ISTRUZIONI PER L'USO BINDAZYME™ Kit EIA IgA umane ... - inova

ISTRUZIONI PER L’USO
BINDAZYME
Kit EIA IgA umane anti-transglutaminasi tissutale
INIBITORE
Kathon
Sodio azide
Proclin 300
Bromonitrodioxano
Metilisotiazone
CONCENTRAZIONE
0,02%
0,099%
0,045%
0,002%
0,002%
MK038
Per uso diagnostico in-vitro
Italian
Prodotto da:
The Binding Site Ltd., P.O.Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Telefone: +44 (0) 121 436 1000
Fax: +44 (0) 121 430 7061
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1 INDICAZIONI
Questo dosaggio è stato ideato per la determinazione in-vitro di specifici
autoanticorpi IgA contro la transglutaminasi tissutale (tGT) presente nel siero
umano come aiuto per la diagnosi e il trattamento della malattia celiaca.
È fornito sufficiente materiale per permettere il dosaggio di un massimo di 41
campioni in doppio o di 89 in singolo, con una curva di calibrazione e due
controlli.
2 INFORMAZIONI GENERALI
La malattia celiaca è caratterizzata da un'intolleranza al glutine che porta ad un
conseguente disordine cronico da malassorbimento dovuto all’infiammazione
della mucosa intestinale e all’appiattimento dell’epitelio 1 .
I nuovi criteri per la diagnosi della malattia celiaca, secondo la Società europea
di gastroenterologia e nutrizione pediatrica (ESPGAN, 1990), richiedono
l’identificazione di una singola biopsia intestinale positiva insieme con la
dimostrazione di almeno due dei tre autoanticorpi IgA specificati di seguito 2 .
Gli autoanticorpi associati con la malattia celiaca includono: anticorpi IgA antiendomisio
3 , anticorpi IgG e IgA anti-gliadina 4 e anticorpi anti-reticolina.
Diversi studi hanno dimostrato che i test per le IgA anti-endomisio hanno una
specificità superiore al 99% per la malattia celiaca con una sensibilità maggiore
rispetto ai test per l’anti-gliadina e anti-reticolina 5,6 . L’antigene bersaglio
dell’endomisio é stato recentemente identificato come l’enzima
transglutaminasi tissutale, proteina calcio-dipendente con capacità di crosslinking
7,8 .
Il test ELISA per le IgA anti-tGT fornisce uan valida alternativa al dosaggio in
immunofluorescenza (IFA) ed è ideale per monitoraggi su piccola e larga
scala 9,10 . L’uso della transglutaminasi tissutale umana ricombinante come fonte
di antigene è studiato nelle referenze 11 e 12.
3 PRINCIPIO DEL TEST
I micropozzetti sono sensibilizzati con l’antigene tGT umano ricombinante.
L’antigene è stato espresso in cellule infettate con Baculovirus e il prodotto di
espressione era originato da un cDNA codificante per l’isoforma con lungo
splicing della tGT umana.
I calibratori, i controlli e i campioni diluiti dei pazienti vengono aggiunti nei
rispettivi pozzetti e gli autoanticorpi presenti che riconoscono l’antigene tGT si
legano durante la prima incubazione. Dopo aver lavato i pozzetti per rimuovere
tutte le proteine non legate, viene aggiunto un coniugato di IgA di coniglio antiuomo
purificate, marcate con perossidasi (specifiche per la catena α). Il
coniugato si lega agli autoanticorpi umani catturati e l’eccesso di coniugato non
legato viene rimosso da un ulteriore fase di lavaggio.
Il coniugato legato è visualizzato col substrato 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina
(TMB) che dà un prodotto di reazione blu, la cui intensità è proporzionale alla
concentrazione di autoanticorpi nel campione. Acido fosforico viene quindi
aggiunto in ogni pozzetto per fermare la reazione. Ciò produce un colore giallo,
che viene letto a 450nm.
4 PRECAUZIONI
4.1 AVVERTENZA
• Tutti i sieri umani forniti sono stati sottoposti a screening per donatori, dando
risultati negativi per gli antigeni di superficie dell’Epatite B e per gli anticorpi dei
virus HIV 1 e 2 e dell’Epatite C. Questi test, comunque, non possono garantire
l’assenza di agenti infettivi. Dovrebbero quindi essere utilizzati appropriati metodi
di manipolazione e smaltimento e solo personale qualificato nel maneggiare
materiale potenzialmente infettivo dovrebbe essere autorizzato ad usare questo
kit.
