LAPORAN AKHIR - KM Ristek

• LAPORAN AKHIR PROGRAM RISET INSENTIF 2010 (RIPP) PERAKITAN TRANSGENIK MANGGA VARIETAS GEDONG GINCU DAN TRANSGENIK DUKU VARIETAS KUPEH BERSIFAT SEEDLESS DENGAN EFISIENSI REGENERASI 50% DAN TRANSFORMASI 40% ~-Tim Peneliti : DR. RAGAPADMI PURNAMANINGSIH, MSi MIA KOSMIATIN, MSi ANNIVERSARI APRIANA, MSi BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN PERTANIAN BALAI BESAR PENELiTIAN DAN PENGEMBANGAN BIOTEKNOLOGI DAN SUMBERDAYA GENETIK PERTANIAN BOGOR JI. Tentara Pelajar no.3A. Kampus Penelitian Pertanian Cimanggu Bogor 16111 Telp. 0251 337975 Fax.0251 8338820 Email: bori:@indo.netid.biogen@Jitbang.deptan.go.id

LAPORAN AKHIR PROGRAM RISET INSENTIF 2010 (RIPP) PERAKITAN TRANSGENIK MANGGA VARIETAS GEDONG GINCU DAN TRANSGENIK DUKU VARIETAS KUPEH BERSIFAT SEEDLESS DENGAN EFISIENSI REGENERASI 50% DAN TRANSFORMASI 40% Tim Peneliti :DR. RAGAPADMI PURNAMANINGSIH, MSiMIA KOSMIATIN, MSiANNIVERSARI APRIANA, MSiBADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN PERTANIAN BALAI BESAR PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN BIOTEKNOLOGI DAN SUMBERDAYA GENETIK PERTANIAN BOGOR JI. Tentara Pelajar no.3A. Kampus Penelitian Pertanian Cimanggu Bogor 16111 Telp. 0251 337975 Fax.0251 8338820 Email: borif@indo.net.id . biogen@litbang.deptan.go.id

LEMBARAN IDENTITAS DAN PENGESAHAN 1. JUDUL PENELITIAN2. PROGRAM PENELITIANINSENTIF3. PROGRAM4. BIDANG5. TOPIK PENELITIAN6. PENELITI UTAMANAMA LEMGKAPJENIS KELAMIN7. LAMA PENELITIANTAHUN DIMULAITAHUN BERAKHIR8. SURAT PERJAJNJIANNOMORTANGGAL9. BIAYA TAHUN 2010Tahap 1(30%)Tahap " (50%)Tahap III (20%)Perakitan transgenik mangga varietas GedongGincu dan transgenik duku varietas Kupeh bersifatseedless dengan efisiensi regenerasi 50% dantransformasi 40%TAHUN KE IInsentif Riset TerapanKetahanan PanganRekayasa genetik mangga dan dukuDr. Ragapadmi Purnamaningsih: WANITA2010201379.7 /LB.620/l/2/20 10 25 Februari 2010 Rp. 165.000.000 Rp. 49.500.000 Rp. 82.500.000 Rp. 33.000.000 ----. KEPALA BALAI BESAR PENELITIAN DAN Bogor,30 November 2010PENGEMBANGAN BIOTEKNOLOGI DANSUiVtBERDAYA GENETIK PERTANIAN~ \ Dr. Karden Mulya---- ~IP.l96011091986031 002

RINGKASAN Buah mangga dan duku yang tidak berbiji atau ukuran bijinya kecil (seedless) dengandaging buah yang tebal akan mempunyai nilai komersial yang lebih tinggi dibandingkanbuah manggis dan durian yang mempunyai biji. Untuk menghasilkan buah seedlessdapat dilakukan melalui persilangan konvensional, aplikasi hormon, mutasi genetik ataubioteknologi. Pendekatan melalui metoda bioteknologi mempunyai peluang keberhasilanyang lebih tinggi apabila gen yang dapat menginduksi pembentukan buah seedlesstersedia. Gen defH9-iaaM menyandi pembentukan enzim triptofan monooksigenaseyaitu katalisator dalam biosintesis 1M, sedangkan promoter defH9 akan mengarahkanekspresi gen tersebut secara spesifik pada bagian ovul. Ekspresi gen pada bag ian bakalbuah dapat menginduksi pembentukan buah tanpa te~adinya pembuahan sehinggadihasilkan buah partenokarpi, yang kualitasnya lebih baik dibandingkan dengan buahhasil persilangan. Penelitian pada tahun I (2010) terdiri atas tiga kegiatan, yaitu : 1)Mikropropagasi mangga melalui kultur in vitro, 2) Mikropagasi tanaman duku melaluikultur in vitro, dan 3) Inisiasi rekayasa genetik mangga dan duku dengan menggunakangen gus Metoda inokulasi yang akan digunakan adalah dengan cara merendameksplan dalam larutan bakteri selama 15 - 30 menit dengan menggunakanasetosiringone 100 dan 200 uM. Uji histokimia dengan gen gus akan dilakukan untukmengetahui efektivitas metoda transformasi gen yang akan diterapkan pada kedua jenistanaman. Hasil penelitian hingga saat ini menunjukkan bahwa respon pembengkakaneksplan tertinggi diperoleh dengan menggunakan eksplan buah mangga dengan ukuran2 - 3.5 cm . Penggunaan 2,4-0 pada media MS atau Gamborg (B5) dapat menginduksipembengkakan eksplan mangga. Penambahan BA 5 mg/l memberikan responpembengkakan eksplan yang lebih baik daripada tanpa penambahan BA. Pembentukankalus dan struktur embriosomatik mangga tertinggi diperoleh dengan menggunakanmedia (B5)+ 2,4-030 +sukrosa 6% + charcoal 2.5 g/1. Untuk tanaman duku, biji yangdipotong menjadi dua bagian meghasilkan tunas yang lebih banyak daripada biji yangdipotong menjadi tiga bagian. Penggunaan GA3 pad a media MS yang mengandung BAlebih baik dalam induksi tunas duku daripada tanpa penambahan GA3.Penambahanthidiazuron 0.1 mg/l dan GA3 5 mg/l pada media tumbuh duku menghasilkan jumlahtunas yang lebih banyak daripada penambahan thidiazuron 0.1 mg/l tanpa GA3 5 mg.Penggunaan 2,4-0 lebih baik daripada picloram dalam menginduksi pembentukan kalusduku. Metoda transformasi terbaik adalah perendaman kalus selama 15 men it dalamlarutan bakteri serta kokultvasi kalus selama 9 hari dalam media regenerasi yangmengandung asetosiringon 100 uM.kata kunci : mangga, duku, rekayasa genetik, partenokarpiii

PRAKATA Laporan Penelitian yang berjudul " Perakitan transgenik mangga varietasGedong Gincu dan transgenik duku varietas Kupeh bersifat seedless dengan efisiensiregenerasi 50% dan transformasi 40%. Penelitian ini merupakan kegiatan tahun I yangdidanai oleh Kementrian Riset dan Teknologi, melalui Program Riset Insentif untukPeneliti dan Perekayasa, Tahun Anggaran 2010. Penelitian terdiri atas 3 kegiatan yaitu :1) Mikropropagasi mangga melalui kultur in vitro, 2) Mikropagasi tanaman duku melaluikultur in vitro, dan 3) Inisiasi rekayasa genetik mangga dan duku dengan menggunakangen gus.Tim yang terlibat dalam penelitian mengucapkan terima kasih kepada KepalaBalai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya GenetikPertanian atas segala arahan dan dukungannya dalam pelaksanaan penelitian ini sertakepada Kementrian Riset dan Teknologi yang telah yang telah membiayai penelitian ini.Segala saran dan kritik yang positif sangat kami harapkan untuk mendapatkanhasil yang lebih baik. Semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi yangmenggunakannya.Bogor, 12 November 2010iii

