Rischio da agenti chimici - Giornale Italiano di Medicina del Lavoro ...

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46 G Ital Med Lav Erg 2011; 33:3, Suppl 2 http://gimle.fsm.it stemi biologici. A tale scopo abbiamo somministrato per via endovenosa SiNP di 3 diversi diametri (24, 60 e 110 nm) e due diverse chimiche di superficie (funzionalizzazione, NH 2 o COOH) a femmine di topo al quinto giorno di gravidanza, quando l’embrione si è da poco impiantato nella parete uterina. Le SiNP sono state solubilizzate in acqua sterile e somministrate in soluzione salina, parallelamente al controllo (veicolo), alla concentrazione relativamente elevata di 30 µg/topo attraverso iniezione nel plesso venoso retro bulbare, senza uso di anestesia che altrimenti avrebbe potuto interferire con la gravidanza. Sono state utilizzate almeno 10 femmine per ogni condizione. Questo protocollo sperimentale è stato scelto per poter studiare l’effetto della somministrazione di SiNP esclusivamente sullo sviluppo dell’embrione e non sull’impianto. Dopo 10 giorni dalla somministrazione, gli animali sono stati sacrificati e gli embrioni sono stati contati, ne è stata misurata la lunghezza e studiata la morfologia. I risultati ottenuti dimostrano che un modesto effetto embriotossico può essere riscontrato dopo somministrazione di ciascuna SiNP. Per tutte e tre le dimensioni e le due funzionalizzazioni non è stata osservata alcuna variazione nel numero totale di embrioni contenuti in ciascun utero (media 12), ma in alcuni casi è stata rilevata la presenza di feti con evidenti malformazioni strutturali, mai osservate nelle femmine di controllo. In particolare, tre femmine trattate con le particelle di 110 nm contenenti gruppi COOH hanno presentato almeno un feto acardico, con arti iposviluppati e una lunghezza notevolmente ridotta rispetto ai fratelli sani. Una femmina che aveva ricevuto le particelle di 110 nm contenenti gruppi NH 2 ha presentato due feti gemelli monozigoti diamniotici, un evento estremamente raro nei mammiferi e normalmente associato all’esposizione ad agenti teratogeni lievi. Riguardo le particelle da 60 nm, quelle con gruppi COOH hanno indotto la formazione di un feto malformato, mentre un’altra femmina che aveva subito lo stesso trattamento mostrava due feti gemelli. Al contrario, le particelle di dimensioni più piccole (24 nm) hanno mostrato un effetto embriotossico solo quando funzionalizzate con gruppi NH 2 , causando in due diversi animali la formazione di un feto malformato e di un embrione arrestato molto precocemente nello sviluppo con una placenta di dimensioni notevolmente ridotte. BIBLIOGRAFIA 1) Kagan VE, Tyurina YY, Tyurin VA, Konduru NV, Potapovich AI, Osipov AN, Kisin ER, Schwegler-Berry D, Mercer R, Castranova V, Shvedova AA. Direct and indirect effects of single walled carbon nanotubes on RAW 264.7 macrophages: role of iron. Toxicol Lett 2006; 165: 88-100. 2) Bottini M, Bruckner S, Nika K, Bottini N, Bellucci S, Magrini A, Bergamaschi A, Mustelin T. Multi-walled carbon nanotubes induce T lymphocyte apoptosis. Toxicol Lett 2006; 160: 121-126. 3) Park MVDZ, Annema W, Salvati A, Lesniak A, Elsaesser A, Barnes C, McKerr G, Howard CV, Lynch I, Dawson KA, Piersma AH, De Jong WH. In vitro developmental toxicity test detects inhibition of stem cell differentiation by silica nanoparticles. Toxicol. and Appl. Pharmacol 2009; 240: 108-116. 4) Cheng J, Flahaut E, Cheng SH. Effect of carbon nanotubes on developing zebrafish (Danio rerio) embryos. Environ Toxicol Chem 2007; 26: 708-716. 