• La sodio azide può reagire col piombo e col rame delle tubature e formare azidi
metalliche esplosive. Durante lo smaltimento dei reagenti far scorrere un gran
volume di acqua per prevenire l’accumulo di azide.
• I tamponi e il siero forniti in questo kit contengono vari inibitori enzimatici, come
riportato nella tabella sotto. Dovrebbero essere maneggiati con cautela.
Proclin è un marchio registrato di Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA
• Kathon è un agente irritante e può causare sensibilizzazione tramite contatto con
la pelle.
• La soluzione bloccante contiene acido fosforico 3M, che è un irritante. Evitare il
contatto con gli occhi e con la pelle.
• Eventuali riversamenti di reagente dovrebbero essere puliti in modo appropriato,
osservando le regolamentazioni locali ed ambientali.
4.2 PRECAUZIONI
• Questi prodotti dovrebbero essere usati solo da personale specializzato.
• Si raccomanda di osservare rigorosamente il protocollo. Ogni deviazione può
influenzare negativamente il rendimento del test e i risultati ottenuti. Prestare
attenzione alle specifiche “Note” e avvertenze contenute in queste istruzioni per
l’uso.
• I numeri di lotto del calibratore, del controllo, del coniugato e della piastra non
sono intercambiabili. La sostituzione di questi componenti con numeri di lotto
che differiscono da quelli forniti nel kit possono portare a risultati inconsistenti ed
inaccurati. Tutte le strisce utilizzate devono provenire dalla stessa bustina di
alluminio.
• Per evitare la contaminazione dei reagenti, usare solo vetreria nuova o pulita.
Non rimettere mai i reagenti inutilizzati nei loro flaconi.
• Non lasciare mai aperti i flaconi dei reagenti; l’eventuale evaporazione o
contaminazione produrrà risultati inconsistenti.
• Il substrato TMB non deve essere esposto alla luce o all’acqua.
• Siero contaminato da microbi, emolizzato o lipemico e campioni contenenti
materiale in sospensione non devono essere usati.
• L’accuratezza della diluizione del campione non può essere verificata, dal
momento che I controlli del kit sono pronti per l’uso. Si raccomanda l’uso di
pipette calibrate e di appropriati campioni interni CQ.
• L’uso di sistemi di dosaggio in automazione, diluitori per campioni o altra
attrezzatura automatizzata può portare a differenze nel risultato se comparato
alla procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio convalidare il
sistema e assicurarsi che i risultati rientrino nei limiti definiti in questo inserto e
nel certificato CQ allegato.
• Tutta l’attrezzatura utilizzata deve essere calibrata e mantenuta come da
istruzioni del fabbricante.
4.3 CONSERVAZIONE E STABILITÀ
• Il kit va conservato a 2-8°C e non deve essere congelato. Temperature di
conservazione inappropriate possono influire negativamente sul risultato.
• Il tampone di lavaggio diluito può essere conservato a 2-8°C per un massimo di
quattro settimane e può essere usato direttamente freddo senza ripercussioni
sui risultati del saggio.
• La data di scadenza del kit è riportata sull’etichetta esterna.
5 RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
• I campioni di sangue devono essere presi tramite prelievo venoso e lasciati
coagulare naturalmente per separare il siero.
• Il siero può essere conservato a 2-8°C per un massimo di 7 giorni prima del
dosaggio 13 o per conservarlo più a lungo lo si può dividere in aliquote e
conservare a -20°C o a temperature inferiori.
• Il ripetuto scongelamento e ricongelamento dei campioni deve essere evitato.
• I campioni di siero non devono essere inattivati al calore, poichè questo può
dare risultati falsi positivi.
6 MATERIALI
6.1 MATERIALI FORNITI
• Foglietto illustrativo: Dà esaurienti dettagli del test.
• Certificato Controllo Qualità (CQ): Indica i risultati attesi del lotto.
• Human Transglutaminase Coated Wells (Pozzetti rivestiti di transglutaminasi
umana): 12 strisce separabili di 8 pozzetti sensibilizzati con tGT ricombinante.