.. 10.DAFTARISIHalaman Lembar Identitas dan pengesahan ... ..... ...... ..... ..................... .. .... ... ...... ... .... ... i Ringkasan ... ......... ......... ... .. ... ................................. ...... ................... ........ ....... . ii Prakata ..... .. .............. .. ... ........ .. .... ....... ... ..... .. ......... .. .......... .......... ... .. .. ..... .... .... iii Daftar lsi .......................... ...... ... ..... ...... ...... ..... .. .............................. ...... ........... iv Daftar Tabel ......... ...... .. ... ... ............ ... ... ... .... .. ... ..... ........ ........ .. ....... ...... ..... ....... v Daftar Gambar ........ ... ..................... ... ........... ................. .. .. .. ....... .. .... .. .. ........... vi Bab I. Pendahuluan...... ..... ........ ... ...... ... .......... ... ... ...... .. .. .... .... .......................... 1 Bab II. Tinjauan Pustaka ..................................... .......... ..... ............................. 3 Bab III.Tujuan dan Manfaat .. .. ..... ......................... ........ ............ ....... ................ 6 Bab IV. Metodologi ...... ........ .. .... ..... ........ .. ..................... ........ ....... .. ... .............. 6 4.1. Waktu dan Tempat ...... ................... ........... ......... ... .. ........ .. ....... 6 4.2. Pelaksanaan Kegiatan ........................... ............ ....................... 6 4.2.1. Mikropropagasi mangga melalui kultur in vitro ..................... .. .. ... . 6 4.2.2. Mikropropagasi tanaman duku melalui kultur in vitro .... ... .... ... ... .... 7 4.2.3. Inisiasi rekayasa genetic mangga dan duku dengan gen gus ..... .. . 8 Bab V. Hasil dan Pembahasan ...................................... ... ... ................... .. ...... 9 5.1. Mikropropagasi mangga melalui kultur in vitro ..... ...... ... .... ... ..... ... .. 11 5.2. Mikropropagasi tanaman duku melalui kultur in vitro ....... ................. 15 5.3 . . Inisiasi rekayasa genetic mangga dan duku dengan gen gus ............ 18 Bab VI. Kesimpulan dan Saran ................................... .. .. .. ......................... .. .. 20 Daftar Pustaka .. .. .... .. ............. ....... .. .. ............ ....... .. ............. .. ... ....... ..... ...... ..... 21 iv

.. ih".DAFTAR TABElTabel1Tabel2Tabel3Tabel4Penggunaan jenis media dasar dan BA dalam induksitunas manggaRespon buah muda mangga pada berbagai formulasimediaPembentukan kalus dari buah muda mangga dariberbagai ukuranPertumbuhan eksp/an pad a berbagai formulasi mediaHalaman10111213Tabel5 Pertumbuhan eksplan pada berbagai formulasi media 14Tabel6 Pengaruh pemotongan biji terhadap induksi tunas duku 15Tabel7Tabel 8Penggunaan BA dan GA3 dalam induksi tunas duku,umur 5 mingguPengaruh penggunaan BA, GA3 dan thidiazuron dalammultiplikasi tunas duku, umur 5 minggu1616Tabel9Induksi kalus duku dari eksplan daun pada berbagaiformulasi media, umur 6 minggu17Tabel 10Induksi kalus duku dari eksplanformulasi media, umur 4 minggubiji pada berbagai 18Tabel11 Hasif uji gus kalus mangga 19Tabel 12 Hasif uji gus kalus duku 19v

·~.DAFTAR GAM BARHalamanGambar 1 Induksi tunas mangga 10Gambar 2 Eksplan buah muda mangga 11Gambar 3Respon eksplan mangga pada media denganpenambahan 2,4-D12Gambar4 Pembentukan struktur embriosomatik mangga 15Gambar 5 Induksi tunas duku pada berbagai formulasi media 16Gambar 6 Induksi kalus duku dari eksplan daun 17Gambar 7 Induksi kalus duku dari eksplan biji 18Gambar 8 Uji gus kalus mangga 19Gambar 9 Uji gus kalus duku 19vi

BABI. PENDAHULUAN Mangga dan duku merupakan tanaman hortikultura unggulan yang sangatdigemari. Permintaan buah-buahan tersebut meningkat setiap tahun terutama untukbuah dengan kualitas yang baik. Diperkirakan konsumsi buah akan meningkat 34,5%pada tahun 2010 dan 44,5% pada tahun 2015 (Deptan, 1992 dalam Bank Indonesia,2007) sehingga konsumsi buah-buahan di Indonesia akan mencapai 20.000 ton padatahun 2015.Duku (Lansium domesticum Corr.) berasal dari daerah barat Asia Tenggara,yaitu Indonesia, Malaysia, dan Thailand . Tanaman ini dikenal pula dengan namalangsat, langsep, dan kokosan. Manfaat utama tanaman duku adalah sebagai makanansegar atau makanan olahan. Duku banyak mengandung fosfor, kalsium dan zat besi.Semakin terbukanya pasar global, menyebabkan persaingan buah-buahan lokaldengan buah impor semakin tinggi, sehingga kualitas buah lokal harus ditingkatkan.Kualitas buah ditentukan antara lain oleh : rasa, ketebalan daging buah , warna, aroma,serta ada atau tidaknya biji didalam buah. Buah tanpa biji atau buah dengan bijikecillsedikit (seedless fruit) mempunyai nilai ekonomis yang lebih tinggi dibandingkandengan buah yang mempunyai biji besarfbanyak (Vardi, 1996). Hal ini disebabkankarena buah tanpa biji lebih mudah dimakan, dan biasanya buah tanpa biji mempunyairasa yang lebih manis. Banyak kultivar dengan karakteristik yang diinginkan ternyatatidak mempunyai nilai ekonomis yang tinggi karena adanya biji dalam buah (Fatta-Del­Bosco et al., 1992).Dalam reproduksi tanaman normal, suatu buah terbentuk hanya setelah bemasilterjadinya pembuahan yang menyebabkan terbentuknya biji dan pembentukan Jaringanbuah di sekeliling biji. Proses pembentukan buah sangat tergantung dan dipengaruhioleh kandungan hormon yang dihasilkan oleh biji. Beberapa spesies tanamanmempunyai kemampuan untuk membentuk buah walaupun tidak terjadi penyerbukandan pembuahan. Buah yang terbentuk tidak mempunyai biji atau disebut dengan buahpartenokarpi (seedless) . Menurut Varoquaux et al., (2000), tanaman digolongkansebagai seedless jika tanaman tersebut dapat menghasilkan buah yang tidakmempunyai biji, biji terbentuk tetapi akhimya gugur, dan jika jumlah biji didalam buahberkurang. Perbedaan klasifikasi tersebut tergantung kepada waktu dimanapembentukan dan perkembangan biji terganggu.1

