Clonaggio del DNA Clonaggio del DNA - CusMiBio - Università ...

Pertanto, quando si effettua un esperimento di trasformazione batterica con una miscela di ligazione, molecole
diverse possono penetrare all’interno della cellule batteriche. Tra queste, solo le molecole di vettore con struttura
circolare, siano esse ricombinanti (cioè con inserto) oppure non ricombinanti (cioè senza inserto), danno luogo
alla formazione di trasformanti capaci di crescere in terreno selettivo (cioè con l’antibiotico).
Tuttavia, come è possibile determinare se le cellule batteriche che crescono su un terreno contenente l’antibiotico
contengono il plasmide ricombinante oppure quello non ricombinante Esistono diversi modi, uno dei quali è
illustrato nel paragrafo successivo e costituisce lo scopo del nostro esperimento di laboratorio.
2.5 BIANCO O BLU
I plasmidi della serie pUC sono ampiamente utilizzati come vettori di clonaggio, in quanto consentono di
distinguere facilmente le cellule batteriche che hanno acquisito il vettore con inserto (vettore ricombinante) da
quelle che hanno acquisito il solo vettore (vettore non ricombinante). Questo si ottiene con un semplice test
colorimetrico (bianco o blu), per comprendere il quale è tuttavia necessario conoscere la base teorica
dell’operone lattosio.
2.5.1 L’operone lattosio in E. coli
L’esempio classico del funzionamento di un operone inducibile (vedi § 1.5) in E. coli è rappresentato
dall’operone lattosio (o operone lac).
I batteri utilizzano per il loro metabolismo sostanze organiche, come per esempio i carboidrati, che vengono
trasformati in intermedi più semplici attraverso vie fermentative o mediante ossidazione completa a CO 2 e H 2 O.
La complessità del carboidrato impone l'utilizzo di diversi enzimi, che devono facilitarne l'assimilazione da parte
delle cellule. Alcuni di questi enzimi sono sempre presenti, mentre altri devono essere sintetizzati all'occorrenza.
Ad esempio in E. coli gli enzimi della glicolisi, necessari per l’utilizzo del glucosio come fonte energetica, sono
sempre presenti nella cellula indipendentemente dalle condizioni di crescita. Ne consegue che, in presenza di tale
zucchero, le cellule inizieranno a moltiplicarsi subito. Se, invece, il substrato è rappresentato da un altro
zucchero, quale il lattosio (Fig. 20), le cellule inizieranno a dividersi con un certo ritardo (fase di latenza) dovuto
al fatto che le cellule devono sintetizzare gli enzimi richiesti per il metabolismo del lattosio. Questi enzimi si
dicono enzimi inducibili: essi sono presenti nella cellula in minima quantità, ma il loro livello aumenta
notevolmente in presenza del relativo substrato (in questo caso il lattosio).
Legame beta-glicosidico
galattosio
glucosio
Fig. 20. Il lattosio è un disaccaride formato dall'unione di una molecola
di galattosio con una molecola di glucosio mediante un legame
beta-glicosidico.
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