15. estudo histomorfometrico da reparação óssea em ratos após o ...

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
CAROLINE D’ FATIMA SANTOS DE SOUSA
ESTUDO HISTOMORFOMETRICO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS
APÓS O USO DE BIOMATERIAL DE ORIGEM SINTÉTICA
(HIDROXIAPATITA + β-TRICALCIOFOSFATO)
João Pessoa – PB
2010

S729e
Souza, Caroline D’Fátima Santos de.
Estudo histomorfometrico da reparação óssea em ratos após
o uso de biomaterial de origem sintética (hidroxiapatita
+ β-tricalciofosfato) / Caroline D’Fátima Santos de Souza. - -
João Pessoa: [s.n.], 2010.
76 f.: il. -
Orientador: Francisco de Assis Limeira Júnior.
Monografia (Graduação) – UFPB/CCS.
1. Osso - Regeneração. 2. Regeneração Óssea. 3. Materiais
Biocompatíveis.
4. Ratos.

CAROLINE D’ FATIMA SANTOS DE SOUSA
ESTUDO HISTOMORFOMETRICO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS
APÓS O USO DE BIOMATERIAL DE ORIGEM SINTÉTICA
(HIDROXIAPATITA + β-TRICALCIOFOSFATO)
Trabalho de Conclusão de
Curso apresentado ao Curso
de Graduação em Odontologia,
da Universidade Federal da
Paraíba em cumprimento às
exigências para conclusão.
Orientador: Prof. Dr. Francisco de Assis Limeira Júnior, Doutor
João Pessoa- PB
2010

DEDICATÓRIA
À Deus, por estar presente a todo o momento na minha vida, exercendo papel de Pai
cuidadoso e dedicado, executando Sua vontade boa, perfeita e agradável, me
capacitando já que com esforço próprio tenho consciência que não me caberia mais
esta conquista.
Aos meus pais que nunca pouparam esforços para meus estudos mesmo quando eu
sequer sabia o que era eles sempre cuidaram em me proporcionaram o que havia e
ainda há de melhor.
Ao meu irmão Kenio por inúmeras vezes, todas em que precisei, dedicar-se a função
meu pai, responsável mesmo durante seus inocentes tempos de criança e
adolescente, exercendo proteção, cuidado e amor por mim. Tenho essas cenas estão
marcadas em minha memória.
Dedico este trabalho.

AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Limeira Júnior , por ter me acompanhado desde o início
dessa trajetória, sempre muito paciente e comprometido com meu saber, me
guiando e me ensinando durante meus primeiros passos acadêmicos, facilitou
e muito esta caminhada que poderia ter sido mais difícil sem seu apoio,posso
ainda dizer que além de ciência me ensinou sobre ética, respeito e
solidariedade junto aos colegas e pacientes, sendo um exemplo forte de
integridade e sucesso para minha vida.
Ao Dr. Talvane Sobreira por ter me acolhido mesmo tão imatura e ter
depositado tanta confiança e respeito por mim. Agradeço ainda pelos
conselhos e cuidados sempre tão experientes e que tanto serviram para meu
amadurecimento.

AGRADECIMENTOS
Ao colega Álvaro, pessoa extremamente prestativa, sempre esteve
disposto a ajudar, com quem pude contar em todas as etapas desta pesquisa,
mesmo a distância nunca hesitou em me fornecer material para o desenvolver
deste trabalho.
Á Andréa Queiroga pelo compromisso que teve com este trabalho,
pessoa muito importante na fase experimental, abrindo mão de finais de
semana em meio a vários de seus compromissos para que este trabalho
obtivesse o êxito que pudemos constatar.
Aos colegas de curso Lariane Raulino, Suennya Dantas e Thiago
Quintans e Isa (Ciências Biológicas – UFPB) pela dedicação na fase
experimental, durante os procedimentos cirúrgicos e pós-operatórios, mesmo
em meio aos inconvenientes no trato junto aos animais sempre podíamos
observar compromisso durante o trabalho.
Aos fraternos amigos Breno Nobre, Claudion Saraiva e Cirilo Neto,
pelo exemplo de amizade verdadeira, as que eu conquistei durante esta dura
caminhada de graduação a qual sempre pude contar com o ombro amigo
destes nas fases boas e principalmente nas ruins, tendo conselhos e carinhos
que me fizeram crescer e a cada encontro me tornar uma pessoa melhor e
mesmo em meio às adversidades da vida, vocês foram amigos fiéis.
À amiga que tenho em meu coração um lugarzinho reservado Bellinha
(Isabela Ferreira), pelo cuidado comigo, por diversas vezes enxugar lágrimas
de descontentamento e me conduzir pelo caminho mais importante da vida de
qualquer pessoa, a vida de intimidade com Deus. Encontramos-nos da maneira
mais contraditória, temos perfis contraditórios, mas juntas nos completamos e
crescemos bastante durante esses dois anos, hoje a tenho como irmã.