Partenokarpi dapat terjadi secara alami (genetik) dan dapat diinduksi (buatan).Partenokarpi dapat te~adi secara alami pada beberapa buah-buahan yang disebabkanoleh faktor genetik, antara lain pad a pisang dan semangka, namun buah partenokarpiyang terjadi secara alami biasanya tidak mempunyai kualitas buah yang baik.Partenokarpi buatan juga dapat dilakukan dengan mengaplikasikan hormon (auksin ataugiberelin) pada bakal buah, akan tetapi metoda tersebut membutuhkan biaya yang tinggidan tenaga kerja yang banyak.Dengan semakin berkembangnya bioteknologi, maka semakin terbuka peluanguntuk mendapatkan tanaman dengan sifat tertentu yang diinginkan, antara lainmendapatkan tanaman yang mempunyai buah partenokarpi tanpa merubah karakterkarakterlainnya. Perakitan buah mangga dan duku seedless dapat dilakukan melaluirekayasa genetik dengan menyisipkan gen DefH9-iaaM kedalam genom tanaman. Gentersebut menyandi pembentukan enzim triptofan monooksigenase yang berfungsisebagai katalisator dalam pembentukan hormon indole acetitic acid (lAA), yaitu salahsatu hormon yang berperan dalam pembentukan buah.Rotino et al. (1997) telah berhasil mengembangkan suatu metode baru agartanaman mampu menghasilkan buah tanpa terjadinya penyerbukan dan pembuahanmelalui rekayasa genetika dengan mengintroduksikan gen DefH9- iaaM yang dapatmeningkatkan kandungan auksin pad a sel-sel bakal buah, khususnya pada bag ian ovuldan plasenta. Kandungan auksin pad a bagian tersebut akan meningkat karena ekspresidari gen yang disisipkan, sehingga dapat menstimulasi pembelahan dan pembesaransel-sel bakal buah sehingga akhirnya dihasilkan buah yang biasanya tidak mempunyaibiji atau bijinya kecil/berkurang(seedless). Buah partenokarpi biasanya mempunyai rasayang lebih manis karena kandungan auksin yang tinggi di dalam bakal buah dapatmenarik unsur hara didalam tanaman kedalam bakal buah sehingga buah menjadi lebihmanis.Pembentukan buah partenokarpi selain bermanfaat untuk meningkatkan kualitasbuah, juga dapat meningkatkan produktivitas, sehingga kontinuitas produksi akanterjaga. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa introduksi gen DefH9- iaaMdapat meningkatkan kualitas dan produksi buah pada tanaman tomat, terong , danstrawberi (Mazzucato, et aI, 1998; Pandolfini et al. , 2002; Mezzetti et al., 2004) .Salah satu faktor yang menentukan untuk memperoleh tanaman transgenikadalah adanya sistim transformasi yang optimal. Hal ini dapat dikembangkan apabilafaktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi dikondisikan secara2

optimal. Beberapa faktor yang menentukan keberhasilan transformasi khususnyatransformasi secara tidak langsung melalui vektor Agrobacterium diantaranya adalahjenis dan perkembangan jaringan yang akan diinfeksi, genotipe, jenis vektor, strainAgrobacterium, gen penanda seleksi yang efisien, penambahan zat pengatur tumbuhselama ko-kultivasi, media ko-kultivasi , lamanya periode ko-kultivasi , penambahanasetosiringone, waktu inkubasi serta metoda regenerasi tanaman yang efisien (Hiei etal. 1997). Oleh karena itu sebelum dilakukan transformasi genetik pad a tanamanmangga dan duku, perlu dikuasai terlebih dahulu metoda regenerasi dari tanamantersebut.Regenerasi mangga secara in vitro melalui embriogenesis somatik telahdilakukan oleh Jana et aI. , (1994), Lilian et al., (2001), Laxmi et al. , (2004) dan Krishnaet aI., (2008). Keempat peneliti tersebut menggunakan varietas mangga yang berbeda,dan ternyata formulasi media yang digunakan juga berbeda. Menurut Raghuvanshi danSivastava (1994) dan Krishna et al., (2008) keberhasilan kultur in vitro mangga, antaralain dipengaruhi oleh persentase nekrosis pad a eksplan dan pencoklatan pada media,dim ana keduanya dapat menghambat pertumbuhan eksplan pada media kultur in vitro.Menurut Laxmi et aI., (2004) penggunaan media dasar dengan kandungan amoniumyang rendah lebih baik dalam menginduksi pembentukan kalus. Berlainan denganmangga, nampaknya upaya regenerasi duku melalui teknik kultur in vitro belum banyakdilakukan. Untuk itu pertu dicoba berbagai formulasi media untuk meregenerasikan dukumelalui kultur in vitro.BAB II. TINJAUAN PUST AKAKonsumsi buah masyarakat Indonesia meningkat setiap tahunnya. Meningkatnyakonsumsi buah-buahan menunjukkan peningkatan pengetahuan gizi masyarakat akanpentingnya vitamin dan mineral. Buah-buahan juga merupakan sumber serat pangan(dietary fibre) yang sangat berguna bagi kelancaran proses pencernaan makanan didalam tubuh manusia, sehingga sangat bermanfaat untuk mencegah berbagai penyakitdegeneratif, seperti diabetes mellitus, jantung koroner, hipertensi, stroke, dan kanker.Semakin terbukanya perdagangan global menyebabkan impor buah-buahan dariluar negeri semakin besar. Angka impor buah Indonesia pada tahun 2008 mencapai230.000 ton (Anonim, 2009). Hal ini disebabkan karena kualitas buah dari luar negeriyang jauh lebih baik, antara lain daging buah yang tebal, tidak adanya biji dalam buah ,serta rasa yang lebih manis. Hal ini semakin diperburuk dengan kontinuitas pasokan3

uah dalam negeri yang tidak stabil dengan kualitas yang kurang terjamin. Untukmemenuhi kebutuhan buah dalam negeri, pemerintah berusaha meningkatkan produksibuah-buahan dengan cara mengembangkan agribisnis buah-buahan. Namunpeningkatan produksi saja tidaklah cukup tanpa dibarengi dengan peningkatan mutubuah-buahan (http : humas@bi.go.id , 2009).Prospek pengembangan buah-buahan di Indonesia masih terbuka luas. Tingkatkonsumsi buah di Indonesia baru sekitar 40 kg per kapita per tahun , sementara standarminimal FAO 60 kg per kapita per tahun, maka peluang pasar itu masih sangat besar.Mangga dan duku merupakan buah-buahan yang bernilai ekonomi tinggi dan potensialuntuk dikembangkan.Mangga (Garcinia mangostana Linn .) merupakan buah tropis musiman yangpenting (Suwarno, 2008). Namun demikian, tanaman mangga masih belum banyakditeliti. Tantangan utama dalam pengembangan mangga adalah meningkatkan produksibuah. Penyediaan bahan tanaman yang seragam dalam jumlah besar merupakan dasaryang tepat untuk melakukan terobosan dalam meningkatkan produktivitas (Verheij et ai,1992 dalam Suwarno, 2008).Kesulitan yang dihadapi dalam pemuliaan mangga adalah sedikitnya jumlahbenih yang diperoleh, tingkat kesuksesan yang rendah dalam penyerbukan, penurunankualitas buah yang berlebihan, siklus hidup yang panjang, dan problema-problemalainnya. Pemuliaan mangga bertujuan untuk membentuk kultivar yang berbuah setiaptahun, memiliki ukuran pohon yang rendah, memiliki buah yang menarik serta memi likikualitas buah yang baik (Verheij et al., 1992 dalam Suwarno, 2008) .Duku merupakan tanaman buah yang berasal dari Indonesia, banya!"\digemari karena rasanya yang enak. Sama halnya dengan tanaman mangga, tanamar:duku belum ban yak diteliti karena beberapa faktor, antara lain siklus hidupnya yangpanjang. Salah satu masalah dalam pengembangan duku, adalah adanya biji didalambuah . Biji tersebut apabila tergigit akan terasa pahit, sehingga sang at mengganggu.Oleh karena itu upaya pemuliaan untuk mendapatkan buah duku yang tidak berbiji perludilakukan.Dari data-data tersebut diatas, terlihat bahwa untuk meningkatkan daya saingbuah , maka diperlukan buah dengan kualitas yang baik (antara lain rasa , ketebalandaging buah , dan biji) , selain produksi buah yang harus stabil. Buah yang tidak berbiji(seedless fruit) sangat digemari, karena mudah untuk dimakan, dan mempermudahproses pengolahan.4

