NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI - inova

Réactifs• Lames de substrat HEp-2 (cellule épithéliale humaine) ; 12 puits/lame, avec dessicatif• Conjugué à base d'IgG anti-humain (chèvre), marqué à la fluorescéine, dans un tampon contenantdu DAPI et de l'azoture de sodium à 0,09 %• Contrôle du profil de résultat final titrable des ANA, 1 flacon de tampon contenant 0,09 % d’azoturede sodium et des anticorps de sérum humain au Hep-2, prédilué• Contrôle négatif du système IFA, 1 flacon de tampon contenant 0,09 % d’azoture de sodium, sansanticorps de sérum humain au Hep-2, prédilué• Concentré de PBS II (40x), suffisant pour 2000 mL• Support pour préparations microscopiques, 0,09 % d'azoture de sodium• LamellesAvertissements1. Toutes les substances d'origine humaine utilisées pour préparer les contrôles du kit de ce produitont été testées et se sont avérées négatives aux anticorps anti-VIH, HBsAg et VHC par desméthodes approuvées par la FDA. Aucune méthode de test ne peut toutefois garantir que le VIH,le VHB et le VHC ou d'autres agents infectieux sont absents. Par conséquent, le contrôle du profilde résultat final titrable des ANA et le contrôle négatif du système IFA doivent être manipuléscomme des substances potentiellement infectieuses. 62. L'azoture de sodium est utilisé comme conservateur dans certains composants du kit. Il s'agitd'un poison qui peut être toxique en cas d'ingestion ou d'absorption par la peau ou les yeux.Cette substance peut réagir avec les canalisations en plomb ou en cuivre pour former des azidesde métal potentiellement explosifs. Rincer les éviers (s'ils sont utilisés pour éliminer le réactif)avec de grands volumes d'eau pour éviter l'accumulation d'azides.3. Utiliser un équipement de protection personnelle approprié pour travailler avec les réactifs fournis.4. Les éclaboussures de réactifs doivent être nettoyées immédiatement. Respecter toutes leslégislations nationales et locales relatives à l’élimination des déchets.Précautions1. Ce produit est à usage diagnostique in vitro.2. La substitution par des composants autres que ceux fournis dans ce système peut entraîner uneincohérence des résultats.3. Un lavage incomplet ou inefficace des puits IFA peut provoquer un fond élevé.4. L'adaptation de ce test pour une utilisation en tout ou partie avec des passeurs d'échantillonsautomatiques et d'autres dispositifs de manipulation de liquides peut générer des différencesdans les résultats des tests par rapport à ceux obtenus en utilisant la procédure manuelle. Ilappartient à chaque laboratoire de vérifier que les résultats de tests produits par sa procédureautomatisée se situent dans des limites acceptables.5. Divers facteurs influent sur les performances du test, notamment la température de départ desréactifs, la puissance de l'ampoule du microscope, la précision et la reproductibilité de la technique depipetage, le soin apporté au lavage et les durées d'incubation pendant le test. Prêter une attentionparticulière à la cohérence pour obtenir des résultats précis et reproductibles.6. Au fil du temps, le conjugué à base d'IgG anti-humain peut changer de couleur s'il est exposé à lalumière. Ce changement de couleur n'affecte toutefois pas les performances du test.7. Il est recommandé de respecter strictement le protocole.Conditions de conservation1. Conserver tous les réactifs du kit entre 2 et 8 °C. Ne pas congeler. Les réactifs sont stables jusqu’àla date de péremption lorsqu'ils sont conservés et manipulés conformément aux instructions.2. Le tampon PBS II dilué est stable pendant 4 semaines lorsqu'il est conservé entre 2 et 8 °C.Prélèvement des échantillons• Ce test doit être réalisé avec des sérums comme échantillons. L’ajout d’azoture ou de conservateursaux échantillons de test peut fausser les résultats. Les échantillons ayant subi une contaminationmicrobienne et thermo-traités ou contenant des particules visibles ne doivent pas être utilisés. Leséchantillons de sérum lipémiques ou hémolysés grossièrement doivent être évités.• Après prélèvement, le sérum doit être séparé du caillot. Le document H18-A3 du CLSI (NCCLS)recommande de conserver les échantillons dans les conditions suivantes : 1) Conserver leséchantillons à température ambiante pendant 8 heures maximum. 2) Si le test n'est pas réalisé dansles 8 heures, réfrigérer l’échantillon entre 2 et 8 °C. 3) Si le test n’est pas réalisé dans les 48 heuresou si l’échantillon doit être transporté, le congeler à -20 °C ou moins. Bien agiter les échantillonsdécongelés après décongélation et avant le test.2