À minha querida Conexão que tem literalmente me sustentado
emocionalmente e tem me feito aprender acerca de coisas que são impossíveis
aos olhos do homem, tem me feito crescer espiritualmente e tem me mostrado
o verdadeiro alimento, aquele que transformou minha vida. Posso ainda
acrescentar que em meio a situações de dificuldade e cansaço durante este
processo de TCC, este círculo de amizade me deu força que revigorou me
entusiasmo para que pudesse me dedicar da melhor forma e chegar a esta
conclusão.
Aos colegas de turma Rinardo Barbosa e Francisco Flávio por
significarem para mim exemplos de integridade, sempre com intuito de ajudar
os colegas e fazê-los crescer, desde já minha admiração.
Obrigada a todos!

“Apesar dos nossos defeitos, precisamos enxergar que somos
pérolas únicas no teatro da vida e entender que não existem pessoas
de sucesso e pessoas fracassadas. O que existem são pessoas que
lutam pelos seus sonhos ou desistem deles”.
Augusto Cury

RESUMO 1
Este trabalho teve como objetivo avaliar histomorfometricamente a reparação
óssea em defeitos criados na calota craniana de ratos Wistar, acima do limite
crítico, utilizando biomaterial sintético (hidroxiapatita + β- tricálcio-fosfato).
Foram utilizados 18 animais, distribuídos aleatoriamente em três grupos G1,
G2 e G3, com 6 animais cada. O estudo foi pareado, com defeito de 5mm
criado no osso parietal em cada lado da sutura sagital mediana do animal,
onde o lado esquerdo correspondeu ao experimento, subgrupo A, (preenchido
por biomaterial de origem sintética) e o lado direito ao controle, subgrupo B,
(preenchido por coágulo sanguíneo). Os espécimes foram enviados para
avaliação histológica, nos períodos de 15, 30 e 45 dias, que corresponderam
aos grupos G1, G2 e G3. Os resultados das imagens obtidas foram submetidos
ao teste Exato de Fisher para comparação entre os grupos e ao teste de Mann-
Whitney para comparação de grupos para subgrupos, avaliando a reparação
óssea (quantificação de matriz óssea neoformada). Foi utilizado o programa
SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 13.0 para Windows, sendo
a análise estatística com nível de significância de 5%. Os resultados
demonstraram que a matriz óssea neoformada foi maior nos defeitos ósseos
preenchidos pelo biomaterial (4,00 ± 0,89 µm²) do que no grupo controle (1,67
± 0,82 µm²), havendo diferença estatisticamente significante entre os
subgrupos. Conclui-se que o biomaterial utilizado contribuiu no processo de
reparação óssea.
Palavras-chave: Regeneração Óssea. Materiais Biocompatíveis. Ratos.
______________________
1 Este trabalho está de acordo com as normas de documentação da ASSOCIAÇÃO
BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS (ABNT), a saber: NBR 6022, Informação e
Documentação – Referências – Elaboração, ago. 2002. NBR 14724, Informação e
Documentação – Trabalhos acadêmicos – Apresentação, 2006.

