ANNALES MASTERS 1 MAI 2006 / 2007

M.SVS.M1 GMC - UE M.SVS.2.030 Microbiologie moléculaire 1Session 1 – 1 h 30 (temps conseillé) - Sujet proposé par P. Leblond(Soyez succinct, les réponses doivent tenir sur une copie unique !)La maladie de Crohn (CD pour Crohn disease) est une maladie inflammatoire de l’intestin chez l’hommedont l’étiologie est inconnue. Cette maladie pourrait selon certaines hypothèses résulter, tout au moins enpartie, de la présence de bactériens pathogènes Escherichia coli. E. coli est anormalement présente chezles patients atteints de CD, et ces bactéries montrent des capacités d’adhésion à l’épithélium intestinal.Plus d’un tiers d’entre elles sont capables d’envahir cet épithélium et appartiennent à un nouveau grouped’E. coli appelées AIEC pour « adhérent-invasive E. coli » (souche LF82 dans ce travail). Chez lespatients infectés (35 à 55%), un fort niveau d’anticorps anti-OmpC, une protéine membranaire externe dela bactérie, est observé à la différence des individus qui ne présentent pas de symptômes (moins de 5%présentent ces anticorps). La forte réactivité immunologique à OmpC est une caractéristique des phasesde progression de la maladie, des phases évoluées de CD, et nécessite souvent une interventionchirurgicale. Les expériences qui suivent ont pour but d’évaluer le rôle d’OmpC et du facteur sigma σ Edans l’adhésion des bactéries E. coli aux cellules épithéliales humaines.Des mutants délétés du gène ompC ont été générés chez la lignée LF82 (AIEC). De plus, le gène ompC aété cloné en aval d’un promoteur inductible à l’arabinose porté par le vecteur pBAD24 pour donner leplasmide pPBI08. Des expériences d’adhésion-invasion des bactéries de différents contextes génétiquesont été réalisées sur des cellules intestinales humaines (Intestine-407) et les données sont présentées sur lafigure 1.Figure 1 : Test d’adhésion et d’invasion des lignées d’E. coli sauvage(WT ; LF82) et délétées pour ompC (∆ompC). La légende ∆ompC+ompC(∆ompC+pBAD24 correspond au témoin avec le vecteur vide) indique unecomplémentation de la souche délétée pour ompC par le plasmide pPBI08.En ordonnée, les valeurs relatives (« relative values ») indiquent le rapport(%) de bactéries associées aux cellules intestinales (barres noires) ou desbactéries intracellulaires (barres blanches) dans la lignée considérée parrapport à la souche sauvage LF82 (taux de 100%). Les barres marquées parune étoile indiquent les valeurs statistiquement différentes du témoinsauvage.Question 1 : Décrire succinctement une stratégie pour obtenir un mutant ∆ompC .Question 2 : Interprétez les données.Les pili de type I et les flagelles ont un rôle majeur dans la capacité de la souche LF82 à adhérer à etenvahir les cellules Intestine-407. L’expression de pili et de flagelles a été recherchée chez le sauvage etle mutant ∆ompC de LF82. Alors que chez le sauvage 71% des cellules sont flagellées, seulement 7% lesont chez le mutant. De même, 67% des cellules chez le mutant contre 99% chez le sauvage portent despili (type I). Les auteurs proposent deux hypothèses pour expliquer l’absence de pili chez les cellulesmutantes pour ompC : (i) l’abolition de l’expression des gènes codant les pili par un phénomène devariation de phase, (ii) l’absence de polymérisation des pili à cause de l’absence de la protéinemembranaire OmpC à la surface cellulaire.Les pili de type I sont codés par un gène dont l’expression dépend d’un segment d’ADN invertible sur lechromosome bactérien. L’inversion est stochastique (aléatoire), et contrôlée par l’expression d’uneinvertase (recombinase site-spécifique). L’orientation du segment d’ADN dans la population bactériennea été testée à l’aide d’un couple d’oligonucléotides (dont la localisation a été judicieusement choisie) dansune expérience de PCR (figure 2)..