) Vider le contenu de la plaque par retournement ou par un dispositif de lavage manuel ou automatique
b) Remplir la totalité des puits de la plaque avec la solution de lavage puis les vider à nouveau
c) Renouveler 2 fois l'opération b) (soit 3 lavages au total).
Notes :
1) Le soin apporté au dernier lavage est capital pour la bonne réalisation du test.
2) Si le lavage est manuel, il est conseillé, après le dernier lavage, de tapoter la plaque à l’envers sur un support
absorbant afin de vider complètement les puits.
5) REVELATION
a) Distribuer la "Solution de révélation 5" à raison de 100 µl par puits.
b) Incuber 10 minutes à +21°C (± 5°C) à l’abri de la lumière.
c) Déposer 100 µl de la "Solution d'arrêt" par puits.
d) Agiter légèrement jusqu'à homogénéisation de la solution colorée. Essuyer soigneusement le dessous de la
plaque.
Notes :
1) Le temps de révélation n'est donné qu'à titre indicatif. Il peut être conditionné par différents facteurs (la qualité des
lavages, la précision des pipetages, les conditions de température des réactifs). En fonction des conditions de travail,
l'utilisateur peut être conduit à bloquer la réaction quelques minutes plus tôt ou plus tard que prévu.
2) La lecture peut se faire jusqu'à 1 heure après blocage à condition de conserver les plaques à l'obscurité.
6) LECTURE
Enregistrer les densités optiques à 450 nm (DO. 450). Le zéro du photomètre est mesuré à 450 nm sur l'air.
La réaction est validée dans la mesure où :
et
CRITERES DE VALIDATION
- l’échantillon de contrôle positif a une valeur moyenne minimale en DO. 450 de : 0.500.
- un rapport minimal de 5 est obtenu entre la DO. 450 moyenne de l’échantillon de contrôle positif et la
DO. 450 de l’échantillon de contrôle négatif.
INTERPRETATION
Calculer, pour chaque échantillon à tester, le pourcentage E/P (%E/P):
%E/P = 100 x (DO 450 de l’échantillon à tester – DO 450 de l’échantillon de contrôle négatif) /
(DO 450 moyenne de l’échantillon de contrôle positif – DO 450 de l’échantillon de contrôle négatif)
-Tout échantillon dont %E/P est inférieur à 20% sera considéré comme issu d’un bovin n'étant pas porteur
du Cryptosporidium parvum.
-Tout échantillon dont %E/P est supérieur ou égal à 20% sera considéré comme issu d’un bovin étant
porteur du Cryptosporidium parvum.
SIGNIFICATION DES IDEOGRAMMES
N : Modification majeure du mode d’emploi (= modification concernant le « Mode opératoire » ou les
« Critères de validation » ou les « Règles d’interprétation »)
! : Modification mineure du mode d’emploi (conseils, pratiques …)
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