ABSTRACT
This study was developed with the intention to evaluate histomorphometric
bone repairing in skull defects created in Wistar rats, above the critical limit
using synthetic biomaterials (hydroxyapatite ceramic + β-tricalcium phosphate).
Were used in the study 18 rats were randomly divided into three groups G1, G2
and G3, with 6 animals each. The study was paired with defect created in the
parietal bone on each side of the median sagittal suture of the animal, where
the left side corresponded to the experiment, Group A, (filled with biomaterial of
synthetic origin) and the right to control, subgroup B, ( filled by blood clot). The
specimens were sent for histological examination by conventional light
microscopy, at 15, 30 and 45 days, which corresponded to the G1, G2 and G3.
The results from these images were submitted to Fisher Exact test for
comparison between groups and the Mann-Whitney to compare groups for
subgroups, evaluating bone repair (quantification of newly formed bone matrix).
We used SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 13.0 for Windows, and
statistical analysis with significance level of 5%. From the results it was
concluded that although not statistically significant, the bone defects are
submitted to the biomaterial showed better bone healing in the control group.
Key-words: Bone Regeneration. Biocompatible Materials. Rats

LISTA DE FIGURAS
Figura 4.1 Rato Wistar, albino, macho, adulto, com massa corporal variando
entre 270e 370g______________________________________ 30
Figura 4.2 Acondicionamento dos animais na gaiola__________________ 31
Figura 4.3 Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica________ 33
Figura 4.4 Anti-sepsia e infiltração anestésica local____________________34
Figura 4.5 Incisão linear através da pele e periósteo___________________ 35
Figura 4.6 Exposição do osso parietal após descolamento e afastamento do
retalho______________________________________________35
Figura 4.7 Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro___________________36
Figura 4.8 Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0)______37
Figura 4.9 Sutura contínua simples da pele (mononylon 5-0)_____________37
Figura 4.10 Incisão trapezoidal de espessura total para obtenção dos
espécimes___________________________________________38
Figura 4.11 Espécime obtido após ressecção parcial da calota craniana____39
Figura 4.12 Imagem do defeito ósseo (com biomaterial) após 45 dias______41
Figura 4.13 Imagem extraída correspondente ao conteúdo do defeito ósseo
que será segmentada em sete classes____________________ 41
Figura 4.14 Classe utilizada para cálculo da área (μm2) da matriz óssea
neoformada_________________________________________42
Figura 5.1 Partículas do biomaterial (*). Bordas do defeito (>). G1-A (H.E.) _44
Figura 5.2Neoformação óssea incipiente(>)na borda do defeito. G1-A (H.E.)45
Figura 5.3 Pavimentação osteoblástica (>) envolta da trabécula óssea.
Presença de vasos sanguíneos congestos (*). G1-A (H.E.)______45
Figura 5.4 Sem evidência de neoformação óssea no interior da cavidade (*).
Bordas do defeito (>). G1-B (H.E.)_________________________46
Figura 5.5 Neoformação óssea incipiente a partir da borda do defeito (>). G1-B
(H.E.)_______________________________________________ 46
Figura 5.6 Trabécula óssea neoformada (*) e atividade osteoblástica (>). G1-B
(H.E.)________________________________________________47
Figura 5.7 Neoformação óssea a partir das bordas do defeito(>).G2-A (H.E) 47

Figura 5.8 Neoformação óssea (>) a partir da borda do defeito e das partículas
do biomaterial. G2-A (H.E.)_______________________________48
Figura 5.9 Trabécula óssea neoformada (*) entre as partículas do biomaterial.
G2-A (H.E)___________________________________________48
Figura 5.10 Neoformação óssea a partir da borda do defeito(*). G2-A (H.E.) 49
Figura 5.11 Ausência de neoformação óssea no interior da cavidade(*). Bordas
do defeito (>). G2-B (H.E) _____________________________49
Figura 5.12 Tecido conjuntivo no interior do defeito ósseo com presença de
vasos sanguíneos congestos (>). G2-B (H.E) 50
Figura 5.13 Osso neoformado a partir da borda do defeito(*).G2-B (H.E)___ 50
Figura 5.14 Neoformação óssea em toda extensão da cavidade(*). Bordas do
defeito (>). G3-A (H.E.)________________________________51
Figura 5.15 Tecido ósseo neoformado (*) a partir da borda do defeito (>),
estendendo-se para o interior do defeito. G3-A (H.E.)__________________51
Figura 5.16 Trabéculas ósseas no interior do defeito (*) nas adjacências das
partículas do biomaterial. G3-A (H.E.)_______________________________52
Figura 5.17 Tecido conjuntivo fibroso no interior da cavidade (*) e presença de
neoformação óssea incipiente (>) a partir das bordas do defeito. G3-B (H.E.) 52
Figura 5.18 Neoformação óssea incipiente a partir da borda do defeito (>).
G3-B (H.E.)__________________________________________53
Figura 5.19 Tecido conjuntivofibroso com vasos sanguíneos congestos (>).
G3-B (H.E.)__________________________________________53

