NOVA Lite™ Skin Antibody Primate Esophagus ... - Inova
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<strong>NOVA</strong> Lite ® <strong>Skin</strong> <strong>Antibody</strong> 708330<br />
<strong>Primate</strong> <strong>Esophagus</strong> Autoantibody Screen Assay<br />
Per uso diagnostico In Vitro<br />
Complessità CLIA: elevata<br />
Finalità d’uso<br />
<strong>NOVA</strong> Lite ® SA è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e la determinazione semi-quantitativa<br />
degli autoanticorpi diretti verso la cute nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-cute può essere<br />
utilizzata assieme ad altre analisi sierologiche e ai riscontri clinici come ausilio nella diagnosi di malattie<br />
cutanee autoimmuni, soprattutto il pemfigo ed il pemfigoide.<br />
Riassunto e Spiegazione del test<br />
La definizione “autoanticorpi cutanei” include una varietà di autoanticorpi che reagisce con costituenti della<br />
superficie cutanea e mucosa. Questi autoanticorpi si riscontrano con frequenza elevata in pazienti con<br />
malattie autoimmuni della cute, specialmente nel pemfigo e nel pemfigoide.<br />
Gli autoanticorpi che reagiscono contro un antigene intercellulare della cute e della mucosa si riscontrano in<br />
praticamente tutti i casi di pemfigo. 1 Il titolo di questi anticorpi segue il decorso della malattia e diminuisce<br />
dopo una terapia efficace. 2,3,4<br />
Il pemfigoide bolloso, un’altra malattia cutanea autoimmune importante, è caratterizzato sierologicamente<br />
dalla presenza di anticorpi diretti contro la membrana basale della cute e della mucosa. Gli anticorpi diretti<br />
contro la membrana basale si riscontrano nel 70-80% dei pazienti affetti da pemfigoide. 5,6,7 La correlazione<br />
fra la gravità della malattia ed il titolo anticorpale non è ovvia come nel pemfigo, ma esiste. Nei periodi di<br />
remissione, spontanea o in seguito a terapia, gli anticorpi diretti contro la membrana basale diminuiscono, in<br />
genere a livelli talmente bassi da non essere più rilevabili. 7 Nella maggior parte dei casi di ricaduta riappaiono<br />
gli autoanticorpi diretti contro la membrana basale.<br />
Il metodo utilizzato più di frequente per la determinazione degli autoanticorpi cutanei è la<br />
immunofluorescenza indiretta. I substrati più comuni sono sezioni sottili di cute e mucosa di topo o di primati.<br />
Il substrato migliore è l’esofago dei primati. 8,9,10 Oltre al tipo di substrato, esistono altri fattori di vitale<br />
importanza per la performance dell’analisi per la determinazione degli autoanticorpi cutanei: 1) il fissativo<br />
utilizzato per preparare il vetrino con il substrato 2) la specificità ed il rapporto fluoresceina/proteina (F/P) del<br />
coniugato utilizzato marcato FITC. È noto, infatti, che alcuni fissativi o loro combinazioni distruggono certi<br />
antigeni cutanei e si dovrebbe quindi evitarne l’utilizzo. Il rapporto F/P di un coniugato determina la sensibilità<br />
ed il grado di colorazione di fondo. La specificità di un coniugato è di vitale importanza. La maggioranza degli<br />
autoanticorpi appartiene alla sottoclasse delle IgG. Quando si riscontrano autoanticorpi in donatori di sangue<br />
sani, questi appartengono quasi sempre alle sottoclassi IgM ed IgA e solo molto raramente IgG. 11 Per questo<br />
motivo i coniugati specifici per le IgG sono più specifici per la malattia. Il substrato scelto per il <strong>NOVA</strong> Lite ®<br />
<strong>Skin</strong> <strong>Antibody</strong> è una sezione di stomaco di primato fissata in maniera ottimale. Il coniugato è costituito da<br />
anti-IgG umane purificate per affinità.<br />
Principio della Metodica<br />
Nel test all’immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell’antigene e gli<br />
anticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specifico<br />
marcato con fluoresceina e successivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando i<br />
campioni positivi agli autoanticorpi vengono osservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano una<br />
fluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle aree delle cellule o dei nuclei dove si è legato<br />
l’autoanticorpo.<br />
1
Reagenti<br />
1. Vetrini per anticorpi cutanei (esofago di primati), vetrino ad 8 pozzetti, con disidratante<br />
2. Coniugato anti-IgG umano (capra), marcato alla fluoresceina in tampone contenente Blu di Evans ed<br />
azoturo di sodio allo 0,09%, 7 ml<br />
3. Pemfigoide positivo 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi da siero<br />
umano diretti verso il pemfigoide, prediluto, 0,5 ml<br />
4. Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09%, senza<br />
anticorpi di siero umano anti pemfigoide, prediluto, 0,5 ml<br />
5. Concentrato PBS II (40x), sufficiente per 1000 ml<br />
6. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09%, 7 ml<br />
7. Coprivetrini<br />
Avvertenze<br />
1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state<br />
testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-H I V , p e BsAg r H e per anticorpi anti-<br />
HCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa<br />
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Pemfigoide positivo ed Controllo<br />
Negativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. 12<br />
2. La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se<br />
ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo<br />
