Clonaggio del DNA Clonaggio del DNA - CusMiBio - Università ...

Vettore non ricombinante:
colonie blu
Vettore ricombinante:
colonie bianche
Fig. 22. In un ceppo batterico mutante che non esprime la beta-galattosidasi, i plasmidi in cui il gene lacZ +
non è interrotto dal DNA estraneo produrranno l’enzima e origineranno un colore blu utilizzando il
substrato cromogeno X-gal. Se il gene lacZ è interrotto dal DNA estraneo, non si può avere sintesi
dell’enzima attivo. Le colonie con il vettore ricombinante inserito all’interno del gene lacZ + saranno
perciò bianche.
lacA dopo essersi legata al
promotore, è impedita nella
sua funzione. Quando
cellule di E. coli si trovano
in presenza di lattosio,
limitate quantità di
zucchero penetrano
all'interno della cellula
grazie a proteine
trasportatrici aspecifiche di
membrana; il lattosio
(induttore) si legherà poi al
repressore modificandone
la struttura ed impedendone
l’attacco all' operatore,
rendendo così possibile
l'espressione dei geni
strutturali lacZ, lacY e lacA
e la produzione delle
corrispondenti proteine.
Come illustrato nel § 2.2.1 (Fig. 16), il vettore pUC contiene il gene selvatico (o wild type) lacZ + che codifica la
beta-galattosidasi attiva, in grado di scindere il lattosio nei due monomeri. All’interno di questo gene è presente
il polylinker, in corrispondenza del quale, come abbiamo detto, avviene l’inserimento di DNA esogeno.
Come si può notare nella Fig. 22, se un frammento di DNA viene inserito nella regione del polylinker, si
determina un’inserzione nel gene lacZ + ; il codice di lettura per la beta-galattosidasi viene interrotto e non può
essere prodotta beta-galattosidasi funzionale.
Se una cellula batterica viene trasformata dal solo plasmide pUC (cioè dal vettore non ricombinante), in presenza
di un induttore artificiale come l’IPTG (isopropil-tiogalattoside), che è un analogo del lattosio, e di un substrato
cromogeno della beta-galattosidasi, come l’X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-galattoside), la betagalattosidasi
scinde l’X-gal in un prodotto colorato precursore dell’indaco (Fig. 23). Le colonie batteriche quindi
assumeranno un colore blu. Se nel gene lacZ + del plasmide vettore è stato inserito del DNA estraneo, e quindi il
vettore è diventato un vettore ricombinante, le cellule batteriche trasformate non producono più una betagalattosidasi
attiva. Pertanto in presenza di IPTG (l’induttore artificiale dell’operone lac) e di X-gal,
quest’ultimo in mancanza dell’enzima beta-galattosidasi non può essere più trasformato nel precursore
dell’indaco. Le colonie batteriche quindi, trasformate con un vettore ricombinante, saranno bianche (Fig. 24).
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