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Infiltrado inflamatório .............................................................. 55
Tabela 2 – Vascularização....................................................................... 57
Tabela 3 – Reação de corpo estranho (RCE) ........................................ 58
Tabela 4 – Tecido conjuntivo fibroso ....................................................... 58
Tabela 5 – Atividade osteoblástica segundo o grupo e o subgrupo ..... 59
Tabela 6 – Neoformação óssea .............................................................. 60
Tabela 7 – Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação
óssea ..................................................................................... 61
Tabela 8 - Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação
óssea através da segmentação morfométrica ........................ 61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BMP - Proteína morfogenética óssea
Ca10(PO4)6(OH)2 - Hidroxiapatita
CCS - Centro de ciências da saúde
FOP - Faculdade de Odontologia de Pernambuco
G1 - Grupo de 15 dias
G2 - Grupo de 30dias
G3 - Grupo de 45 dias
A - Subgrupo experimental
B - Subgrupo controle
HA - Hidroxiapatita
HE - Hematoxilina / eosina
IGF - Fatores de crescimento semelhante à insulina
IL-1 - Interleucina-1
IL-2 - Interleucina-2
L*a*b* - Sistema de cores definidas pelo brilho (L*) e pelas coordenadas de
cromaticidade (a* e b*)
LEA - Laboratório de experimentação animal
LTF - Laboratório de tecnologia farmacêutica
n - Número
p - Nível de significância
RCE - Reação de corpo estranho
rpm - Rotações por minuto
SPSS - Statistical Package for the Social Sciences
TCF - Tecido conjuntivo fibroso
TCP- Tricálcio fosfato
TGF-β - Fator transformador de crescimento β
UFPB - Universidade Federal da Paraíba
UPE- Universidade de Pernambuco

LISTA DE SÍMBOLOS
% .................... Percentual
β ..................... Letra grega “beta”
µm .................. Micrômetro
® .................... Marca registrada
: ...................... Razão
+ ..................... Sinal de mais
< ..................... Menor que
> ..................... Maior que
= ..................... Igual a
± ..................... Sinal de mais ou menos
cm .................. Centímetro
g ..................... Grama
kg ................... Quilograma
mg .................. Miligrama
ml ................... Mililitro
mm ................. Milímetro
N-cm .............. Newton centímetro
ºC ................... Grau Celsius
rpm ................. Rotações por minuto

SUMÁRIO
1. Introdução...................................................................................................16
2. Revisão de literatura..................................................................................18
2.1. Tecido ósseo.............................................................................................19
2.2. Reparação óssea.......................................................................................20
2.3. Biomateriais osseosubstitutos...................................................................22
3. Objetivos.....................................................................................................29
3.1. Objetivo Geral...........................................................................................29
3.2. Objetivos Específicos................................................................................29
4. Materiais e Métodos...................................................................................30
4.1. Animais......................................................................................................30
4.2. Procedimento Cirúrgico.............................................................................33
4.3. Cuidados pós-operatórios.........................................................................39
4.4. Análise Histológica....................................................................................40
4.5. Análise Morfométrica.................................................................................41
4.6. Análise Estatística.....................................................................................42
4.7. Considerações Éticas................................................................................42
4.8. Fonte de Fomentos....................................................................................42
5. Resultados...................................................................................................43
5.1. Análise Histológica.....................................................................................43
5.2. Análise Morfométrica..................................................................................54
5.3. Análise Estatística......................................................................................54
6. Discussão ....................................................................................................62
7. Conclusão....................................................................................................66
Referências......................................................................................................67
Apêndice..........................................................................................................75
Anexo...............................................................................................................76

