NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI - inova

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Reagentes • Lâminas de substrato HEp-2 (célula epitelial humana); 12 poços/lâmina, com dessecante • Conjugado IgG Anti-humano (Cabra), fluoresceína marcada em solução tampão contendo DAPI e ,09% de azida de sódio • Controlo Padrão de Título Final ANA, 1 frasco com solução tampão contendo 0,09% de azida de sódio e anticorpos de HEp-2 de soro humano pré-diluídos. • Controlo Negativo Sistema IFA, 1 frasco com solução tampão contendo 0,09% de azida de sódio e em anticorpos de HEp-2 de soro humano pré-diluídos. • Concentrado PBS II (40x), suficiente para 2000 mL • Meio de Montagem, 0,09% de azida de sódio • Lamelas Advertências 1. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos do kit para este produto foi testado e deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos de HIV, HBsAg e HCV. Contudo, nenhum método de teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou outros agentes infeciosos. Portanto, o Controlo Padrão de Título Final ANA e o Controlo Negativo do Sistema IFA devem ser manipulados da mesma forma que qualquer material potencialmente infecioso. 6 2. A Azida de Sódio é utilizada como conservante em alguns componentes do kit. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a formação destas substâncias. 3. Usar equipamento de proteção individual apropriado para trabalhar com os reagentes. 4. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos. Precauções 1. Este produto destina-se à Utilização para Diagnóstico In Vitro . 2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode originar resultados inconsistentes. 3. A lavagem incompleta ou ineficiente dos poços IFA pode causar elevada interferência de fundo. 4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis. 5. Uma grande variedade de fatores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Estes incluem a temperatura inicial dos reagentes, a resistência da lâmpada do microscópio usada, a precisão e a reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e a duração dos tempos de incubação durante o ensaio. Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e reprodutíveis. 6. Com o tempo, a cor do Conjugado IgG Anti-humano pode alterar-se devido à exposição à luz. No ntanto, a alteração da cor não afeta o desempenho do ensaio. 7. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado. Precauções particulares de conservação 1. Conservar todos os reagentes do kit a 2-8 °C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo. 2. A solução tampão PBS II diluída é estável durante 4 semanas a 2-8 °C. Colheita da amostra • Este procedimento deve ser efetuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser utilizadas. Amostras de soro muito hemolizadas ou lipémicas devem ser evitadas. • Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A3 da CLSI (NCCLS) recomenda as seguintes condições de conservação para as amostras: 1) Não conservar as amostras à temperatura ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra a 2-8 ºC. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congelar a –20 ºC ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois de descongelarem e antes de serem testadas. 2
Procedimento Materiais fornecidos Item fornecido Lâminas de Substrato HEp-2 de 12 poços Conjugado IgG Anti-humano FITC com DAPI Quantidade 20 x 12 poços 1 x 15 mL Controlo Padrão de Título Final NA 1 x 0,5 mL Controlo Negativo de Sistema FA 1 x 0,5 mL Concentrado PBS II (40x) 2 x 25 mL Meio de Montagem 1 x 7 mL Lamelas 1 x 20 Materiais adicionais necessários mas não fornecidos Micropipetas de 15-1000μL de volume Água destilada ou desionizada Frascos de apertar ou pipetas Pasteur Câmara húmida Recipiente de 1L (para diluir o PBS II) Frasco Coplin Microscópio de fluorescência com excitador de 495nm e filtro de barreira de 515nm Método Antes de iniciar 1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e bem misturados. 2. Diluir o Concentrado PBS II: IMPORTANTE: Diluir o Concentrado PBS II 1:40, adicionando o conteúdo do frasco do Concentrado PBS II a 975 mL de água destilada ou desionizada e misturar cuidadosamente. Utiliza-se a solução tampão PBS II para diluir amostras do doente e como um tampão de lavagem. Pode conservar-se a solução tampão diluída durante 4 semanas a 2-8 °C. 3. Diluir as Amostras do Doente: a. Rastreio inicial: Diluir as amostras do doente a 1:40 com solução tampão PBS II diluído (ou seja, adicionar 50μL de soro a 1,95mL de solução tampão PBS II). b. Titulação: Fazer duas vezes diluições de série a partir da diluição de teste inicial para todas as amostras positivas com solução tampão PBS II (ou seja, 1:80, 1:160,... 1:2560). Procedimento de Ensaio 1. Preparar Lâminas de Substrato: Deixar que a lâmina de substrato atinja a temperatura ambiente antes de retirar da bolsa. Rotular com lápis e colocá-la numa câmara húmida adequada. Adicionar uma gota (20-25μL) do controlo positivo e do controlo negativo não diluídos aos poços 1 e 2 respetivamente. Adicionar uma gota (20-25μL) de amostra do doente diluída aos poços restantes. 2. Incubação da Lâmina: Incubar a lâmina durante 30 ± 5 minutos numa câmara húmida (um guardanapo de papel humedecido colocado estendido no fundo de um recipiente de plástico ou vidro fechado) manterá as condições de humidade adequadas. Não deixar que o substrato seque durante o procedimento de ensaio. 3. Lavagem das Lâminas: Após a incubação, utilizar um frasco de plástico de apertar ou pipetar para lavar suavemente o soro com solução tampão PBS II diluída. Orientar a lâmina e o fluxo de solução tampão PBS II de forma a minimizar a lavagem de amostras entre poços. Evitar dirigir o fluxo diretamente para os poços para evitar causar danos ao substrato. Se desejar, colocar as lâminas num frasco Coplin de solução tampão PBS II diluída até 5 minutos. 4. Adição de Conjugado Fluorescente: Agitar a solução tampão PBS II em excesso. Colocar novamente a lâmina na câmara húmida e cobrir imediatamente cada poço com uma gota de conjugado fluorescente. Incubar as lâminas durante mais 30 ± 5 minutos. 5. Lavagem das Lâminas: Repetir o Passo 3. 3
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