Clonaggio del DNA Clonaggio del DNA - CusMiBio - Università ...

moltiplicare il valore medio ottenuto per 4 (si ottiene il numero di colonie totali/piastra)
calcolare l’efficienza di trasformazione: n° colonie x fattore di diluizione / ng DNA x 1000
(ricordate che 1 γ = 1000 ng, e che il fattore di diluizione nel nostro caso è 100 µl/1000 µl = 10).
4.3.3 Allestimento di una mini-coltura batterica
Sulle piastre che contengono ampicillina, dopo trasformazione, sono cresciute le colonie batteriche trasformanti
che hanno acquisito il plasmide pGEM che, contenendo il gene amp, conferisce resistenza all’ampicillina (vedi §
2.2.1). Questo plasmide può essere ricombinante o non ricombinante. Le colonie contenenti un plasmide non
ricombinante, cioè che dopo la ligazione si è rilegato su se stesso, si presenteranno blu, quelle contenenti un
plasmide ricombinante, saranno bianche (vedi § 2.6).
Per confermare che le colonie batteriche bianche contengano davvero un vettore che ha incorporato un inserto, e
per estrarre il DNA plasmidico da ciascuna colonia trasformante ed analizzare le dimensioni dell’inserto, è
necessario prima allestire una mini-coltura batterica in terreno liquido, in modo da ottenere un numero di cellule
più elevato che non quello di una colonia batterica, da cui estrarre il plasmide.
Allestimento della coltura batterica in una provetta eppendorf:
mettere 0,5 ml di terreno di coltura con ampicillina in una provetta eppendorf da 1,5 ml
identificare una colonia batterica, sia essa bianca o blu, purché sia singola e ben separata dalle altre
colonie
con uno stuzzicadenti sterile prelevare la colonia batterica, inserendo lo stuzzicadenti verticalmente nella
colonia
stemperare la colonia batterica nel terreno di coltura
chiudere la eppendorf e incubare over night a 37°C.
4.3.4 Risultati ed interpretazione
Le cellule di E. coli sono state trasformate con un vettore che porta come marcatore selettivo il gene per la
resistenza all’ampicillina. Dal momento che il ceppo batterico utilizzato (XL1 Blue) è amp s (ampicillinasensibile),
esso non sarà in grado di formare colonie in un terreno con l’agente selettivo (l’antibiotico
ampicillina). Esso acquisisce la capacità di crescere in presenza di ampicillina solo se al suo interno penetra il
vettore. Pertanto, il risultato atteso, dopo trasformazione, è il seguente:
Trasformazione con:
Ceppo batterico miscela di ligazione pGEM
(controllo pos.)
acqua
(controllo neg.)
XL1 Blue + + -
Colore colonie Bianche, blu Solo blu -
+ = presenza di colonie
- = assenza di colonie
Le cellule che crescono su ampicillina hanno pertanto acquisito il vettore. Quanto al colore delle colonie, esse
saranno solo blu se i batteri sono stati trasformati con pGEM (vettore wild type); alcune bianche e alcune blu, se
la trasformazione è stata effettuata con la miscela di ligazione. Infatti nella miscela di ligazione coesistono
plasmidi ricombinanti e non ricombinanti, perciò non tutte le colonie avranno incorporato il pGEM contenente il
gene esogeno, che impedisce l’espressione del gene per la beta-galattosidasi.
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