Introdução

1 Introdução
Atualmente a população se encontra mais exigente no que se refere à
estética e função nas reabilitações orais. Assim sendo, a odontologia lança
mão de produtos biocompatíveis para acelerar o processo de regeneração
óssea da maneira mais ágil e eficiente, devolvendo a satisfação estética e
mastigatória ao paciente.
Segundo Carneiro, et al. (2005) existem situações em que a capacidade
de reparo ósseo é limitada pelo tamanho da perda óssea como aquelas
causadas por trauma, patologias ou conseqüência de procedimentos cirúrgicos
diversos. Nestes casos, o defeito ósseo torna-se crítico a reparação
espontânea, onde se faz necessário o uso de enxertos para um correto
tratamento e bom prognóstico.
Devido à possibilidade de correção dos defeitos ósseos, cada vez mais
se têm pesquisado materiais que apresentem características biológicas
aceitáveis como indutores de reparação óssea. Um material ideal para ser
utilizado como substituto ósseo deve ser biocompatível, não antigênico, não
carcinogênico, apresentar baixo custo, ser gradualmente substituído por tecido
da área receptora e ter propriedades osteocondutora e/ou osteoindutora
(CAMARINE et al.,2006).
Apesar do enxerto autógeno ser o mais indicado, este agrega riscos ao
paciente, incluindo incisão cirúrgica adicional, aumento da morbidade pósoperatória,
debilitação do local doador e quantidade disponível insatisfatória de
enxerto, como nas crianças e adultos submetidos a procedimentos operatórios
anteriores (FIGUEIREDO, 2001; FINKEMEIER, 2002).
A busca de tratamentos menos invasivos, com rápida e efetiva
regeneração óssea, tem levado ao desenvolvimento de alternativas sintéticas e
biorreabsorvíveis para enxertos ósseos (DZIEDZIC; BERTOJA; ZIELAK,2009).
Diversos materiais aloplásticos têm sido utilizados para preencher cavidades
ósseas como tentativa de induzir sua reparação. Os fosfatos de cálcio são
biocompatíveis, não induzem qualquer tipo de reação adversa já que estão presentes no
tecido ósseo. A hidroxiapatita pode ser usada como enxerto ósseo em diferentes áreas da
medicina e na odontologia tem sido exaustivamente utilizada para correção de

deformidades ósseas como bolsas periodontais, regularização e manutenção de margens
ósseas em cirurgia e traumatologia bucomaxilofacial (BUCHAIM et al., 2002).
O método mais empregado de avaliação dos efeitos dos enxertos
ósseos sobre o reparo de perdas ósseas é o histológico (Z. CHRISTOPH et al.,
2007), seguido de análise por algum sistema computacional (RENDERS et. al,
2007).
À medida que, em uma imagem histológica, é possível observar áreas
ocupadas por tecido ósseo neoformado e áreas ocupadas por partículas de um
determinado tipo de enxerto ósseo, as quais podem estar entremeadas por
outros componentes como fibras colágenas, é de extrema valia um método
computacional que permita a segmentação da imagem em áreas específicas
para cada componente em especial (SARTORI et al., 2003).
Queiroga et al., (2008) analisaram morfométricamente reparos ósseos
utilizando o método de segmentação de imagens o que permitiu uma
comprovação imparcial dos resultados dando desta forma precisão ao estudo, uma vez
que há uma contagem efetiva dos vários elementos da imagem, sem necessidade de
delineação manual feita pelo pesquisador ou avaliador, e assim, minimizando os erros
inerentes à interferência pessoal.
O objetivo deste estudo foi analisar histomorfometricamente os tecidos formados
no processo de reparação de defeitos críticos confeccionados em calvária de ratos e
preenchidos com um biomaterial de origem sintética .

Revisão de
Literatura

2 Revisão de literatura
Continua sendo um desafio terapêutico na Odontologia a regeneração
de tecido ósseo em casos de traumas ou patologias, porque o rápido
crescimento de tecido conjuntivo impede ou dificulta a formação de tecido
ósseo novo entre os limites da lesão; e a alteração morfofuncional resultante do
processo regenerativo pode levar à necessidade de vários procedimentos
cirúrgicos para sua devida reablitação (FIGUEIREDO, 2001).
As perdas ósseas podem apresentar dois tipos de resultados:
cicatrização, que é o reparo da ferida por tecido diferente do originalmente
perdido no que diz respeito à morfologia e função; e regeneração, onde o
reparo é feito por um tecido idêntico ao tecido original preexistente
(CARVALHO; BASSIA; VIOLIN, 2004).
No tratamento cirúrgico pretende-se o preenchimento do defeito com um
material que possa promover osteoindução e/ou osteocondução e a
conseqüente osteogênese reparativa (NKENKE et al., 2002). Atualmente os
enxertos autógenos são tidos como padrão, devido a sua capacidade de
osteogenicidade, osteocondutividade, osteoindução e aspectos de segurança
dentro da janela imunológica do receptor (VON ARX et al., 2001; NKENKE et
al., 2002). Todavia os enxertos autógenos requerem cirurgia adicional,
implicando em morbidade causada à área doadora, apresentando, como
principal sintomatologia a dor, disponibilidade insuficiente de material quando
obtido intraoralmente, quando de origem medular, são altamente reabsorvíveis
e degradam antes que a cicatrização óssea seja concluída, além do aumento
da complexidade, dos custos e da necessidade de anestesia geral quando o
enxerto for obtido extraoralmente (KHAN et al., 2005; FELLAH et al., 2008;
WALSH et al., 2008).
Segundo o estudo de Dalapicula; Conz, (2008) com a finalidade de
superar tais limitações e também devido aos grandes desenvolvimentos
científico e tecnológico, é cada vez mais crescente a utilização de biomateriais
de origem sintética que possibilitam, em muitos casos, a diminuição ou a
eliminação do uso de materiais de origem biológica.