Buah partenokarpi adalah buah yang dihasilkan tanpa terjadinya fertilisasi pad aovari (bakal buah) sehingga biasanya buah yang dihasilkan tidak mempunyai biji ataubijinya keeil. Buah partenokarpi dapat dihasilkan seeara alami atau diinduksi denganmenggunakan mutagen, persilangan, zat pengatur tumbuh atau rekayasa genetikdengan menginsersikan gen tertentu. Induksi buah partenokarpi dapat meningkatkanproduksi buah, meningkatkan keseragaman pembentukan buah sehingga dapatmenjaga kontinuitas produksi buah, serta meningkatkan kualitas buah. Sekitar 20prod uk pertanian hasil modifikasi genetik telah beredar di pasaran Amerika, Kanada,bahkan Asia Tenggara. Dalam enam tahun ke depan, berbagai perusahaan telahmenyiapkan 26 produk Jainnya, mulai dari kedelai, jagung, kapas, padi hingga stroberi(Gusyana, 2007).Heuvelink dan Korner (2001) melakukan penelitian untuk menginduksipembentukan buah partenokarpi pada tanaman sweet pepper dengan menggunakanauksin. Hasil penelitian mereka menunjukkan bahwa penyemprotan denganmenggunakan auksin dapat menginduksi pembentukan buah per nodus dengan variasiyang lebih kecil (21-55%) dibandingkan tanaman kontrol (45 -57%), dengan rata-rataberat buah yang lebih besar pad a buah partenokarpi.Penerapan teknik rekayasa genetik dengan introduksi gen DefH9-RI-iaaMmerupakan teknologi alternatif yang dapat diterapkan untuk menginduksi pembentukanbuah tanpa biji /partenokarpi (seedless). Gen iaaM diisolasi dari bakteri patogenPseudomonas syringae pv. Savastanoi, yang menyandi pembentukan enzim triptofanmonooxigenase yang berperan dalam pembentukan IAA, sedangkan promotor DefH9yang diisolasi dari Anthirrhinum majus akan mengarahkan ekspresi gen seeara spesifikdi dalam ovari khususnya pada ovul dan plasenta (Pandolfini et al., 2002). Koltunow etal., (1995) telah berhasil merakit tanaman jeruk transgenik dengan menginsersikan genyang dapat menurunkan pembentukan biji melalui transformasi genetik menggunakan A.tumefaciens.Salah satu faktor yang menentukan untuk memperoleh tanaman transgenik adalahadanya sistim transformasi yang optimal. Hal ini dapat dikembangkan apabila faktorfaktoryang mempengaruhi keberhasilan transformasi dikondisikan seeara optimal.Beberapa faktor yang menentukan keberhasilan transformasi khususnyatransformasi seeara tidak langsung melalui vektor Agrobacterium diantaranya adalahjenis dan perkembangan jaringan yang akan diinfeksi, genotipe, jenis vektor, strainAgrobaeterium, gen penanda seleksi yang efisien, penambahan zat pengatur tumbuh5

·~.selama ko~kultivasi . media ko~kultivasi , lamanya periode ko-kultivasi, penambahanasetosiringone, waktu inkubasi serta metoda regenerasi tanaman yang efisien (Hiei et8/. 1997). Oleh karena itu sebelum dilakukan transfiormasi genetik pada tanamanmangga dan duku, maka perlu dikuasai terlebih dahulu metoda regenerasi dari tanamantersebut.BAB III. TUJUAN DAN MANFAATTujuan akhir dari penelitian ini adalah mendapatkan galur harapan mangga danduku tidak berbiji atau ukuran biji ked dengan daging buah yang tebaL Galur yangdiperoleh, setelah melalui uji keamanan hayati dan keamanan pangan, maka dapatdigunakan oleh petani atau dapat digunakan sebagai tetua untuk pembentukan varietasmangga dan duku dengan karakter yang lain. Adapun tujuan penelitian tahun 2010adalah untuk mendapatkan metoda induksi tunas ganda dan induksi kalus embriogenikmangga, induksi tunas dan induksi kalus duku serta mendapatkan metode transformasipada kalus mangga dan duku dengan menggunakan gen gus.BAB IV. METODOLOGI4.1. Waktu dan TempatPercobaan dilakukan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologidan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor.4.2. Pelaksanaan KegiatanPenelitian terdiri atas tiga tahapan kegiatan, yaitu :4.2.1. Mikropagasi mangga melalui kultur in vitroInduksi dan penggandaan tunas secara lang sung dengan menggunakan mata tunasterminal atau lateralVarietas mangga yang digunakan adalah gendong gincu. Untuk mendapatkan tunasyang steril dilakukan isolasi dan sterilisasi batang dari pohon induk di rumah kaca.Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan alkohol, kloroks dan betadin . Perlakuan yangdigunakan untuk menginduksi pertumbuhan tunas dari pohon induk di rumah kacaadalah jenis media dasar (MS dan WPM) dengan penambahan BA (2 dan 5 mgll).Setelah diperoleh tunas, maka tunas in vitro dipindahkan pad a media untuk memacumultiplikasi dari tunas tersebut. Media yang digunakan adalah jenis media dasar terbaik6

dengan ditambahkan BA atau zeatin pada konsentrasi 2 mg/l dan thidiazuron padakonsentrasi (0 dan 0.5 mgtl). Sub kultur dilakukan setiap bulan, hingga diperoleh tunasin v;tro dengan faktor multiplikasi yang tinggi.Peubah yang diamati adalah waktu terbentuknya tunas, jumlah tunas, tinggi tunas,jumlah daun, dan visual tanaman. Raneangan pereobaan yang digunakan adalahraneangan aeak lengkap dengan sepuluh ulangan.Induksi kalus embriogenik manggaVarietas mangga yang digunakan adalah mangga gedong gineu. Bahan tanamanyang digunakan adalah jaringan nueellus dari buah muda berumur 4-6 minggu setelahpembuahan. Buah muda dieuei dengan air mengalir, kemudian dengan sabun, danselanjutnya dieuei kembali dengan air mengalir. Buah muda disterilisasi dengan bahanbahansterilan (alkohol, kloroks, dan betadin) sehingga diperoleh buah yang steril. Buahdipotong seeara longitudinal dan ovul dipotong seeara longitudinal pula. Selanjutnyaovul yang sudah terbelah ditanam pad a media tumbuh dengan bagian nueellusnyamenyentuh media.Induksi kalus dilakukan dengan menggunakan media dasar MS (1, ~ ) dan Gamborg(B5) (1, ~) dengan penambahan zat pengatur tumbuh 2,4-0 dengan konsentrasi (1 -5mgtl) dengan penambahan BAP (0 dan 5 mgtl) dan sukrosa 6%. Media dipadatkandengan penambahan 0.8% agar. pH media dibuat 5.8 dengan menggunakan 0.1 NNaOH atau 0.1 N HCI sebelum autoelaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psiselama 15 menit. Kultur diinkubasi dalam keadaan gelap pada suhu 25°C hinggaterbentuk kalus.Induksi embriosomatik dilakukan dengan memindahkan kalus pada fo las"media dasar terbaik untuk induksi kalus dengan penambahan BAP (3 dan 5 m Subkultur dilakukan setiap 2 minggu hingga terbentuk struktur embriosomatlk tahap awa LPeubah yang diamati adalah persentase pembentukan kalus, persentasepembentukan struktur embriosomatik, jumlah struktur embriosomatik yang terbentuk,serta visual eksplan. Raneangan pereobaan yang digunakan adalah aeak lengkapdengan sepuluh ulangan.4.2.2. Mikropagasi tanaman duku melalui kultur in vitroInduksi dan multiplikasi tunas in vitroBahan tanaman yang digunakan adalah biji dari buah masak (mature embrio) darivarietas duku Kupeh. Biji disterilisasi dengan bahan-bahan sterilan (alkohol, kloroks, dan7