o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di<br />
acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.<br />
3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.<br />
4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le<br />
normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.<br />
Precauzioni<br />
1. Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.<br />
2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.<br />
3. Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un’elevato background.<br />
4. L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi<br />
di manipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a<br />
quelli ottenuti eseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro<br />
procedura automatizzata affinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili.<br />
5. La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei<br />
reagenti, la luminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della<br />
tecnica di pipettamento, la precisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il<br />
test. E' richiesto di prestare particolare attenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e<br />
riproducibili.<br />
6. Nel tempo, il Coniugato anti IgG Umana può cambiare colore a causa di esposizione alla luce. In ogni<br />
caso, il cambiamento del colore non ha effetto sulla prestazione del test.<br />
7. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.<br />
Condizioni di conservazione<br />
1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2 - 8 ° C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di<br />
scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.<br />
2. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2 - 8 ° C.<br />
2
Raccolta dei campioni<br />
Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L’aggiunta al campione di sodio azide o di altri<br />
conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica,<br />
trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso<br />
di sieri fortemente emolizzati o lipemici.<br />
Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell’CLSI (NCCLS)<br />
raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura<br />
ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in<br />
frigorifero a 2 - 8 ° C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni,<br />
congelare a ≤-20°C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di<br />
essere testati.<br />
Procedura<br />
Materiali forniti<br />
10 8-pozzetti Vetrini Pelle anticorpi<br />
1 7 ml Coniugato anti-IgG umano<br />
1 0,5 ml Pemfigoide positivo<br />
1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA<br />
1 25 ml Concentrato PBS II (40x)<br />
1 7 ml Liquido di montaggio<br />
1 10 Coprivetrini<br />
Materiali richiesti ma non forniti<br />
Micropipette in grando di erogare volume di 15 – 1000µl<br />
Acqua distillata o deionizzata<br />
Bottiglie di plastica a spruzzo o pipette Pasteur<br />
Camera umida<br />
Beuta da 1l per diluire il PBS II<br />
Vaschette Coplin<br />
Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm<br />
Metodica<br />
Prima di incominciare<br />
1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20 – 26 ° C) e mescolarli bene.<br />
2. Diluire il concentrato PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II 1:40 aggiungendo il<br />
contenuto del flacone contenente il concentrato PBS II in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e<br />
mescolare accuratamente. Il tampone PBS II viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come<br />
tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2 - 8 ° C.<br />
3. Diluire i campioni del paziente:<br />
a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:10 con il tampone PBS II diluito (ovvero, aggiungere<br />
100 µl di siero a 900 µl di tampone PBS II).<br />
b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per<br />
tutti i campioni positivi con il tampone PBS II diluito (ovvero 1:20, 1:40,... 1:2560).<br />
Esecuzione del test<br />
1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del<br />
substrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera<br />
umida adeguata. Aggiungere 1 goccia (70-90µL) dei controlli positivi e negativi non diluiti<br />
rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (70-90µL) del campione diluito del paziente<br />
nei rimanenti pozzetti.<br />
2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per 30 + 5 minuti in una camera umida (un tovagliolo di<br />
carta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità<br />
adeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d’esame.<br />
3
3. Lavare i vetrini: dopo l’incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per<br />
lavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e la direzione<br />
del flusso del tampone PBS II in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari<br />
pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se<br />
voluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS II per fino a 5 minuti.<br />
4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS II in eccesso. Porre nuovamente il<br />
vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato<br />
fluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori 30 + 5 minuti.<br />
5. Lavare i vetrini: ripetere la fase 3.<br />
6. Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti<br />