ProcédureMatériels fournisArticle fourniLames de substrat HEp-2 à 12 puitsConjugué à base d'IgG anti-humain et de FITC avec DAPIQuantité20 x 12 puits1 x 15 mLContrôle du profil de résultat final titrable des ANA1 x 0,5 mLContrôle négatif du système IFA1 x 0,5 mLConcentré de PBS II (40x)2 x 25 mLSupport pour préparations microscopiques1 x 7 mLLamelles 1 x 20Matériels supplémentaires requis mais non fournisMicropipettes permettant d'administrer un volume de 15-1000 µLEau distillée ou désioniséePissettes en plastique ou pipettes de PasteurChambre humideConteneur de 1 L (pour diluer le PBS II)Tube de CoplinMicroscope à fluorescence avec oscillateur à 495 nm et filtre à 515 nmMéthodeAvant de commencer1. Ramener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (20-26 °C) et bien mélanger.2. Diluer le concentré de PBS II : IMPORTANT : Diluer le concentré de PBS II selon un rapport1:40 en ajoutant le contenu du flacon de concentré de PBS II à 975 mL d’eau distillée oudésionisée et bien mélanger. Le tampon PBS II sert à diluer les échantillons de patient et detampon de lavage. Le tampon dilué peut être conservé jusqu'à 4 semaines entre 2 et 8 °C.3. Diluer les échantillons de patient :a. Dépistage initial : Diluer les échantillons de patient selon un rapport 1:40 avec un tamponPBS II dilué (ajouter 50 µL de sérum à 1,95 mL de tampon PBS II).b. Titrage : Pour tous les échantillons positifs, effectuer 2 dilutions en série à partir de ladilution de dépistage initiale avec un tampon PBS II dilué (1:80, 1:160, etc. 1:2560).Procédure de test1. Préparation des lames de substrat : Laisser la lame de substrat atteindre la températureambiante avant de la retirer de son sachet. L'étiqueter avec un marqueur et la placer dans unechambre humide adaptée. Ajouter 1 goutte (20-25 µL) de contrôles positif et négatif non diluésrespectivement dans les puits 1 et 2. Ajouter 1 goutte (20-25 µL) d'échantillon de patient diluédans les autres puits.2. Incubation des lames : Incuber la lame pendant 30 ± 5 minutes dans une chambre humide (uneserviette en papier humidifiée est placée a plat au fond d'un conteneur en plastique ou en verrefermé) pour maintenir des conditions d'humidité appropriées. Ne pas laisser le substrat sécherpendant la procédure de test.3. Lavage des lames : Après l’incubation, utiliser une pissette pll pour éliminer délicatement lesérum à l'aide d'un tampon PBS II dilué. Orienter la lame et appliquer le tampon PBS II de façonà limiter le débordement d’échantillons d’un puits à l’autre. Éviter de diriger le flux directementsur les puits pour ne pas endommager le substrat. Si nécessaire, placer les lames dans untube de Coplin contenant un tampon PBS II dilué pendant 5 minutes maximum.4. Ajout du conjugué fluorescent : Secouer le tampon PBS II pour éliminer tout excès. Remettrela lame dans la chambre humide et recouvrir immédiatement chaque puits d'une goutte deconjugué fluorescent. Incuber les lames pendant 30 ± 5 minutes supplémentaires.5. Lavage des lames : Répéter l’étape 3.3

6. Couverture à l'aide d'une lamelle : Les procédures de recouvrement varient d'un laboratoire àl'autre, mais la procédure suivante est recommandée :a. Placer une lamelle sur une serviette en papier.b. Appliquer un support pour préparations microscopiques sur une ligne continue au fond dela lamelle.c. Secouer le tampon PBS II pour éliminer l'excès et faire effleurer le bord inférieur de lalame avec le bord de la lamelle. Abaisser doucement la lame sur la lamelle de manière àce que le support pour préparations microscopiques s'écoule sur le bord supérieur de lalame sans que des bulles d'air ne se forment ou ne soient piégées.Contrôle de qualité• Le contrôle du profil de résultat final titrable des ANA et le contrôle négatif du système IFA doivent êtreappliqués sur chaque lame pour s'assurer que tous les réactifs et toutes les procédures fonctionnentcorrectement. D’autres sérums de contrôle adaptés peuvent être préparés en aliquotant des échantillonsde sérum humain poolés et en les conservant à < -70 °C. Pour que les résultats de test soient considéréscomme