etadin) sehingga diperoleh biji yang steril. Biji dipotong menjadi 2 -3 bag ian danditanam pada media MS dengan penambahan BA (1, 3, 5 mgJI) + GA3 (0 dan 5 mgJI)dan PVP 300 mg/I untuk menginduksi pembentukan tunas. Media dipadatkan denganpenambahan 0.8% agar. pH media dibuat 5.8 dengan menggunakan 0.1 N NaOH atau0.1 N HCI sebelum dipanaskan dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psiselama 15 menit. Kultur diinkubasi pada suhu 25°C hingga terbentuk tunas.Setelah diperoleh tunas in vitro, maka tunas yang dihasilkan dipindahkan pad amedia MS dengan penambahan BA ( 1 - 2 mgJI), thidiazuron (0.2 dan 0.5 mgJI) dan PVP300 mgJI untuk menginduksi multiplikasi hingga diperoleh tunas yang banyak. Botolditempatkan pad a rak kultur dengan penyinaran selama 16 jamJhari, dengan intensitascahaya 1000 lux. Rancangan percobaan yang digunakan adalah aeak kelompok dengan15 ulangan.Induksi dan regenerasi kalusInduksi kalus dilakukan dengan menggunakan daun in vitro. Daun dipotong-potongdengan ukuran 0.5 x 0.5 em Formulasi media yang digunakan adalah MS denganpenambahan 2,4-0 atau picloram (0, 2, 4 dan 8 mgJI). Botol ditempatkan pada kondisigelap didalam ruangan dengan suhu 20 - 22°C. Sub kultur dilakukan setiap bulan padamedia yang sama sehingga terbentuk kalus. Peubah yang diamati adalah waktuterbentuknya kalus, struktur kalus, warna kalus, serta visual kalus. Kalus denganstruktur yang remah dipindahkan pada media regenerasi. Formulasi media yangdigunakan adalah MS + BAP (0.1 atau 1 mg/I) dengan penambahan GA3 3 mg/I. Peubahyang diamati adalah waktu terbentuknya tunas, jumlah tunas, jumlah daun, dan panjangtunas. Raneangan pereobaan yang digunakan adalah aeak lengkap dengan 15 ulangan.4.2.3. Inisiasi rekayasa genetik mangga dan duku dengan menggunakan gen gusSebelum melakukan transformasi gen kedalam tanaman, sebaiknya metodatransformasinya sudah dikuasai. Pada pereobaan ini akan dilakukan metodapendahuluan untuk mengetahui efektivitas metoda transformasi gen yang akanditerapkan pad a kedua jenis tanaman diatas. Untuk itu akan diuji penggunaan gen guspad a tanaman mangga dan duku.Bahan tanaman yang digunakan adalah kalus yang diperoleh dari pereobaan Idan II. Metoda inokulasi yang digunakan adalah dengan eara eksplan direndam dalamdalam suspensi bakteri selama 15 dan 30 menit.8

Metode Pengujian ekspresi gen Gus (Jefferson et aI, 1987).Pembuatan larutan X-Gluc : 90 ml 0,1 M buffer phosphat pH 7.7 93.60 mg X-Glue (konsentrasi final 2 mM)14.85 mg Potassium Ferrieyanide (konsentrasi final 0.5 IJM)334.80 mg Sodium EDTA (konsentrasi final 10 mM)90 IJI Triton X-100 (konsentrasi final 0.1%)Prosedur pengujian :Eksplan atau jaringan tanaman yang akan diuji, direndam dalam larutan X-Gluedan diinkubasi pada suhu 37°C selama 5 jam atau semalam tergantung pada intensitaspewarnaan. Kemudian eksplan dieuei dalam etanol 70% untuk melarutkan klorofil dandisimpan pada suhu 4°C. kemudian dipindahkan pada media kokultivasi selama 9 hari.Selanjutnya eksplan dipindahkan pada media regenerasi yang sudah diberiasetosiringon 100 dan 200 uM. Pengamatan ada tidaknya spot biru dapat dilakukansecara visual atau melalui mikroskop.BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN5.1. Mikropagasi mangga melalui kultur in vitroInduksi dan penggandaan tunas secara langsung dengan menggunakan mata tunasterminal atau lateralTujuan dari percobaan ini adalah menginduksi pembentukan tunas ganda agardiperoleh daun in vitro yang akan digunakan sebagai bahan tanaman untuk diinduksiagar membentuk kalus yang akan digunakan untuk tahap percobaan transformasigenetik. Hasil penelitian hingga saat ini menunjukkan bahwa sangat sulit untukmendapatkan eksplan yang steril karena kontaminasi yang sangat tinggi yangdisebabkan oleh jamur dan bakteri. Untuk meningkatkan keberhasilan sterilisasi, makadilakukan pemangkasan berulangkali dari pohon induk di rumah kaca agar diperolehtanaman yang juvenil (muda). Dengan metoda ini, upaya memperoleh eksplan yangsteril dapat ditingkatkan.Faktor lain yang menghambat pertumbuhan eskplan adalah produksi fenol yangberlebihan dari eksplan. Untuk mengantisipasi hal tersebut telah digunakan penggunaanpolivinil pirolidon (PVP) hingga 500 mg/l dan charcoal 2,5 gIl.Menurut Krishna danSingh (2006) beberapa masalah yang dihadapi dalam kultur in vitro mangga adalah9

eksudasi fenol, pencoklatan media, browning pada eksplan, serta kontaminasi biji yangbersifat sistemik. Raughuvanshi dan Srivastava (1995) menyatakan bahwa tingginyaeksudasi fenol disebabkan karena aktifnya sistim enzim oksidatif pad a saat persiapaneksplan. Selanjutnya Krishna dan Singh (2006) menyatakan bahwa infeksi laten olehjamur telah dilaporkan disebabkan antara lain Alternaria alternata, Col/etotrichum spp.,Dothiorella spp. dan Fusarium subglutinans.Setelah dilakukan berulangkali sterilisasi eksplan, akhirnya diperoleh eksplanyang steril, namun demikian ternyata pertumbuhan eksplan tersebut sangat lambat(Tabel1 dan Gambar 1).Tabel 1. Penggunaan jenis media dasar dan BA dalam induksi tunas manggaFormulasi media (mg/l) Jumlah tunas Tinggi tunas (em)MS + BA 2 1 2.3MS + BA 5 1 3.0WPM + BA2 1 2.5WPM + BA 5 2 3.4Dari tabel diatas terlihat bahwa nampaknya penggunaan media dasar WPM lebihbaik daripada MS dalam menginduksi pertumbuhan tunas mangga. Demikian puladengan konsentrasi BA yang digunakan, dimana BA dengan konsentrasi 5 mg/I lebihbaik dalam menginduksi penggandaan tunas mangga daripada BA 2 mg/l.Gambar 1. Induksi tunas manggaInduksi kalus embriogenik manggaInduksi kalus embriogenik dilakukan dengan menggunakan buah muda, berukurandiamater 1 - 4 em (Gambar 2). Respon buah tersebut pada berbagai formulasi mediadisajikan pada Tabel 2.10