Ogni piastra è confezionata in una busta di alluminio risigillabile contenente
due bustine essiccanti.
• Type III Sample Diluent (Diluente del campione tipo III): 2 flaconi contenenti
50mL di tampone per la diluizione del campione. Colorato in giallo, pronto per
l’uso.
• Type III Wash Buffer (Tampone di lavaggio tipo III): 1 flacone contenente
50mL di un tampone concentrato 20 volte per lavare i pozzetti.
• Transglutaminase IgA Calibrators (Calibratori IgA transglutaminasi): 5 flaconi
ciascuno contenente 1mL di siero umano diluito, con le seguenti concentrazioni
di autoanticorpi IgG anti-tGT: 100; 33,3; 11,1; 3,7; 1,23 U/mL. Pronto per l’uso.
• Transglutaminase IgA Positive Control (Controllo positivo IgA
transglutaminasi): 1 flacone contenente 1mL di siero umano diluito. Il valore
atteso è fornito sul certificato CQ. Pronto per l’uso.
• Transglutaminase Negative Control (Controllo negativo transglutaminasi): 1
flacone contenente 1mL di siero umano diluito. Il valore atteso è fornito sul
certificato CQ. Pronto per l’uso.
• Transglutaminase IgA Conjugate (Coniugato IgA transglutaminasi): 1
flacone contenente 12mL di anticorpi anti-IgA umane purificati, marcati con
perossidasi. Colorato in verde, pronto per l’uso.
• TMB Substrate (Substrato TMB): 1 flacone contenente 14mL di substrato
TMB. Pronto per l’uso.
• Stop Solution (Soluzione bloccante): 1 flacone contenente 14mL di acido
fosforico 3M. Pronto per l’uso.
Insert Code: E038.I, Version: 9 March 2006, Page 1 of 4

6.2 MATERIALI ED EQUIPAGGIAMENTO SUPPLEMENTARI – non forniti
• Lavatore automatico per micropiastre: È consigliato, sebbene il lavaggio
della piastra possa essere eseguito manualmente.
• Lettore per piastre: In grado di misurare la densità ottica a 450nm, calibrato
contro aria.
• Acqua distillata o deionizzata: Si raccomanda l’uso di acqua della migliore
qualità disponibile.
• Micropipette calibrate: Per dosare 1000, 100 e 10µL.
• Pipetta multicanale: Consigliata per dosare volumi di 100µL di coniugato,
substrato e soluzione bloccante.
• Provette di vetro/plastica: Per la diluizione dei campioni.
7 METODOLOGIA
7.1 PROCEDURE PRECEDENTI AL TEST
1. Portare il kit a temperature ambiente
• Il kit deve essere utilizzato a temperatura ambiente (20-24°C).
• Prendere il kit dal luogo in cui è conservato e lasciarlo a temperatura ambiente
per circa 60 minuti. I pozzetti non devono essere rimossi dall’involucro in
alluminio fino a quando non raggiungono la temperatura dell’ambiente.
Nota: I kit possono rimanere a temperatura ambiente per una settimana.
2. Componenti del kit
Rimescolare delicatamente ciascun componente del kit prima dell’uso.
3. Diluizione del tampone di lavaggio
Aggiungere 50mL di tampone di lavaggio concentrato a 950mL di acqua
distillata (diluizione 1/20) in un contenitore pulito e mescolare. Volumi più
piccoli possono essere diluiti come opportuno.
Nota: Il tampone di lavaggio diluito può essere conservato a 2-8°C fino a 4
settimane, quindi diluire solo la quantità più appropriata. Se il tampone dovesse
mostrare segni di contaminazione microbica o diventa opaco, gettarlo via e
prepararne dell’altro.
4. Diluizione del campione
Diluire 10µL di ciascun campione con 1000µL di diluente per campioni (1:100)
e mescolare bene.
Nota: I campioni diluiti devono essere utilizzati entro 8 ore.
5. Uso delle strisce e del supporto
Posizionare il necessario numero di pozzetti nel supporto. Disporli a partire dal
pozzetto A1, riempiendo le colonne da sinistra a destra attraverso la piastra.
Nel maneggiare la piastra, premere i lati lunghi del supporto per evitare che i
pozzetti fuoriescano.
