ANNALES MASTERS 1 MAI 2006 / 2007

B. Sujet de TP/TD (D. Gérant) durée : 1hDes mitochondries ont été purifiées à partir de feuilles de tabacs transformés surexprimant l’alternative oxydase(AOX). Cette enzyme est une enzyme qui est régulée de deux manières indiquées dans l’encadré 1.1) L’AOX existe sous deux formes : dimèrique ou monomèrique (figure 1). Le passage à l’une ou l’autre formeest mis en évidence par incubation de mitochondries avec ou sans DTT (dithiothreitiol, réducteur) puisextraction protéique et Western Blot : electrophorèse puis transfert des protéines mitochondriales sur membraneet hybridation avec des anticorps spécifiques dirigés contre l’AOX (figure 2).2) Le pyruvate est un activateur allostérique de l’AOX (stabilise la forme active, figure 3).Encadré 1S S SH SHFigure 1+ DTT- DTTFigure 2Figure 3Des analyses ont été réalisées à partir de mitochondries extraites des feuilles de tabac.Dans l’encadré 2 sont présentées :Pour les figures 4 et 5, la même quantité de protéines mitochndriales a été ajoutée au milieu d’électrode(pH 7.2). Comme indiqué sur la trace, différents réactifs ont été ajoutés : NADH 2mM, ADP 1mM,Myxothiazol 16µM (myxo) composé ayant le même effet que le KCN, Pyruvate (Pyr) 1mM, DTT 10mM,Malate (Mal) + Glutamate (Glu) 10mM et N propyl gallate 100µM (nPG) composé ayant le même effet que leSHAM. Les chiffres le long des tracés représentent les vitesses d’oxydations en nmoles d’O2/min/mg protéines.La figure 6 correspond aux Western Blot obtenus à partir des protéines extraites de mitochondries incubéespendant 5 minutes avec soit du NADH 2mM soit un mélange Malate + Glutamate 10mM. L’hybridation a étéfaite avec des anticorps spécifiques dirigés contre l’AOX.Rappelez le rôle de chaque réactif ajouté pour les figures 4 et 5.Indiquez quelle forme de l’AOX est active.Quel est l’objectif de cette expérience et quelle hypothèse peut-on en tirer ? Argumenter avec lesrésultats présentés dans l’encadré 2.Par ailleurs, l’oxydation du malate est suivie à l’électrode à oxygène pour différents pH (encadré 3).Quel est l’objectif de cette deuxième expérience ? Argumenter votre réponse.3 de 4