procedure sono raccomandate:<br />
a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta.<br />
b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino.<br />
c. Eliminare il tampone PBS II in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il<br />
bordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il<br />
collante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d’aria.<br />
Controllo di qualità<br />
Il Pemfigoide positivo ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in<br />
modo da assicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può<br />
preparare dell’ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a<br />
< -70 o C. I risultati dell’analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati<br />
validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell’esame e si<br />
dovrebbe ripetere il test.<br />
1. Il Pemfigoide positivo non diluito deve essere > 3+.<br />
2. Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo.<br />
Interpretazione dei risultati<br />
Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se la colorazione specifica delle aree<br />
intercellulari, della membrana basale e di altre strutture è uguale o minore rispetto al controllo negativo. I<br />
campioni possono mostrare vari gradi di colorazione di fondo dovuta ad anticorpi eterofili o ad altre reazioni<br />
specifiche dovute agli anticorpi anti-reticolina, antinucleo, anti-endomisio o anti-muscolo liscio.<br />
Reazione positiva per gli anticorpi intercellulari e della membrana basale. Un campione può essere<br />
considerato positivo se si osserva una colorazione specifica delle zone intercellulari o della membrana basale<br />
della mucosa esofagea.<br />
Determinare il grado o l’intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri:<br />
4+ Fluorescenza verde chiaro brillante<br />
3+ Fluorescenza verde chiara accesa<br />
2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile<br />
1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione<br />
delle zone della membrana basale e/o intercellulare dalla fluorescenza di fondo<br />
Limitazioni del test<br />
1. La presenza di autoanticorpi cutanei è suggestiva di alcune malattie cutanee bollose autoimmuni ma<br />
non dovrebbe essere considerata quale indicazione diagnostica. Il risultato della ricerca degli<br />
autoanticorpi dovrebbe essere valutato in combinazione con altre analisi sierologiche o bioptiche e<br />
con la storia clinica del paziente.<br />
2. Oltre agli autoanticorpi cutanei altri autoanticorpi possono reagire con il substrato esofageo. Alcuni di<br />
questi includono autoanticorpi anti-nucleo (ANA), anti-mitocondrio (AMA), anti-muscolo liscio ed anti<br />
muscolo scheletrico. La presenza di questi anticorpi dovrebbe essere notata, e la loro presenza<br />
dovrebbe essere confermata e titolata su altri substrati approvati.<br />
3. Si dovrebbe notare che in seguito a danni tissutali, alcuni pazienti ustionati producono anticorpi<br />
debolmente reattivi che si legano anche ad aree intercellulari. Questi cosiddetti anticorpi “similpemfigo”<br />
danno una colorazione debole e disomogenea della mucosa, sono di natura transitoria e<br />
non reagiscono con la cute del paziente in vivo. 13,14,15<br />
4
4. Dato che la mucosa esofagea può contenere delle sostanze derivate dai gruppi sanguigni, gli<br />
isoanticorpi dei gruppi sanguigni anti-A ed anti-B possono reagire con l’esofago. 16 Il pattern di<br />
reattività può imitare, in alcuni pazienti, il pattern osservato con gli autoanticorpi per il pemfigo<br />
intercellulare (anche se gli anticorpi dei gruppi sanguigni coloreranno i capillari sanguigni della<br />
muscolatura della sezione esofagea). La reattività dovuta agli anticorpi dei gruppi sanguigni può<br />
essere assorbita con antigeni dei gruppi sanguigni. 17<br />
5. La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a<br />
fluorescenza utilizzato, la forza e l’età della lampadina, l’ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e<br />
l’osservatore.<br />
6. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero<br />
maggiore di artefatti di colorazione.<br />
7. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale<br />
per scrivere può causare artefatti.<br />
8. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante.<br />
L’utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti.<br />
9. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del<br />
paziente e del risultato degli altri test sierologici.<br />
10. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.<br />
Valori attesi<br />
Il substrato <strong>NOVA</strong> Lite ® <strong>Skin</strong> <strong>Antibody</strong> è stato utilizzato per analizzare campioni provenienti da pazienti affetti<br />
da pemfigo e da pemfigoide ed anche 100 campioni provenienti da donatori di sangue scelti in maniera<br />
casuale. I risultati appaiono qui di seguito:<br />
Numero di positivi<br />
Gruppo di pazienti Numero intercellulare membrana basale<br />
Pemfigo 24 20 0<br />
Pemfigoide 18 0 12<br />
Normali 100 0 0<br />
5
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6
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9900 Old Grove Road<br />
San Diego, CA 92131<br />
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628330ITA December 2012<br />
Revision 17<br />
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