Nota: Rimettere immediatamente i pozzetti non utilizzati nella busta di
alluminio con le due bustine di essiccante e risigillare accuratamente per
minimizzare l’esposizione all’umidità. Fare attenzione a non bucare o strappare
la busta di alluminio, come indicato anche di seguito.
ATTENZIONE: L’esposizione dei pozzetti all’umidità o alla
contaminazione da polvere o da altro materiale contaminato può risultare
in una degradazione dell’antigene con conseguente scarsa precisione del
test e risultati potenzialmente falsi.
7.2 METODO DI DOSAGGIO
Rispettare la stessa sequenza di dispensazione durante tutto il test.
1. Dispensazione del campione
Distribuire 100µL di ciascun calibratore, controllo e campione diluito 1:100 negli
opportuni pozzetti della piastra fornita.
Nota: I campioni dovrebbero essere dispensati sulla piastra il più velocemente
possibile per minimizzare variazioni nel saggio, ed il timer deve partire dopo
l’aggiunta dell’ultimo campione.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Lavaggio
La procedura di lavaggio è critica e richiede una particolare attenzione. Una
piastra lavata male darà risultati inaccurati, poco precisi e con elevato valore di
fondo.
Dopo l’incubazione rimuovere la piastra e lavare i pozzetti 3 volte con 250-
350µL di tampone di lavaggio per pozzetto. Lavare la piastra o usando un lavapiastre
automatico o manualmente come sotto indicato. Dopo il lavaggio
automatico finale, capovolgere la piastra e far sgocciolare i pozzetti su carta
assorbente.
Le piastre possono essere lavate manualmente come segue:
a. Svuotare il contenuto della piastra nel lavandino.
b. Far sgocciolare i pozzetti su carta assorbente battendo delicatamente
sulla sommità.
c. Riempire ogni pozzetto con 250-350µL di tampone di lavaggio usando
una pipetta multicanale.
d. Scuotere delicatamente la piastra su una superficie piana.
e. Ripetere due volte i passaggi a-d.
f. Ripetere a e b.
3. Dispensazione del coniugato
Distribuire 100µL di coniugato in ogni pozzetto, asciugare la sommità dei
pozzetti con carta assorbente per rimuovere eventuali schizzi.
Nota: Per evitare contaminazioni, non rimettere mai il coniugato avanzato nel
flacone.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Lavaggio
Ripetere la fase 2.
5. Dispensazione del substrato (TMB)
Distribuire 100µL di substrato TMB in ogni pozzetto, asciugare la sommità dei
pozzetti con carta assorbente per rimuovere eventuali schizzi.
Nota: Per evitare contaminazioni, non rimettere mai il TMB avanzato nella
flacone.
Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
6. Dispensazione del bloccante
Distribuire 100µL di soluzione bloccante in ciascun pozzetto. Questo provoca
un viraggio di colore dal blu al giallo.
7. Misura della densità ottica
Leggere la densità ottica (DO) di ciascun pozzetto a 450nm su un lettore di
micropiastre entro 30 minuti dalla dispensazione della soluzione bloccante.
8 RISULTATI E CONTROLLO QUALITÀ
1. Controllo qualità
Affinchè l’analisi sia valida, tutti I seguenti criteri devono essere soddisfatti:
• I calibratori e i controlli positivi e negativi devono essere inclusi ogni volta.
• I valori ottenuti per il controllo positivo e negativo devono ricadere nell’intervallo
specificato nel Certificato CQ.
• La forma della curva deve essere simile alla curva di calibrazione mostrata nel
Certificato CQ.
Se i suindicati criteri non sono soddisfatti, il dosaggio non è valido e deve
essere ripetuto.
2. Calcolare la media delle densità ottiche (solo per prove in doppio)
Per ciascun calibratore, controllo e campione, calcolare la densità ottica media
delle due letture. La percentuale del coefficiente di variazione (%CV) della DO
per ogni duplicato deve essere inferiore al 15%.
3. Tracciare la curva di calibrazione
La curva di calibrazione può essere tracciata automaticamente o manualmente
riportando la concentrazione degli autoanticorpi IgA anti-tGT sulla scala
logaritmica contro la DO sulla scala lineare per ogni calibratore:
• Automatico – usare un software adeguatamente validato e la curva che meglio
si conforma ai dati.
