江翊綸 - 黃慶璨研究室

生化科技學系微生物學組專題討論
題目 : Toluidine Blue-Mediated Photodynamic Effects on Staphylococcal Biofilms
作者: Mrinalini Sharma, Livia Visai, Francesca Bragheri, Haria Cristiani,
Pradeep Kumar Gupta, and Pietro Speziale
文章來源:Antimicrobial Agents and Chemotherapy 52(1): 299-305, 2008
演講人:I-Lun Chiang 江翊綸 B93601026
指導老師:Ching-Tsan Huang PhD 黃慶璨 博士
演講日期:December 9th, 2008
演講地點:The 6th Classroom
摘要
葡萄球菌屬是醫院和醫療設備相關感染的重要來源,它們的致病力歸因於其
所形成的生物膜可保護菌體免於免疫系統的清除與增加對吞噬作用和抗生素的
抗性。光動力治療近年來被視為可有效抑制生物膜細菌生長的一種替代方法,在
本研究中,作者探討以甲苯胺藍 (Toluidine blue O, TBO) 作為光感物質的光動力
作用對表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis) 和 methicill 抗性金黃色葡萄
球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 生物膜生長和結構的影響。
當葡萄球菌生物膜加入光感物質 TBO 並以雷射照光後,細胞生長明顯受抑
制,且光動力抑菌效果好壞取決於光照劑量大小。共軛焦雷射掃描顯微影像顯示
以光動力處理的生物膜細菌細胞膜遭到破壞。除此之外,掃描電子顯微鏡影像也
顯示光動力處理過的生物膜結構被破壞和細胞數量減少。Tetrasodium EDTA 前處
理對於 TBO 的光動力效果在 S. epidermidis 生物膜有增強的現象,但在 S. aureus
生物膜卻沒有顯著差異。此結果顯示,光動力處理可能是一個有效抑制附著在醫
療植入器材固體表面的葡萄球菌生物膜的方式。
Keywords:Staphylococcal biofilm, photodynamic, Toluidine blue O, TEDTA
前言
本研究之重要性
金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是病人身上骨隨炎、心內膜炎、導尿管感染和
骨科移植病人身上最常見的致病菌,但這些感染的管理因生物膜的抗藥性而愈
加困難,光動力作用則會因光線不易穿透生物膜而降低效果,因此找到一個能
增加光感物質在生物膜內穿透力的方法乃當務之急。
前人作過的研究
生物膜抗藥性的幾種可能機制包括生物膜會使抗生素的穿透性降低、降低生物
膜中細胞生長速率、壓力反應的活化、biofilm-specific 表現型的出現 [1] 。許多
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研究顯示利用不同光感物質對革蘭氏陽性和陰性菌的懸浮菌體有光動力抑菌
效果,但由於光的穿透性在生物膜受到阻礙,利用 merocyanine 540 進行光動
力抑制金黃色葡萄球菌生物膜生長的光照劑量比抑制懸浮金黃色葡萄球菌高
很多 [2] 。Zanin 等人利用共軛焦雷射掃描顯微鏡發現,由於光感物質無法擴散
進細胞內部,Streptococcus mutans 生物膜中的光感作用只發生於細胞壁外膜
[3] 。其他研究也顯示生物膜中的胞外聚合物物質會影響光感物質的穿透性,因
而降低光激發過程產生的效應 [4] 。最近的研究顯示,金屬螯合物如 disodium
EDTA 和 tetrasodium EDTA (TEDTA) 可藉由破壞生物膜結構而抑制細菌生
長、增加生物膜中革蘭氏陽性和陰性菌體對光感物質的敏感性 [5] 。
作者為何要作本研究
雖然光動力治療在牙菌斑和口腔植入物上生物膜的光動力抑菌效果研究很
多,但卻很少有人探討光動力作用在葡萄球菌生物膜的抑菌效果研究。
Toluidine blue O (TBO)雖曾被用做抗菌光感物質,但其對於葡萄球菌生物膜的
生長和結構影響則尚未被研究過。
本研究欲完成之項目
檢視 TBO 這個光感物質對於葡萄球菌生物膜的生長和結構之光動力效應,並
進一步分析利用 TEDTA 進行前處理的生物膜其光動力抑菌效果。
材料與方法
菌株和培養條件
此研究利用的菌株為 S. epidermidis 1457 和 methicillin-resistant S. aureus LP,細
菌在 37℃有氧條件下過夜培養於 Tryptic soy broth (TSB)。
生物膜培養
為了篩選由葡萄球菌形成的生物膜,細菌生長於 Congo red agar。為了增加 S.