Tabel 2. Respon buah muda mangga pada berbagai formulasi mediaBengkakJI(%)Media(mg/l)Kalus(%)Tidakrespon (%)% MS+2,4-01 28.52 0 71,43 14,86% MS+2,4-03 25,00 0 25,00 50,00% MS+2,4-05 40,00 0 10,00 50,00% MS+2,4-01 +BA5 29.50 0 50.50 30 .00% MS+2,4-03+BA5 30 .10 0 49,90 24.00% MS+2,4-05+BA5 45.12 0 54.88 22.50MS+2,401 33,33 0 56.67 66,67MS+2,403 40,00 20,00 40,00 20,00MS+2,405 14,29 0 45,21 14,29MS+2,401+BA5 42,86 0 37,14 12.40MS+2,403+BA5 40,00 0 60,00 24.50MS+2,405+BA5 76,47 0 23,53 11.401/2B5+2,401 25,00 0 45.00 30.001/2B5+2,4-03 25,00 0 12,50 62,501/2B5+2,4-05 57,14 0 14,29 28,571/2B5+2,401 +BA5 16,67 0 16,67 66,671/2B5+2,403+BA5 44,40 0 22,22 33,331/2B5+2,405+BA5 40,12 0 39.88 30.00B5 +2,401 50,14 0 39,86 30.00B5 +2,403 50,00 25,00 25.00 37,50B5 +2,405 60,00 0 30.00 15.00B5 +2,4-01 +BA5 28.52 0 42,86 28,57B5 +2,4-03+ BA544,44B5 +2,4-05+ BA525,00Keterangan : 2,-4 0 =dichlorophenoxyacetic aCidBA =Benzil adenine0033,3345,00Hitam/coklat(%)33,3333.33Gambar 2. Eksplan buah muda manggaA. Buah mangga yang digunakan sebagai eksplanB. Buah mangga yang dipotong melintangSebagaimana percobaan sebelumnya, maka pada percobaan ini pencoklatanmedia (browning) dan sterilisasi eksplan juga merupakan masalah yang menghambatpenelitian. Dari Tabel 2 terlihat bahwa respon buah muda mangga tergantung kepada11

formulasi media yang digunakan. Respon awal yang terlihat setelah eksplan diletakkanpada media tumbuh adalah eksplan mulai membengkak. Beberapa bagian eksplanmulai menggulung, yang menunjukkan bahwa sel-sel atau jaringan eksplan bereaksiterhadap formulasi media yang digunakan (Gambar 3). Nampaknya penggunaan 2,4­0(1-5 mg/I) dapat menginduksi pembengkakan eksplan baik dengan menggunakanmedia dasar MS atau Gamborg (B5). Pada umumnya semakin tinggi konsentrasi 2,4-0,maka respon pembengkakan eksplan juga makin tinggi. Jika dibandingkan antarapenggunaan BA 0 mg/I dan BA 5 mg/I, maka penambahan BA 5 mg/I memberikanrespon pembengkakan eksplan yang lebih cepat daripada tanpa penambahan BA.Namun demikian, hampir semua eksplan belum dapat membentuk kalus, keeuali padamedia MS atau B5 dengan penambahan 2,4-0 3 mg/1. Kemungkinan hal ini disebabkankarena respon pertumbuhan jaringan yang lambat.Gambar 3. Respon eksplan mangga pada media denganpenambahan 2,4-0Tabel3. Pembentukan kalus dari buah muda mangga dari berbagai ukuranUkuranBuah (em)Responbengkak(%)Kalus(%)1,0-1,5 0.67 0,001,6 - 2,0 4.33 0.672,1 - 2,5 5.33 0,002,6 - 3,0 9.33 0.673,1 - 3,5 8.00 2.003,6 - 4,0 2.67 13.33Oari tabel diatas terlihat bahwa respon pembengkakan eksplan tertinggidiperoleh dari buah berukuran 2.6 - 3 em, yaitu 9.33% dengan persentase kalus yangdihasilkan sebesar 0.67%, sedangkan buah berukuran 3.6 - 4 em menghasilkanpersentase pembentukan kalus tertinggi, yaitu sebesar 13.33% . Jie-Ning et a/ (2004)12

melaporkan bahwa buah berukuran 2.0 - 3.5 cm paling baik digunakan untukmendapatkan struktur globular mangga.Untuk meningkatkan pembentukan kalus, maka dilakukan penggunaan beberapaformulasi media lain, yaitu dengan menggunakan 2,4-0 pada konsentasi rendah (0 dan5 mg/I) dan konsentrasi tinggi (20 dan 30 mg/I) (Tabel 4).Tabel 4. Pertumbuhan eksplan pada berbagai formulasi mediaFormulasi media(mg/I)Kalus(%)Strukturem briosomatik(%)Pencoklataneksplan(%)MS+2,4-D 30 + GA3 5 + sukrosa 6% 14.00 50.00 36.00MS+2,4-D 30 + GA3 5 + sukrosa 6% +arang aktif 2,5 gIlMS + 2,4-D5 + GA3 5 + sukrosa 6% +arang aktif 2,5 gIl18.18 54.55 27.278.33 41.67 50.00MS + 2,4-D 20 mg/l+ sukrosa 6% 3.13 18.75 84 .38MS + 2,4-D 20 mg/l + sukrosa 6% + arangaktif 2,5 gIl5.10 40.00 44.90MS 0.00 16.67 87 .33MS + arang aktif 2,5 gIl 0.00 33.33 66.67Keterangan : 2,4-0 = Olchlorofenoxyacetlc aCid , GA3 = Glbberellc aCidSetelah dipindahkan pada berbagai formulasi media pada Tabel 4, terlihatrespon eksplan yang lebih baik, dim ana eksplan dapat membentuk kalus denganstruktur remah dan wamanya bening. Pad a perkembangan selanjutnya kalus-kalusembriogenik tersebut berkembang membentuk struktur globular, torpedo dan ada yangmulai berkecambah. Oari tabel diatas terlihat bahwa penggunaan 2,4-0 pad akonsentrasi tinggi (30 mg/l) dapat menginduksi pembentukan kalus dan strukturembriosomatik lebih tinggi daripada penggunaan 2,4-0 pada konsentrasi rendah yaitu 5mgl. Tidak adanya penambahan auksin (2,4-0) pada media MS nampaknya tidakmemberikan hasH yang baik, dim ana hanya sedikit eksplan yang dapat membentukstruktur embriosomatik, dan banyak eksplan yang mencoklat atau mati. Hal inimenunjukkan bahwa auksin sangat dibutuhkan pada konsentrasi yang tepat untukmendukung pertumbuhan eksplan. Penambahan arang aktif nampaknya memberikan13

· .,hasil yang lebih ba ik dalam menginduksi pembentukan kalus dan strukturembriosomatik.8erdasarkan hasil penelitian tersebut, maka pada seri percobaan lainnya dicobapenggunaan berbagai formulasi media dengan menggunakan media dasar Gamborg(85) serta penambahan auksin (2,4-0 atau pikloram) dan GA3 (Tabel 5) .Tabel 5. Pertumbuhan eksplan pada berbagai formulasi mediaFormulasi media(mg.l)(85) +2,4-D30 + GA35 + Sukrosa 6% +charcoal 2.5 gl(85)+ 2,4-D30+Sukrosa 6% +charcoal 2.5 gil(MS)+2,4-D30 + GA35 + Sukrosa 6% +charcoal 2.5 gil(MS)+2,4-D30 +Sukrosa 6% +charcoal 2.5 Q/I(MS)+2,4-D 20 +pikloram 10 + GA3 5 +charcoal 2,5 g\l(MS)+2,4-D 10 +pikloram 20 + GA3 5 +charcoal 2,5 Q\IPembentukankalus (%)Pembentukanembriosomatik (%)JumlahglobularJumlahtorpedo33.08 25.35 35 12Jumlahkecambah80 80 41 25 2845.45 45.45 97 41 3230.00 30.00 92 32 950.00 50.00 70 32 2425.00 25.00 40 2 6Keterangan : 2,4-0 =Olchlorofenoxyacetlc aCid , GA3 =Glbberellc aCid5Oari Tabel 5 terlihat bahwa penggunaan formulasi media (85) + 2,4-0 30 mg/l +sukrosa 6% + charcoal 2.5 gil menghasilkan respon pembentukan kalus dan strukturembriosomatik tertinggi, yaitu sebesar 80%, sedangkan dengan menggunakan media(MS)+2,4-0 20 mg/l + pikloram 10 mg/l + GA3 5 mg/l + charcoal 2,5 gIl dapat dihasilkankalus dan struktur embriosomatik masing-masing sebesar 50%. Oengan menggunakanberbagai formulasi media tersebut, kalus yang telah terbentuk dapat berkembangmembentuk struktur embriosomatik dengan fase perkembangan yang berbeda-beda, yaituglobular, torpedo dan kecambah (Gambar 4) .14

