Biologia e Fisiologia Celular - UFPB Virtual - Universidade Federal ...

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4.6.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA 18 Biologia e Fisiologia Celular Na microscopia eletrônica de varredura o feixe de elétrons não atravessa o material biológico. A microscopia eletrônica de varredura se baseia na geração de elétrons secundários, que são emitidos por uma amostra após a mesma ser excitada por um feixe de elétrons, ou por elétrons retroespalhados, sendo a primeira técnica a mais utilizada por gerar imagens com melhor definição (maior profundidade de campo). Os elétrons secundários são coletados por um detector, que gera uma imagem virtual do material analisado. O material precisa ser fixado, desidratado e recoberto com ouro ou carbono para a obtenção de imagens topográficas com alta resolução. A figura 1.12 ilustra uma fotomicrografia eletrônica de varredura. Figura 1.12 - Fotomicrografia eletrônica de varredura de pólens das espécies Helianthus annuus (Girasol), Ipomoea purpúrea (Corda-de- Viola ou Glória da Manhã), Sidalcea malviflora (Malva-Rosa), Lilium auratum (Lírio), Oenothera fruticosa (Onagra) e Ricinus communis (Mamona). Fonte: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a4/Misc_pollen.jpg :: TA NA WEB!!! :: Nos links abaixo você irá encontrar uma série de textos, imagens e animações sobre microscopia. Nobel Prize’s Microscopes http://nobelprize.org/educational/physics/microscopes/1.html American Society for Cell Biology (Image & Video Library) http://cellimages.ascb.org/ Molecular Expressions: Images from the Microscope http://micro.magnet.fsu.edu/index.html Nikon MicroscopyU http://www.microscopyu.com/ Olympus Microscopy Resource Center http://www.olympusmicro.com/ Harvard University (Department of History of Science) http://dssmhi1.fas.harvard.edu/emuseumdev/code/eMuseum.asp?lang=EN
4.7 FRACIONAMENTO CELULAR 19 Biologia e Fisiologia Celular Uma das formas de ampliarmos os nossos conhecimentos sobre o funcionamento das organelas e demais estruturas celulares é através do isolamento dos constituintes celulares em frações puras. Para isto, precisamos romper delicadamente a membrana plasmática preservando as demais organelas e constituintes citoplasmáticos em processo de lise celular controlado que gere um homogenato celular íntegro. Existem diversos métodos para promover a lise celular e a obtenção de um homogenato. Estes métodos podem ser divididos em químicos e físicos. Entre os métodos químicos podemos citar o uso de detergentes ou de soluções hipertônicas (choque osmótico). O rompimento da membrana plasmática por métodos físicos inclui o uso de homogenizadores (rompimento por esmagamento) ou sonicadores, entre outros. A escolha do método adequado depende, fundamentalmente, do tipo celular e do tecido de origem. Após a obtenção do homogenato celular, os constituintes podem ser separados por centrifugação diferencial. Dois métodos de fracionamento são muito utilizados: a centrifugação diferencial ou a separação por gradiente de concentração. Na centrifugação diferencial o homogenato é submetido a diversas centrifugações sucessivas, com ordem crescente de velocidade de centrifugação. Na medida em que aumentamos a velocidade de centrifugação, promovemos a sedimentação e precipitação dos componentes menos densos (tabela 1.2). Após o isolamento do componente de interesse podemos estudar determinado processo biológico sem a interferência dos demais constituintes celulares. Essa compartimentalização do estudo é importante para identificarmos, por exemplo, qual organela é responsável por determinado processo. Foi a partir da conquista da técnica de centrifugação diferencial que os bioquímicos americanos Eugene Patrick Kennedy e Albert Lester Lehninger, no final da década de 1940, verificaram que o ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs), a oxidação de ácidos graxos, e a fosforilação oxidativa ocorriam na mitocôndria. Velocidade de Centrifugação Precipitado Baixa 1.000 x G – 10 minutos Células inteiras, núcleo e citoesqueleto Média 20.000 x G – 20 minutos Mitocôndrias, lisossomos e peroxissomos Alta 80.000 x G – 60 minutos Microssomos e pequenas vesículas Super alta 150.000 x G – 180 minutos Ribossomos e macromoléculas maiores Tabela 1.2 – Fracionamento celular por centrifugação diferencial e o conteúdo do precipitado. G = gravidade. :: ARREGAÇANDO AS MANGAS!! :: Faça uma pesquisa e descubra o que são microssomos!
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