2.1 Tecido ósseo
O osso é um tecido conjuntivo que tem em sua matriz óssea,
constituintes orgânicos e inorgânicos. A parte inorgânica do osso que constitui
cerca de 65% de seu peso, é composta principalmente por cálcio e fósforo
juntamente com outros componentes, incluindo bicarbonato, citrato, magnésio,
sódio e potássio. O cálcio e o fósforo existem basicamente sob a forma de
cristais de hidroxiapatita [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ], mas o fosfato de cálcio também
está presente sob a forma amorfa. O componente orgânico da matriz óssea,
que constitui aproximadamente 35% do peso do osso, inclui fibras que são
quase exclusivamente colágeno do tipo I. O osso é uma das substâncias mais
duras e resistentes do corpo. Sua dureza e força são causadas pela
associação dos cristais de hidroxiapatita com o colágeno (GARTNER; HIATT,
2003)
A superfície interna e externa dos ossos são recobertas por células
osteogênicas e tecido conjuntivo, que constituem o endósteo e o periósteo,
respectivamente. Estes tecidos têm a função de nutrir o tecido ósseo e fornecer
osteoblastos para o crescimento e reparação do osso (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004). De acordo com esses mesmos autores as células do osso
são as células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos e osteoclastos.
As células osteoprogenitoras localizam-se na camada celular interna do
periósteo, revestindo os canais de Havers e no endósteo. Estas células são
mais ativas durante o período de crescimento ósseo intenso. Os osteoblastos,
provenientes das células osteoprogenitoras, são células cubóides organizadas
em camada contínua sobre o osteóide, são responsáveis pela osteogênese, ou
seja, pela síntese e secreção da matriz orgânica, maturação e mineralização.
Quando estas células ficam envoltas pela matriz, elas se tornam quiescentes e
são denominadas osteócitos (GARTNER; HIATT, 2003; JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004).
Os osteoclastos, derivados de células precursoras de monócitos,
funcionam para reabsorver osso necrótico e osso que necessita ser
remodelado (MARZOLA, 2000; PTERSON et al., 2005).

2.2 Reparação óssea
A reparação do tecido ósseo consiste em uma modificação do tecido
quanto a sua composição, tamanho e forma (COSTA et al., 2008).
Os eventos que ocorrem durante a cicatrização normal de feridas e
tecidos moles (inflamação, fibroplastia e remodelação) também ocorrem
durante a reparação de um osso lesado. Mas, em contraste com os tecidos
moles, osteoblastos e osteoclastos também estão envolvidos para reconstituir e
remodelar o tecido ósseo lesado. Os osteoblastos depositam então, o osteóide
que, se mantido completamente imóvel durante o processo de cicatrização,
chega à calcificação (PETERSON et al., 2005).
De acordo com estes mesmos autores os termos primeira e segunda
intenção são apropriados para a descrição do reparo ósseo. Se um osso for
fraturado e suas extremidades livres estiverem separadas por mais de 1mm, o
osso cicatriza por segunda intenção; isto é, durante a fase fibroblástica da
cicatrização uma grande quantidade de colágeno deve ser depositada para
preencher o espaço ósseo . A cicatrização por primeira intenção ocorre quando
o osso é incompletamente fraturado, de forma que as extremidades da fratura
não se tenham separado completamente uma da outra ou quando o cirurgião
consiga reaproximar e estabilizar rigidamente as extremidades fraturadas do
osso.
O mecanismo biológico de reparo ósseo associado aos biomateriais ou
enxertos ósseos pode ser classificado como osteogênese, osteoindução,
osteocondução e osteopromoção (CALASANS-MAIA; FERNANDES;
GRANJEIRO, 2008).
A osteogênese é o processo pelo qual células ósseas vivas são
enxertadas em um leito receptor e permanecem com a capacidade de
formação de novo tecido ósseo (CARVALHO; BASSI; PEREIRA, 2004).
O processo de osteoindução envolve a formação de novo osso na área
em crescimento a partir das células osteoprogenitoras do leito receptor,
derivadas das células mesenquimais indiferenciadas, que se diferenciam sob a
influência de um ou mais agentes indutores (BUSENLECHNER et al., 2008).
A osteocondução se refere ao crescimento ósseo sobre a superfície do
biomaterial acomodando-o (ALBREKTSSON; JOHANSSON, 2001;