5) Bar-Ilan O, Albrecht RM, Fako VE, Furgeson DY. Toxicity assessments of multisized gold and silver nanoparticles in zebrafish embryos. Small 2009; 5: 1897-1910. 6) Pietroiusti A, Massimiani M, Fenoglio I, Colonna M, Valentini F, Palleschi G, Camaioni A, Magrini A, Siracusa G, Bergamaschi A, Sgambato A, Campagnolo L. Low Doses of Pristine and Oxidized Single-Wall Carbon Nanotubes Affect Mammalian Embryonic Development. ACS Nano 2011. 7) Yamashita K, Yoshioka Y, Higashisaka K, Mimura K, Morishita Y, Nozaki M, Yoshida T, Ogura T, Nabeshi H, Nagano K, et al. Silica and titanium dioxide nanoparticles cause pregnancy complications in mice. Nat Nanotechnol 2011; 6: 321-328. 8) Martin KR. The chemistry of silica and its potential health benefits. J Nutr Health Aging 2007; 11: 94-97. Review. 9) Knopp D, Tang D, Niessner R. Review: bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles. Anal Chim Acta 2009; 647: 14-30. Review. RC 15 VALUTAZIONE IN VITRO DELL’EFFETTO EMBRIOTOSSICO DELLE NANOPARTICELLE DI SILICIO Micol Massimiani1 , Luisa Campagnolo1 , Pier Paolo Pompa2 , Stefania Sabella2 , Maria Ada Malvindi2 , Antonella Camaioni1 , Andrea Magrini3 , Antonio Bergamaschi4 , Antonio Pietroiusti3 1 Dipartimento di Sanità Pubblica e Biologia Cellulare 2 Istituto Italiano di Tecnologia, Via Barsanti, 73010 Arnesano (Lecce) 3 Dipartimento di Biopatologia e Diagnostica per Immagini, Università di Roma Tor Vergata, Via Montpellier 1, 00133 Roma 4 Istituto di Medicina del Lavoro, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Largo San Vito 1, 00168 Roma Corrispondenza: pietroiu@uniroma2.it RIASSUNTO. Nel presente lavoro abbiamo valutato l’embriotossicità di nanoparticelle di silice (SiNP) di diverse dimensioni (110, 60 e 24 nm) e funzionalizzazioni (COOH e NH 2 ) utilizzando l’Embryonic Stem cell Test, un test in vitro validato che valuta l’embriotossicità di specie chimiche senza uso di animali. I risultati mostrano che le SiNP sono più tossiche per i fibroblasti rispetto alle cellule mES, e che la presenza di gruppi COOH ha un maggior effetto negativo sulla proliferazione cellulare. Al contrario, nel differenziamento dei corpi embrioidi le SiNP funzionalizzate con gruppi NH 2 mostrano un maggiore effetto inibitorio indipendentemente dalle dimensioni. Parole chiave: nanoparticelle di silice, sviluppo embrionale, cellule staminali. Uno sviluppo responsabile delle nanoscienze e delle numerose applicazioni delle nanoparticelle ingegnerizzate, dall’industria alla biomedicina (1, 2), deve essere necessariamente affiancato da un’attenta valutazione dei rischi per la salute dell’uomo e più in generale per l’ecosistema. Poiché la valutazione della tossicità dei nanomateriali sugli animali impiega notevole tempo e denaro e può inoltre suscitare problemi etici, abbiamo ritenuto utile far uso di un test validato di valutazione dell’embriotossicità in vitro, l’Embryonic Stem cell Test (EST) (3, 4), normalmente utilizzato per sostanze chimiche solubili e già in precedenza utilizzato per i nanotubi di carbonio (5), per valutare l’embriotossicità delle nanoparticelle di silice (SiNP), che presentano interessanti applicazioni dal campo industriale a quello diagnostico e terapeutico (6, 7). A tale scopo abbiamo utilizzato SiNP di tre diverse dimensioni (24, 60 e 110 nm di diametro) e con due diverse funzionalizzazioni (gruppi COOH o NH 2 ), portate in soluzione in acqua sterile e in seguito aggiunte ai terreni di coltura cellulare alle varie concentrazioni testate. Quindi, abbiamo valutato l’effetto delle SiNP sulla