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Rapporti ISTISAN 04/32
– Sistema di omogeneizzazione a cavitazione;
– Spettrofotometo UV/VIS, in questo caso il modello è Lambda Bio della Perkin Elmer.
Reagenti
– Soluzione acquosa di acetone al 90%.
Procedura
Servendosi delle pinzette si pone il filtro sul supporto e si filtra un volume idoneo di
campione (1 litro) utilizzando l’apposito sistema di filtrazione. Si applica una depressione non
superiore ai 50 Kpa (350 mm Hg). Si omogeneizza per 10 secondi il filtro in 10 mL di acetone –
acqua al 90% con un omogeneizzatore regolato alla velocità di 25.000-30.000 rotazione per
minuto (rpm). Il campione viene poi posto al buio a +4°C e si lascia in posa per 10 minuti.
Si chiarifica trasferendo l’omogenato in una provetta e centrifugando per 20 minuti a 6000
xg; si preleva poi il surnatante dosandone il volume.
Determinazione spettrofotometrica
Si misura l’assorbanza del surnatante alle lunghezze d’onda di 750, 663, 645, 630 mn
utilizzando un bianco costituito dalla soluzione di acetone al 90%. La lettura dell’estratto a 750
nm fornisce una misura della torbidità dell’estratto che non deve superare 0,01 unità di
assorbanza. In caso contrario è necessario ripetere il procedimento di chiarificazione.
Per il calcolo dei risultati,infine, è necessario inserire le assorbanze (A):
mg/L = [11,64 (A663 – A750)-2,16(A645 – A750)-0,10(A663 – A750)] Ve /Vf
dove: Ve = volume (mL) dell’estratto
Vf = volume (mL) filtrato.
Estrazione tossicologica e biosaggio
Per effettuare l’estrazione delle tossine dalle alghe per il biosaggio con V. fisheri 10 mg di
alghe in peso fresco vengono sospese in 1 mL di acqua sterile bidistillata e sonicate per 5 minuti
a 30-40 °C, con 20 secondi di vortex dopo 2,5 minuti di sonicazione. La sospensione viene
quindi centrifugata per 10 minuti a 11.000 rpm, e il supernatante raccolto a parte, mentre il
centrifugato viene risospeso in 1 mL di acqua sterile bidistillata e il procedimento ripetuto per
intero. Al termine, i due supernatanti così ottenuti vengono uniti e saggiati con il biosaggio
(Ottaviani & Bonadonna, 2000).
Per la rilevazione della presenza di tossine algali si usa un biosaggio su batteri Vibrio fisheri:
il sistema Microtox. Esso si basa sulla esposizione di concentrazioni note di V.fisheri, batterio
fosforescente di profondità marine, a diverse concentrazioni crescenti della sospetta sostanza
tossica. La luminosità batterica si estingue in proporzioni coerenti con la quantità di tossico con
cui viene a contatto e con il tempo di esposizione (5’, 15’o 30’). I valori di estinzione, registrati
dal luminometro dell’apparecchio in base ad una scala interna, vengono elaborati statisticamente
dal software fornito con lo strumento, che permette di calcolare il coefficiente di estinzione del
50% dei batteri presenti, compresi i limiti di confidenza, in base ad una curva tracciata
raccogliendo le percentuali di estinzione causate da tutte le varie concentrazioni del tossico
saggiate (Ottaviani & Bonadonna, 2000).