Gambar 4. Pembentukan struktur embriosomatik mangga5.2. Mikropagasi tanaman duku melalui kultur in vitroInduksi dan multiplikasj tunas in vitroInduksi tunas dilakukan dengan menggunakan biji yang sudah disterilisasi dandipotong menjadi 2 atau 3 bag ian. Hasil penelitian menunjukkan bahwa biji yangdipotong menjadi dua bag ian menghasilkan tunas yang lebih banyak dibandingkan bijiyang dipotong menjadi 3 bagian (Tabel 6). Pada umumnya biji yang dipotong menjaditiga bagian, tunas hanya tumbuh dari potongan biji yang ditengah, sedangkan daripotongan biji dibagian ujung jarang tumbuh tunas. Jumlah tunas paling banyak diperolehdari biji yang dipotong menjadi dua bag ian pada ketiga formulasi media, yaitu berkisarantara 3,5 - 4,5 tunas, sedangkan tinggi tanaman yang dihasilkan bervariasi.T a b e I 6. P engaru h pemotongan b··· IJI ter h a d ap . In d u k Sl . tunas d uk uFormulasi Potongan Jumlah Tinggimedia lmgtl) biji tunas Tunas (em)BA1 + GA3 5BA3 + GA3 5BA5 + GA3 5232323,5142,54,51,512,41,621,682,58334,20Keterangan : BA =Benzil adenm, GA3 =Glbberellc aCidUntuk mengetahui formulasi media terbaik dalam menginduksi pertumbuhan tunas,maka digunakan beberapa formulasi media dengan menggunakan media dasar MSdengan penambahan SA (1-3 mgtl) dengan atau tanpa penambahan GA3. Hasilpenelitian menunjukkan bahwa penambahan GA3 5 mg/l lebih baik dalam menginduksipembentukan tunas dibandingkan dengan tanpa penambahan GA3 5 mgtl, walaupunjika dibandingkan dengan kontrol (tanpa penambahan SA dan GA3), maka penambahanSA tanpa GA3 menghasilkan tunas yang lebih banyak (Tabel 7).15

T a b e 17 P enggunaan BA d an GA3 d aam 1 In . d u k Sl . t unas d u k u, umur 5 mingguFormulasi media Jumlah tunas Tinggi(mgll)tunas (em)BA1 + GA3 5 2,67 ± 2,08 1,80 ± 1,00BA2 + GA3 5 4,00 ± 2,12 1,40 ± 0,50BA3 + GA3 5 4,50 ± 1,58 2,38 ± 0,76BA1 2,00 ± 1,00 1,72 ± 0,94BA2 2,40 ± 0,89 1,60 ± 0,28BA3 3,20 ± 2,08 2,18 ± 0,60Kontrol 1,50 ± 0,58 2,08 ± 0,17Keterangan : BA =Benzll adenln, GA3 =Glbberellc aCIdBerdasarkan hasil pereobaan diatas, maka dilakukan pereobaan untukmengetahui pengaruh penggunaan thidiazuron dan GA3 pad a media MS yangmengandung BA (3 dan 4 mg/I) dalam memaeu multiplikasi tunas in vitro (Tabel 8) .Tabe\ 8 . Pengaruh penggunaan BA, GA3 dan thidiazuron dalammuI' tlPl1rk' aSI tunas d u k u, umur 5' mlngguTinggiFormulasi media Jumlah tunas Tunas(mg/I)(em)BA3 + GA3 5 3,33 ± 2,08 1,66 ± 0,76BA3 + thi 0.1 5,55 ± 0,5 2,40 ± 1,12BA3 + GA3 5 + thiO.1 5,15 ±1,00 1,35 ± 0,90BA4 + GA3 5 2,50 ± 0,76 1,95 ± 0,07BA4 + thi 0.1 4,40 ± 0,67 1,60 ± 0.50BA4 + GA3 5+ thiO.1 5,50 ± 1,76 1,45±1,01Kontrol 1,78 ± 0,80 2,00 ± 0,54..Keterangan : thl =thldlazuron , BA = Benzil adentn, GA3 = glbbereltc aCidDari tabel diatas terlihat bahwa penambahan thidiazuron 0.1 mgll dengan atautanpa penambahan GA3 (0 dan 5 mg/I) lebih baik dalam menginduksi multiplikasitunas duku. Penambahan thidiazuron 0.1 mgtl dan GA3 5 mgtl umumnya lebih baikdaripada thidiazuron 0.1 mg/I tanpa GA3 5 mgtl, walaupun pertambahan jumlahtunas yang dihasilkan tidak terlalu besar. Namun demikian nampaknya penggunaanBA 3 dan 4 mg/I menghasilkan jumlah tunas yang tidak berbeda.Gambar 5. Induksi tunas duku pada berbagai formulasi media16

Induksi kalus dukuInduksi kalus duku dengan menggunakan eksplan daun disajikan pada Tabel 9.Penggunaan eksplan daun untuk menginduksi pembentukan kalus pad a awalnya tidakmemberikan hasil yang baik. Daun hanya membengkak pada semua formulasi mediadan belum terbentuk kalus. Hal ini disebabkan karena daun duku banyak mengandunglapisan liIin sehingga zat pengatur tumbuh sulit menembus lapisan terse but. Untukmendapatkan hasil yang lebih baik, maka dicoba penggunaan formulasi media lain, yaituMS dengan penggunaaan 2,4-0 pada konsenrasi yang tinggi yaitu 20 mg/I. Sepertihalnya percobaan sebelumnya, ternyata respon jaringan sangat lambat, namun setelah4 bulan eksplan mulai membengkak dan mulai terlihat tonjolan-tonjolan di bagian pinggirdaun (Gambar 6).Tabel 9 . Induksi kalus duku dari eksplan daun pada berbagai fl' ormu aSI me d' la, umur 6 mlnggu ' Formulasi Respon daun Visualmedia (mg/I)daunMembengkak berkalusMS+2,4-0 0 00 HijauMS +2,402 500 HijauMS +2,404 70 0 HijauMS +2,40 8 800 HijauMS +picloram 0 00HijauMS +picloram 2 00 HijauMS +picloram 4 00MS +picloram 8 0Keterangan : 2,4-0 =Olchlorofenoxy acetic aCidHijau0 HijauGambar 6. Induksi kalus duku dari eksplan daun17

Tabel 10. Induksi kalus duku dari eksplan biji pad a berbagai formulasi media,umur 4 mlnggu .Formulasi Pembentukan Strukturmedia (mg/I) kalus (%) kalusMS+2,4-0 0 0 -MS +2,40 2 25,00 remahMS +2,404 32,26 remahMS +2,40 8 41,2 remahMS +picloram 0 0 kompakMS +picloram 2 10,00 kompakMS +picloram 4 15,50 kompakMS +picloram 8 20,12 kompakKeterangan : 2,4-0 =Olchlorofenoxy acetic aCIdPada penelitian ini juga dicoba penggunaan biji untuk diinduksi membentuk kalus.Oari Tabel 10 terlihat bahwa penggunaan 2,4-0 (2,4, dan 8 mg/I) lebih baik dalammenginduksi pembentukan kalus dibandingkan dengan picloram (2, 4, dan 8 mg/I). Halini disebabkan karena 2,4-0 merupakan jenis auksin yang mempunyai daya aktivitasyang lebih kuat dibandingkan dengan picloram, sehingga respon pembentukan kaluslebih cepat. Selain itu kalus yang dihasilkan dengan menggunakan 2,4-0 mempunyaistruktur yang remah sedangkan kalus dari media dengan penambahan piclorammempunyai struktur kompak. Untuk selanjutnya kalus-kalus tersebut akan dipindahkanpad a formulasi media lain untuk memacu pembentukan kalus yang embriogenik(Gambar 7).Gambar 7. Induksi kalus duku dari eksplan biji5.3. Inisiasi rekayasa genetik mangga dan duku dengan menggunakan gen gusPlasmid pembawa gen gus yang digunakan adalah pBI 121. Plasmid tersebutdisub kultur pada media cair mengandung kanamisin 100 mg/I. Oemikian juga eksplanyang akan diberi perlakuan telah diprekultur selama satu minggu pada media induksi18