proliferazione cellulare facendo crescere cellule embrionali staminali murine (mES) e fibroblasti NIH3T3 (considerati come tessuto adulto) per 10 giorni con gli appropriati terreni in presenza delle diverse nanoparticelle in un intervallo di concentrazioni tra 1 e 200 µg/ml. Al decimo giorno, abbiamo valutato la vitalità cellulare tramite il saggio colorimetrico WST-1 e abbiamo calcolato per ogni tipo cellulare i valori di IC 50 , necessari per l’applicazione dell’EST, per ciascuna delle nanoparticelle testate. I valori di IC 50 che abbiamo ottenuto per le NIH3T3 sono compresi tra 10 e 100 µg/ml per le nanoparticelle funzionalizzate con i gruppi carbossilici, indipendentemente dalle dimensioni; per le SiNP funzionalizzate con gruppi amminici, invece, i valori di IC 50 sono risultati essere compresi tra 100 e 200 µg/ml. Quando abbiamo coltivato le cellule mES in presenza dei diversi tipi di SiNP, i valori di IC 50 ottenuti sono stati maggiori o uguali a 200 µg/ml. Da questi risultati abbiamo potuto concludere che le SiNP mostrano un effetto tossico maggiore sui fibroblasti NIH3T3 rispetto alle mES, e l’effetto inibitorio sulla proliferazione di queste cellule aumenta quando le nanoparticelle sono funzionalizzate con gruppi COOH, mostrando quindi che la presenza di gruppi COOH, piuttosto che NH 2 , ha un effetto negativo sulla proliferazione cellulare. In parallelo, è stato valutato l’effetto di varie concentrazioni di SiNP (da 1 a 100 µg/ml) sulla capacità dei corpi embrioidi (EB, aggregati di cellule che ricapitolano in vitro lo sviluppo embrionale) di differenziare in cardiomiociti contrattili e anche in questo caso sono stati calcolati i valori di ID 50 (valore di inibizione del 50% del differenziamento delle cel-
G Ital Med Lav Erg 2011; 33:3, Suppl 2 47 http://gimle.fsm.it lule mES in cardiomiociti contrattili). Sulla base dei risultati ottenuti da questi esperimenti, abbiamo potuto concludere che le particelle di 110 e 60 nm, funzionalizzate con gruppi COOH, riducono in maniera significativa la percentuale di EB in grado di contrarsi solo alla concentrazione più alta (100 µg/ml), mentre le particelle di 24 nm non hanno alcun effetto. Al contrario di quanto osservato nei saggi di proliferazione, le SiNP funzionalizzate con gruppi NH2 mostrano un significativo effetto inibitorio sulla contrattilità degli EB, indipendentemente dalle dimensioni. BIBLIOGRAFIA 1) Ferrari M. Cancer nanotechnology: opportunities and challanges. Nat Rev Cancer 2005; 5: 161-171. 2) Ferriera L, Karp JM, Nobre L, Langer R. New opportunities: the use of nanotechnologies to manipolate and track stem cells. Cell Stem Cell 2008; 3: 136-146. 3) Scholz G, Spielman H. Embryonic Stem Cell Test (EST). IN- VITTOX 2000; 113: 1-33. 4) Genschow E, Spielmann H, Scholz G, Pohl I, Seiler A, Clemann N, Bremer S, Becker K. Validation of the embryonic stem cell test in the international ECVAM validation study on three in vitro embryotoxicity tests. Altern Lab Anim 2004; 32: 209-244. 5) Pietroiusti A, Massimiani M, Fenoglio I, Colonna M, Valentini F, Palleschi G, Camaioni A, Magrini A, Siracusa G, Bergamaschi A, Sgambato A, Campagnolo L. Low Doses of Pristine and Oxidized Single-Wall Carbon Nanotubes Affect Mammalian Embryonic Development. ACS Nano 2011. 6) Martin KR. The chemistry of silica and its potential health benefits. J Nutr Health Aging 2007; 11: 94-97. Review. 