aureus 生物膜的形成,平板微量滴定盤塗有 20% 濃度的人類血漿。
光感物質
1 mM TBO 原液是以蒸餾水配製並過濾後存放在 4℃的暗處,當要使用時 TBO
原液以 PBS 稀釋至目標濃度。
光動力抑菌研究
不同濃度的 TBO 加到平板微量滴定盤,在 37℃避光培養 30 分鐘,對照組只
以 PBS 培養。TBO 處理過的生物膜以 640 nm 的激光二極體 (LED) 光照射。
照光後,將所有樣品以 TSB 洋菜培養基計算生菌數。控制組包括了有用 TBO
處裡但未照光(S + L - )、沒用 TBO 處理只照光(S - L + )、沒用 TBO 處理也沒照光
(S - L - ),S 和 L 分別代表 sensitizer 和 light。存活率為細菌以 TBO 處理並照光後
的菌落生成單位 (CFU) 除以未照光對照組之菌落生成單位。
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TEDTA 的效應
生物膜以不同濃度的 TEDTA 處理,然後以 TSB 洋菜培養基計算生菌數。
在 TBO 處理前,生物膜先用 20 mM TEDTA 處理一小時來探討 TEDTA 對光動
力作用的效應,控制組包括有用 TEDTA 和 TBO 處理但沒照光的生物膜
(TEDTA + S + L - )、只用 TEDTA 處理的生物膜(TEDTA + S - L - )、未經過 TEDTA 和
TBO 處理也未照光的生物膜(TEDTA - S - L - )。
共軛焦雷射掃描顯微鏡 (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)
為了方便觀察 S. aureus 生物膜生成,蓋玻片塗抹上人類血漿,含有細菌懸浮
液的蓋玻片於 37℃培養 16 小時,光動力作用後的生物膜樣本以 BacLight
Live/Dead 染色區分活細胞和死細胞,死細胞呈現红色螢光、活細胞呈現綠色
螢光。生物膜內部細菌存活以共軛焦雷射掃描顯微鏡觀察。
掃描電子顯微鏡 (Scanning Electronic Microscopy, SEM)
光動力作用後,樣本經多次清洗並固定於載玻片上以掃描電子顯微鏡觀察。
統計分析
以 Student t test 進行統計分析,P

propidium iodide 的通透性增加,顯示細胞膜可能是 TBO 這種光感物質進行光
動力毒殺作用的重要位置。細胞膜的破壞可能減少生物膜中細胞與細胞的聯繫
或細胞與 EPS 的結合,造成生物膜中的細胞大量減少。
以 TEDTA 處理對於光動力作用的影響
TEDTA 為一種金屬離子螯合劑,可破壞生物膜的結構以增加光感物質和光的
通透性。結果發現 20 mM TEDTA 處理後再經 TBO 光動力作用可大量降低菌
體存活率。TEDTA 前處理與否對於 S. epidermidis 1457 生物膜的光動力抑菌效
果有顯著性差異(圖二)。以 TEDTA 處理但未經過光動力作用的生物膜其
CLSM 影像呈現綠色螢光,顯示 TEDTA 並不會造成細胞死亡;以 TEDTA 前
處理和 TBO 處理並用 100 J/cm 2 照射的生物膜,其 CLSM 影像呈現較多的紅色
螢光細胞,表示 TEDTA 有助於 TBO 的穿透性而增強光動力效果(圖三 B)。掃
描電子顯微鏡觀察顯示單獨以 TEDTA 處理的生物膜只呈現些微抑菌效果,若
再經過光動力作用,由於生物膜結構被破壞使得光動力作用效果增強,細菌數
比 100 J/cm 2 照光劑量下未用 TEDTA 前處理的生物膜少很多(圖四 g~j)。
參考文獻
[1] Mah, T. F., and G. A. O’Toole. (2001) Mechanisms of biofilm resistance to
antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9:34-39.