valides, tous les critères énumérés ci-dessous doivent être remplis. Si l’un d’eux ne l’est pas, lesrésultats de test doivent être considérés comme non valides et il devra être répété.1. Le contrôle du profil de résultat final titrable des ANA non dilué doit être supérieur à 3+.2. Le contrôle négatif du système IFA doit être négatif.Interprétation des résultats• Réaction négative. L'échantillon est considéré comme négatif si la coloration spécifique est égaleou inférieure au contrôle négatif du système IFA. Les échantillons peuvent révéler divers degrés decoloration de fond en raison d'anticorps hétérophiles ou d'auto-anticorps de faible niveau dirigéscontre des composants cytoplasmiques, tels que les protéines contractiles.• Réaction positive. L'échantillon est considéré comme positif si la coloration spécifique estsupérieure au contrôle négatif du système IFA.• Déterminer le degré de fluorescence ou l'intensité à l'aide des critères suivants :4+ Fluorescence vert pomme brillante3+ Fluorescence vert pomme claire2+ Fluorescence positive clairement distinctive1+ Fluorescence la moins spécifique permettant de distinguer clairement la coloration nucléaireet/ou cytoplasmique de la fluorescence de fond.Interprétation du profil.• Différents profils de coloration nucléaire et/ou cytoplasmique peuvent apparaître selon les typeset les quantités relatives d'auto-anticorps présents dans l'échantillon.Les types de profils de coloration suivants peuvent être observés :Homogène : Coloration homogène du noyau, avec ou sans masquage apparent des nucléoles.Antigènes nucléaires présents : ADN natif, ADN simple brin, histonesAssociation pathologique : Les titrages élevés sont indicateurs d'un LES, alors que des titragesfaibles suggèrent un LES ou d'autres pathologies du tissu conjonctif.Périphérique : Coloration homogène, principalement autour de la zone extérieure du noyau, avec unefaible coloration vers son centre.Antigènes nucléaires présents : ADN natif, ADN simple brin, DNP, histonesAssociation pathologique : Les titrages élevés sont indicateurs d'un LES, alors que des titragesfaibles suggèrent un LES ou d'autres pathologies du tissu conjonctif.Moucheté : Coloration fine et rugueuse du noyau, généralement sans coloration fluorescente desnucléoles.Antigènes nucléaires présents : Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B et d'autres systèmesd'antigène/anticorps pas encore caractérisés.Association pathologique : Les titrages élevés sont indicateurs d'un LES (anticorps Sm), d'unepathologie mixte du tissu conjonctif (anticorps RNP), d'une sclérodermie (anticorps Scl-70) oud'un complexe syndrome de Sjogren/de Creyx et Lévy (anticorps SS-B) ; les titrages faiblespeuvent suggérer d'autres pathologies du tissu conjonctif.Nucléolaire : Vaste coloration mouchetée et grossière dans le noyau, généralement inférieure à 6 ennombre par cellule, avec ou sans mouchetures fines occasionnelles.Antigènes nucléaires présents : ARN 4-6S et autres antigènes nucléaires inconnus.Association pathologique : Les titrages élevés sont prévalents dans le cadre de lasclérodermie et du syndrome de Sjogren.4

Références1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine.Advances in Immunology 33: 167-239, 1982.2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus.Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982.3. Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupuserythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964.4. Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence insystemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: 1333-1338, 1966.5. Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84:215-220, 1976.6. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for DiseaseControl/National Institute of Health, 2009Fabricant:INOVA Diagnostics, Inc.9900 Old Grove RoadSan Diego, CA 92131United States of AmericaTechnical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745Technical Service (Outside the U.S.) : 1 858-805-7950support@inovadx.comReprésentant Autorisé:Medical Technology Promedt Consulting GmbHAltenhofstrasse 80D-66386 St. Ingbert, GermanyTel.: +49-6894-581020Fax.: +49-6894-581021www.mt-procons.com628102FRA December 2012Revision 2NOVA Lite et INOVA Diagnostics, Inc. sont des marques déposées. Copyright 2012© Tous droits réservés6