• Manuale – usando carta log/lineare per grafici, disegnare una curva continua
che si adatti a tutti i punti (non una linea retta o una punto-punto).
4. Trattamento dei punti anomali
Se uno dei punti non si posiziona sulla curva, può essere eliminato. Se
l’assenza di questi punti determina che la curva abbia una forma diversa da
quella di calibrazione dei campioni, o più di un punto risulta essere anomalo, la
prova deve essere ripetuta.
5. Calcolo dei valori di controllo
Leggere il livello degli autoanticorpi IgA anti-tGT dalla curva di calibrazione. Il
valore deve rientrare nell’intervallo riportato nel Certificato CQ.
6. Calcolo del livello di autoanticorpi nei campioni diluiti
Leggere il livello degli autoanticorpi IgA anti-tGT nei campioni diluiti
direttamente dalla curva di calibrazione.
Nota: I valori dei calibratori sono stati corretti di un fattore 100 per tenere conto
della diluizione 1:100 dei campioni, quindi nessuna ulteriore conversione è
richiesta.
7. Calibrazione del dosaggio
Il dosaggio è calibrato in U/mL contro un riferimento arbitrario, dal momento
che nessun riferimento internazionalmente riconosciuto è al momento
disponibile.
8. Limiti
• Il kit deve essere utilizzato solo come ausilio nella diagnosi. Un risultato
positivo è indice di alcune patologie che devono essere confermate da ricerche
cliniche e altri test sierologici.
• I risultati ottenuti da questo dosaggio non costituiscono una prova diagnostica
della presenza o assenza di malattia.
• Non è stato stabilito l' uso di questo dosaggio per i campioni pediatrici né sono
stati definiti i relativi valori normali (interpretazione del risultato).
• Un risultato negativo può essere dovuto a insufficienza di IgA e non esclude la
malattia celiaca.
FDA (USA) Avvertenze: vedere la pagina iniziale delle instruzioni per l’uso in
Inglese.
9 VALORI ATTESI
L’intervallo dei valori normali è stato determinato sul siero di 200 donatori di
sangue adulti sani. Si è accertata in uno di questi campioni la presenza di
anticorpi anti-tGT (Sezione 10.4).
I valori sono forniti solo come guida. I test ELISA sono molto sensibili e capaci
di individuare piccole differenze in popolazioni campione. Si raccomanda ad
ogni laboratorio di determinare il proprio intervallo di normalità basato sulla
popolazione, sulle tecniche e sull’ equipaggiamento impiegato.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Negativo
< 4,0 U/mL
Debolmente positivo
4 – 10 U/mL
Positivo
> 10 U/mL
10 CARATTERISTICHE METODOLOGICHE
10.1 PRECISIONE
PRECISIONE INTRA-SAGGIO
La precisione intra-saggio è stata determinata usando sei campioni testati
entro l’intervallo della curva di calibrazione. La % CV per ogni campione è qui
riportata.
Insert Code: E038.I, Version: 9 March 2006, Page 2 of 4

PRECISIONE INTRA-SAGGIO
n=20 Concentrazione (U/mL) % CV
Campione 1 2,8 2,8
Campione 2 5,1 3,9
Campione 3 15,8 1,9
Campione 4 21,6 3,2
Campione 5 29,4 5,5
Campione 6 55,8 3,3
PRECISIONE INTER-SAGGIO
La precisione inter-saggio è stata determinata usando sei campioni testati in
doppio sei volte per tre giorni. La % CV per ogni campione è qui riportata:
PRECISIONE INTER-SAGGIO
n=6 Concentrazione (U/mL) % CV
Campione 1 3,2 4,5
Campione 2 5,3 5,8
Campione 3 17,2 6,8
Campione 4 25,2 7,1
Campione 5 30,5 6,9
Campione 6 74,0 6,7
10.2 SENSIBILITÀ ANALITICA
Una sensibilità di dosaggio di 1,23 U/mL è stata confermata testando due
campioni in repliche multiple con valori di 1,5 e 2,5 volte il punto di calibrazione
più basso (1,23 U/mL). Analisi statistiche impiegando il test ‘t’ di Student hanno
confermato che questi campioni erano significativamente diversi tra loro
(p

Schema della piastra
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
B
C
D
E
F +
G
H
Insert Code: E038.I, Version: 9 March 2006, Page 4 of 4