Clonaggio del DNA Clonaggio del DNA - CusMiBio - Università ...

4.4 ATTIVITA’ 2: RICOMBINANTE O NON RICOMBINANTE
4.4.1 Miniprep di DNA plasmidico: metodo boiling
Questo esperimento ha lo scopo di estrarre il DNA plasmidico, al fine di confermare se esso è ricombinante
oppure no.
I batteri, cresciuti durante la notte, saranno raccolti per centrifugazione e lisati con un trattamento al calore
(donde il nome boiling, dato a questo metodo di estrazione di DNA plasmidico).
Estrazione del DNA
centrifugare la mini-coltura batterica 5 minuti a 13 Krpm (cioè 13.000 rivoluzioni per minuto) ed
eliminare il surnatante in un becker; la provetta va poi fatta sgocciolare sulla carta assorbente
risospendere il pellet con 530 µl di soluzione A già addizionata con 1µl di proteinasi K
miscelare con la micropipetta per risospendere le cellule
addizionare 25 µl della soluzione di lisozima
miscelare per inversione (5 x)
incubare per 10 minuti a 95°C in un termostato a secco
centrifugare 10 minuti a 13 Krpm
eliminare il pellet (usando uno stuzzicadenti)
Precipitazione del DNA
al surnatante addizionare 450 µl di isopropanolo
“vortexare”
tenere 5 minuti a temperatura ambiente
centrifugare 5 minuti a 13 Krpm, eliminare il surnatante
addizionare 400 µl etanolo 70%
centrifugare 5 minuti a 13 Krpm, eliminare il surnatante
asciugare pellet in essiccatore a vuoto
risospendere con 50 µl TE + RNAsi A (che degrada l’RNA)
“vortexare”
incubare 10 minuti a 37°C
4.4.2 Digestione con un enzima di restrizione
Una volta estratto il DNA plasmidico dalle cellule batteriche trasformate (ossia che erano cresciute su
ampicillina), bisogna determinare se il vettore è ricombinante (contiene un inserto) oppure no. Il colore della
colonia batterica (bianco o blu) è già un indizio; tuttavia, la presenza dell’inserto nel vettore estratto dalle colonie
batteriche bianche deve essere verificata. Per fare ciò è necessario effettuare la digestione con un enzima di
restrizione che consenta di “ritagliare” (ossia excidere) l’inserto dal vettore. In particolare, l’inserto viene exciso
con lo stesso enzima di restrizione utilizzato per clonarlo. Ad es., se il vettore era stato linearizzato con EcoRI, il
cui sito di restrizione è presente nel polylinker, e anche il frammento di DNA inserito nel vettore era stato
ritagliato dal DNA genomico sempre con EcoRI, dopo ligazione l’inserto è excidibile con EcoRI. Una digestione
con BamHI in questo caso non consentirebbe di excidere l’inserto!
prelevare 3 µl di miniprep risospesa in TE + RNAsi A
aggiungere 1 µl di tampone per EcoRI 10x
aggiungere 1 µl di enzima EcoRI (5 unità/µl)
aggiungere 5 µl di acqua distillata sterile
incubare 30 minuti a 37°C
Nel caso in cui non vi fosse tempo a sufficienza, verrà fornita agli studenti la digestione con l’enzima di
restrizione del DNA di un vettore ricombinante e di un vettore non ricombinante.
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