7) Knopp D, Tang D, Niessner R. Review: bioanalytical applications of biomolecule-functionalized nanometer-sized doped silica particles. Anal Chim Acta 2009; 647: 14-30. Review. RC 16 DINAMICA DI ESPOSIZIONE AD AGENTI CHIMICI NEGLI AMBIENTI DI RICERCA DELLE NANOSCIENZE M. Mazzotta1 , A.D. Mazzotta2 , R.G. Cazzato3 , M. Fernandez1 , B. Tamborino4 , G. d’Ettorre5 1 Servizio Prevenzione e Protezione “Università del Salento” 2 Università Tor Vergata Roma Facoltà di Medicina e Chirurgia rif. 0151484 3 U.O. Sorveglianza Sanitaria ASL Brindisi 4 Spesal ASL LE - Lecce 5 Servizio Prevenzione e Protezione ASL Brindisi RIASSUNTO. Nell’ambito delle applicazioni nanotecnologiche per la creazione di strutture artificiali ed eterostrutture nano cristalline, come risultato di sintesi chimica e caratterizzazione strutturale e magnetica, si configura una diversa tipologia di rischio il cui flusso prevede per i tecnici e ricercatori l’alternanza di fasi di studio a fasi operative di intensità variabile in laboratori di nuova concezione per nano-bio-interazione, sintesi di quantun dot, fabbricazione di cluster organici, ovvero speciali clean room, spettroscopia e microscopia, con tecniche e metodiche fisico-chimiche. In tali situazioni abbiamo riscontrato agenti chimici, cancerogeni organici ed inorganici, nanoparticelle in forma cristallina, colloidal quantum dots, reattivi e polimeri di recente immissione e finalizzati esclusivamente a tali scopi. Da un’analisi di dati individuali, nell’ambito di un processo dinamico che tiene conto di quantità, tempi e modalità operative, applicando semplici principi basilari riconducibili al concetto di dose, tempo di esposizione e potenziali effetti biologici, si riportano i risultati e le premesse per una proposta metodologica in cui la quantificazione del rischio, oltre che collegata alla produttività sperimentale, prevede anche programmi di studio e verifica tossicologica dei nuovi composti, sia in fase di sintesi che poi di utilizzazione, impostando la sorveglianza sui possibili eventi attesi. In particolare è evidenziata la possibile esposizione a nanoparticelle abbinando alla quantità, concentrazione e tossicità anche le caratteristiche metastabili e reattive, per possibili effetti sinergici ed interferenti con altri agenti chimici tradizionali. Ne derivano dati di un’esposizione discontinua, ma significativa ad agenti chimici tradizionali utilizzati prevalentemente nei processi di preparazione, un’esposizione frazionale ed episodica ad agenti potenzialmente cancerogeni ed infine a nuovi agenti chimici, la cui identificazione deriva dallo studio delle metodiche e dei processi di sintesi delle nano strutture. Parole chiave: quantum-dot, esposizione, bio-interazione. INTRODUZIONE Ci attendiamo un incremento dei processi di sintesi di nanostrutture e tecniche con uso di NP la cui diffusione negli ambienti in genere è ormai un fatto ben noto (1). Se da una parte in molte situazioni il fenomeno avviene su base inconsapevole es. processi di combustione con una esposizione di “fondo” che ci coinvolge, creando nuovi pattern nei modelli di ricerca, diventa importante chiarire l’esposizione specifica in altrettanti ambienti di produzione e/o di ricerca; ne discende che, se ormai si diffondono molti studi relativi alle situazioni di rischio da nano materiali per esclusivi prodotti di mercato, il settore delle nano scienze rimane ancora molto da studiare. In lavori precedenti (2, 3) abbiamo considerato rischi ambientali non escluso quello cancerogeno, mediante l’applicazione di modelli ben consolidati in base alla normativa vigente; ora nell’ambito della sintesi di nano strutture come i QD s (quantum dots), ci rendiamo conto che: accanto