kalus. Tahap inokulasi eksplan dilakukan dengan cara merendam eksplan mangga danduku pada larutan bakteri yang diberi asetosiringon pada konsentrasi 100 dan 200 uM.Perendaman eksplan dilakukan selama 15 dan 30 menit. Setelah itu eksplandipindahkan pada kertas filter steril selama beberapa menit dan selanjutnya dipindahkanpad a media regenerasi yang telah diberi asetosiringon 100 dan 200 uM. Kokultivasidilakukan selama 9 hari. Selanjutnya dilakukan uji gus.Tabel11 . Hasil Uji gus pad a kalus manggaWaktu perendaman Jumlah kafus positif uji GUS (%)Asetosiringon 100 uM Asetosiringon 200 uM15 menit 91 .7 50.030 menit 0 0Tabel 12. Hasil uji gus pada kafus dukuWaktu perendaman Jumlah kafus positif uji GUS (%)Asetosiringon 100 uM Asetosiringon 200 uM15 menit 100 66.730 menit 0 0Taber 11 dan 12 menunjukkan bahwa perendaman karus mangga atau dukuselama 15 menit menghasilkan kalus positif gus daripada perendaman selama 30 men it,sedangkan penambahan asetosiringon 100 uM lebih baik daripada 200 uM dalamtranformasi mangga atau duku. Hal ini disebabkan karena perendaman selama 30 men itatau penambahan asetosiringon 200 uM pada larutan bakteri menyebabkan terlalubanyak bskteri yang menempel dan menginfeksi kalus sehingga te~adi persainganantara eksplan (kalus) dengan bakteri. Kondisi ini menyebabkan kalus menjadi coklatdan mati. Diduga hal ini disebabkan karena kalus mangga dan duku menghasilkan fenolyang cukup banyak sehingga dalam transformasi genetik mangga atau duku tidakdiperlukan asetosiringon dalam jumlah yang terlalu banyak. Gambar hasl uji gus kalusmangga dan duku disajikan pad a Gambar 8 dan 9.19

Gambar 8. Uji gus kalus manggaGambar9. Uji gus kalus dukuBAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN6.1. KESIMPULAN1. Respon pembengkakan eksplan tertinggi diperoleh dengan menggunakan eksplanbuah mangga dengan ukuran 2 - 3.5 cm .2. Penggunaan 2,4-0 pada media MS atau Gamborg (B5) dapat menginduksipembengkakan eksplan mangga. Penambahan BA 5 mg/l memberikan responpembengkakan eksplan yang lebih baik daripada tanpa penambahan BA3. Pembentukan kalus dan struktur embriosomatik mangga tertinggi diperoleh denganmenggunakan media (B5)+ 2,4-030 +sukrosa 6% + charcoal 2.5 gil.4. Untuk tanaman duku, biji yang dipotong menjadi dua bag ian meghasilkan tunas yanglebih banyak daripada biji yang dipotong menjadi tiga bag ian.5. Penggunaan GA3 pada media MS yang mengandung BA lebih baik dalam induksitunas duku daripada tanpa penambahan GA3.20

• ft,6. Penambahan th idiazuron 0.1 mg/l dan GA3 5 mg/I pada media tumbuh dukumenghasilkan jumlah tunas yang lebih banyak daripada penambahan thidiazuron 0.1mg/I tanpa GA3 5 mg.7. Penggunaan 2,4-0 lebih baik daripada picloram dalam menginduksi pembentukankalus duku.8. Metoda transformasi mangga dan duku dengan bantuan A. fumefaciens strain LBA4404 yang mengandung pBI121 yang terbaik adalah perendaman kalus selama 15menit dalam larutan bakteri serta kokultivasinya dalam media regenerasi yangmengandung asetosiringon 100 uM .6.2. SARANPenelitian ini perlu dilanjutkan pada tahap transformasi genetik menggunakangen DefH9-iaaM dengan memanfatkan hasil penelitian yang telah diperoleh, yaitumetoda regenerasi mangga dan duku serta transformasi genetik dengan gen gus yangdapat dijadikan sebagai acuan untuk melakukan transformasi genetik dengan gentarget.DAFTAR PUSTAKAAmeriana, M., N. Hartuti, dan E. Sofiari. 2002. Kelayakan teknis dan finansial pastatomat hasil penelitian Balai Penelitian Tanaman Sayuran. Jurnal Hort. 3:198-206.Anonim, 2009. Tanaman buah-buahan tahunan. Http://bisnis Indonesia.Bank Indonesia. 2007. Sistem Informasi Pola pembiayaan/lending model usaha keci!.http://www.bi.go.id .Fatta Del Bosco, S., G. Matrango and G. Geraci, 1992. Micro and macro sporogenesisof two triploid hybrids of citrus. In: Proc. Int. Soc. Citriculture, 1: 122-4.Gusyana, D. 2009. Rekayasa genetika tanaman, dari totipotensi menjadipotensi bisnis. Media Outreach, Indonesian Biotechnology Information Centre(/ndoBIC).Heuvelink, E and O. Korner. 2001 . Parthenocarpic fruit growth reduces yield fluctuationand blossom-end rot in sweet pepper. Annals of Botany 88: 69-74.Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW.1987. Gus fusions: Glucuronidase as aversatile gene marker in higher plants. EMBO J.6: 3901-3907.Koltunow, A.M. , P. Brennan, S. Protopsaltis and N. Nito, 1995. Regeneration of WestIndian lime (Citrus aurantifiolia) containing genes for decreased seed set. Acta21

• Ii>Horticulturae (www. ishs.org) Ohgowara, T., S. Kobayashi, E. Ohgawala, H.Uchimiya and S. Ishii, 1985.Mazzucato A, Taddei AR, Soressi GP. 1998. The parthenocarpic fruit (pat) mutant oftomato (Lycopersicon esculentum Mill.) sets seedless fruits and has aberrantanther and ovule development. Dev 125, 107-114.Mezzetti B, Lundi L, Pandolfini T, Spena A. 2004. The defH9-iaaM auxin-synthesizinggene increases plant fecundity and fruit production in strawberry and raspberry.BMC Biotechnol. 4:4.Pandolfini T, Rotino GL, Camerini S, Defez R, Spena A (2002). Optimisation oftransgene action at the post-transcriptional level: high quality parthenocarpic fruitsin industrial tomatoes. BMC Biotechnol. 2: 1.Rotino GL, Perri E, Zottini M, Sommer H, Spena A. 1997. Genetic enginnering ofparthenocarpic plants. Nat biotechno/15 : 1398-1401.Suwarno. W.B. 2008. Pemuliaan tanaman mangga. Http:/willy.situshijau.co.id. tanggal15 Maret 2008.Vardi, A., 1996. Strategies and consideration in mandarin improvement programmes. In:Proc. Int. Soc. Citriculture, 1: 109-12Varoquaux, F., R. Branvillain, M. Delseny, and P. Gallois. 2000. Less is better: newapproaches for seedless fruit production. TB Tech. June (18) : 233-242Weiss, J., Nerd, A. and Mizrahi, Y (1993). Vegetative parthenocarpy in the cactus pearOpuntia ficus-indica (L.) Mill. . Annals of Botany 72 (6): 521-6.22