UNIVERSITA DEGLI STUDI DELLA TUSCIA DI VITERBO ...

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Materiali e metodi di una soluzione costituita da 100 μl di esano/dietiletere (50/50) e 900 μl di fase mobile (metanolo/acetonitrile/THF 50/45/5) . Il volume di iniezione è di 50 μl ed il tempo di analisi è di 17 minuti. 3.2.6 Misura della vitamina C (75) L’acido ascorbico (AA) è un idrato del carbonio a 6 atomi di C che esiste in due forme stereoisomere : un isomero L e un D detto acido isoascorbico (IAA). Gli isomeri dell’AA possono essere reversibilmente ossidati ai loro rispettivi deidroisomeri (DHAA e DHIAA). Le forme ossidate dell’AA sono state misurate attraverso la riduzione con ditiotrietolo (DTT) calcolando la differenza tra le quantità di AA e IAA ridotte e totali. I campioni sono stati misurati per cromatografia liquida su una colonna 250 x 4,6 mm Capcell Pak NH 2 (Shiseido, Tokyo, Japan). La colonna è stata equilibrata a 40° C e ad un flusso di 1 ml/min con una fase mobile composta da 0,68 g di KH 2 PO 4 , 200 ml di H 2 O, 800 ml di acetonitrile (ACN) e 7,5 ml di acido fosforico concentrato. L’analisi è stata eseguita isocraticamente. Il detector elettrochimico è stato settato a 700 mV. La curva standard di AA è stata preparata diluendo una soluzione stock di 1 g/l in acido metafosforico (MPA) (30g/l). Per l’analisi dei campioni alimentari, 1 g di carciofo sospeso in 5 ml di acqua e agitato per 15 secondi è stato analizzato in doppio per valutare il contenuto di AA e di IAA e dell’AA totale (AA+DHAA) e IAA totale (IAA+DHIAA). Per la misura dell’AA e dell’IAA alla sospensione si aggiunge 1 ml di MPA (400 g/l) e si agita per 15 secondi. Si aggiungono 2 ml di ACN, si agita per 15 secondi e si centrifuga a 1000 x g per 30 minuti. Per la misura dell’AA+DHAA alla sospensione si aggiunge 1 ml di una soluzione di KH 2 PO 4 (0,5 mol/l) e DTT (100 g/l) per ridurre DHAA e DHIAA e s agita per 15 secondi. Si mantiene a temperatura ambiente per 30 minuti, si aggiunge 1 ml di MPA (400 g/l) e si agita per 15 secondi, Dopo il trattamento il surnatante limpido si trasferisce in vials per l’analisi all’HPLC. 42
3.3.0 Disegno di Studio in vivo Materiali e metodi Per lo studio sono stati selezionati 5 soggetti volontari 2 di sesso maschile e 3 di sesso femminile, non fumatori, apparentemente sani e di età tra i 25 ed i 32 anni, risultati sani in seguito ad anamnesi. I soggetti presentavano un peso corporeo medio di 60.4 ± 9.5 kg ed un indice medio di massa corporea pari a 21.5± 1.5 kg/m 2 e, al momento dello studio, non assumevano né medicinali né supplementi dietetici da almeno un mese. I soggetti sono stati sottoposti ad una dieta condizionata per un periodo di tre giorni, che limitava il consumo di frutta e verdura complessivamente ad un massimo di 100 g al giorno ed escludeva carciofi, carote, patate, pomodori, mele, pere, ciliegie, frutti di bosco, pesche, tè, caffè, vino, birra, cioccolata, e loro prodotti derivati, poiché alimenti ad alto contenuto polifenolico. Il giorno dello studio sui soggetti è stato effettuato un prelievo ematico a digiuno e a 30, 60, 120 , 240, 360 e 480 min. dopo la somministrazione del pasto sperimentale che di 61.7 g di capolini di carciofo (cv Violetto di Provenza) cotti a vapore e conditi a crudo con olio extravergine di oliva (1 cucchiaio a porzione). La procedura di preparazione dell’alimento è stata preventivamente messa a punto, al fine di ottenere il giusto grado di cottura. La quantità di carciofo da somministrare è stata calcolata sulla base del contenuto in acido clorogenico precedentemente determinata nella cultivar carciofo utilizzata, ovvero 307.5 mg/100 g di p.e. Il carciofo da somministrare è stato campionato sia crudo che cotto al fine di verificare il contenuto in acido clorogenico. In tabella 2 è riportata la composizione nutrizionale del pasto sperimentale. 43
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