[2] Lin, H. Y., C.T. Chen, and C. T. Huang. (2004) Use of merocyanine 540 for
photodynamic inactivation of Staphylococcaus aureus planktonic and biofilm
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[3] Zanin, I.C., M. M. Lobo, L. K. Rodrigues, L.A. Pimenta, J. F. Hofling, and R. B.
Goncalves. (2006) Photosensitization of in vitro biofilms by toluidine blue O
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[4] Gad, F., T. Zahra, T. Hasan, and M. R. Hamblin. (2004) Effects of growth phase
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and killing of Pseudomonas aeruginosa cells in a biofilm. Appl. Environ.
Microbiol. 72:2064-2069.
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圖表
圖一、葡萄球菌生物膜定量與不同光照劑量下的存活率
左圖為用結晶紫方法定量生物膜,於590 nm下測吸光值大小,結果S. epidermidis
1457生物膜形成量較多。右圖為以40 μM TBO處理的生物膜於不同光照劑量下的
存活率,■, S. epidermidis 1457; ●, S. aureus LP
圖二、TEDTA 前處理對於 TBO 在生物膜的光動力作用之影響
生物膜以 TEDTA 處理 1 h 後培養 16 h,(A)不同濃度之 TEDTA 對於生物膜中細
菌細胞的存活率,白色代表 S. epidermidis 1457;灰色代表 S. aureus LP。(B)用
TEDTA 處理與未用 TEDTA 處理的生物膜之光動力作用存活率比較,以 20 mM
TEDTA 前處理再用 40 μM TBO 培養 30 分鐘後以光照劑量 100 J/cm 2 照射。深灰
色是未經 TBO 處理也未照光(S - L - );淺灰色是經 TBO 處理但未照光(S + L - );白色
是經 TBO 處理且有照光(S + L + );深灰斜線是有用 TEDTA 前處理但未經 TBO 處
理也未照光(TEDTA + S - L - );淺灰斜線是有用 TEDTA 前處理和 TBO 處理但未照
光(TEDTA + S + L - );白色斜線是有用 TEDTA 前處理和 TBO 處理和照光(TEDTA +
S + L + )。*代表用 TEDTA 前處理與否對於 S. epidermidis 1457 生物膜的光動力抑
菌效果有顯著性差異(P

圖三、光動力作用後的葡萄球菌生物膜之共焦雷射掃描影像
生物膜以 BacLight Live/Dead 方法染色,死細胞呈現螢光红、活細胞呈現螢光綠
色。(A)光照劑量對於光動力的影響,S + L - ,0 J/cm 2 (a,d);S + L + ,100 J/cm 2 (b,e);S + L + ,
200 J/cm 2 (c,f)。(B)TEDTA 前處理對於光動力作用的影響,TEDTA + S - L - (a,c);
TEDTA + S + L + , 100 J/cm 2 (b,d)。
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圖四、光動力作用的葡萄球菌生物膜之掃描電子顯微影像,生物膜以 40 μM TBO
避光培養 30 分鐘的對照組(a,b);光照劑量 100 J/cm 2 (c,d);光照劑量 200 J/cm 2 (e,f);
用 20 mM TEDTA 前處理 1 h 但未進行光動力作用(g,h)或以光照劑量 100 J/cm 2
進行光動力作用(i,j)。
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