agli elementi semiconduttori (in cui gli elettroni riempiono completamente gli stati della banda di valenza per cui, non sono liberi di muoversi come nei metalli, ed hanno proprietà conduttive quando alcuni elettroni della banda di valenza passano alla banda di conduzione), già di per sé non proprio di familiare conoscenza tossicologica es Silicio Germanio (Si Ge IV gruppo), Gallio Arseniuro AsGa - Indio Antimoniuro InSb (III-V), Cadmio Seleniuro CdSe - Cadmio Solfuro CdS - Zinco Solfuro ZnS (II-VI), ancor più ci mette in difficoltà la combinazione degli stessi con altri composti (polimeri organici), stimolando le condizioni per nuovi studi e nuove conoscenze. MATERIALI E METODI Abbiamo condotto un’analisi di 30 schede di rischio individuali relative a ricercatori ed ambienti in ambito nanoscientifico come: Cleanroom per la produzione con litografia ottica e/o elettronica di substrati (GaAs, SiO2, Si,Indiotinoxide) combinata con photoresist in cui i QD s acquisiscono la forma progettuale utilizzando UV, bromografo-maskaligner, con tecniche di sviluppo, attacco chimico secco, RIE (CF4, CH4H2Ar) o umido HF/H 2 O/(per l’ossido di silicio) e KOH/H 2 O per il silicio, o con litografia elettronica in cui la geometria del substrato/polimero si ottiene con l’Elettron Beam Lithography (EBL) qui le zone esposte agli elettroni vengono dissolte dallo sviluppo (resist positivo) o risultano insolubili (resist negativo). Chemical Vapor Deposition (CVD): ioni metallici dei composti che si vogliono generare, sotto forma di complessi metallo-organici, sono sublimati in condizioni di vuoto e trasportati da un gas inerte su un substrato. Sul substrato la parte organica viene decomposta mentre gli ioni metallici reagiscono e formano i NC desiderati. Laboratorio MBE (Molecular Beam Epitaxy): sistema di epitassia da fascio molecolare a partire da sorgenti solide (gallio, alluminio, indio, arsenico, silicio e berillio Cd, Se, S) in celle di effusione, ed evaporate in ultra alto vuoto (fino a 10 -10 torr), gli atomi sublimati si depongono su una superficie pulita dove possono reagire tra di loro creando nanocristalli altamente puri come ad es: GaAs,CdS, CdSe etc. Laboratori Chimici: reazioni per sintesi di coloranti, polimeri e materiali nanostrutturati con utilizzo di piccoli reattori dotati di refrigerante nel caso delle reazioni ad elevata temperatura, sintesi con linee da vuoto collegate a gas inerti quali azoto e argon. Questa strumentazione permette di operare le sintesi in ambiente anidro e inerte. Per la purificazione dei grezzi di reazione è di solito utilizzata la cromatografia su colonna in gel di silice. I solventi utilizzati in questi laboratori sono: clorurati, eteri, esano, toluene, acetonitrile, alcooli, acetone, etilacetato. “Colloidal Synthesis”: I NC di materiale semiconduttore si formano in soluzione in presenza di sali dei rispettivi componenti e surfattanti opportuni. Fabbricazione di Clusters Organici: le tecniche di spin coating ed evaporazione termica in sistemi “Cluster Tool”, permettono la fabbricazione di dispositivi Oled e Celle Solari, mediante deposizione di film sottili; le tecniche preparative prevedono uso di solventi per il lavaggio, carico in camera di load lock, trasporto in camera organici (dove evaporano numerosi polimeri organici, esempio, l’alfa-NPD, il MeO-TPD, il Rubrene, la CuPc, l’Alq3) e poi in quella dei metalli all’interno della quale si evapora l’oro, l’argento, l’alluminio, il calcio, per essere portato infine
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