CALASANS-MAIA et al., 2008; SILVA et al., 2009). Outros autores definem
como o processo em que o enxerto serve como arcabouço, de forma passiva,
para migração de vasos sangüíneos e deposição de novo osso
(BUSENLECHNER et al., 2008; TAGA et al.,2008).
A osteopromoção utiliza barreiras mecânicas de proteção, que evitam o
crescimento de tecido conjuntivo em meio ao defeito ósseo, permitindo que o
mesmo seja povoado por células (CALASANS-MAIA et al., 2008).
Após a implantação de um biomaterial, ocorre a formação de um
hematoma com uma resposta do tipo inflamatória com aderência e
revestimento de glicoproteínas ao material. Por processo de quimiotaxia,
numerosas células são recrutadas para o local: neutrófilos, eosinófilos,
monócitos e macrófagos (reação de corpo estranho). Estas últimas exercem
atividade fagocitária e estimulam a ação dos linfócitos, fibroblastos,
osteoclastos e células polimorfonucleares. Em seguida, inicia-se a
angiogênese, com a migração e proliferação de células endoteliais. Estas irão
formar uma rede de capilares que constituirá o suporte vascular.
Posteriormente, a ação de 34 citocinas (IL-1 e IL-2) e de diversos fatores de
crescimento (TGF-β, PDGF, IGF, BMPs) vão promover a diferenciação das
células mesenquimais pluripotentes com a formação de matriz óssea e de osso
imaturo. Por fim, a maturação e a remodelação encerram este processo
(GUTIERRES et al., 2006).
O processo de incorporação do osso cortical difere do esponjoso devido
à lenta revascularização do primeiro, o que diminui a possibilidade de
anastomoses terminoterminais, levando o dobro do período de tempo para este
processo. O retardo é proveniente da estrutura arquitetônica do osso cortical,
uma vez que a atividade osteoclástica precede a revascularização. Desta
forma, os osteoclastos promovem o aumento da porosidade, podendo chegar a
50%, fazendo o material perder a resistência mecânica. Outra diferença é a
tendência do osso cortical em permanecer com uma parte viável e outra
necrótica, enquanto o esponjoso tende a ser completamente substituído com o
tempo (PINTO; MIYAGUSKO; PEREIRA; 2003).

2.3 Biomateriais osseosubstitutos
Os diferentes tipos de materiais para enxertia óssea disponíveis na
atualidade são: autógenos (provenientes do próprio individuo), alógenos
(provenientes de indivíduos da mesma espécie), xenógenos (provenientes de
indivíduos de espécies diferentes) e aloplásticos (materiais sintéticos ou
naturais).
Devido a problemas relacionados com a obtenção de quantidade ideal
de osso e com a morbidade do sítio doador, no caso dos enxertos autógenos, e
com a antigenicidade, em relação aos homógenos e heterógenos, uma grande
variedade de materiais para preenchimento, denominados de aloplásticos, vem
sendo desenvolvidos. Os materiais sintéticos utilizados na regeneração óssea
incluem as cerâmicas de fosfato de cálcio sintéticas (HA – hidroxiapatita e
TCP- fosfato tricálcio)1,7, carbonato de cálcio, polímeros para substituição de
tecidos duros (HTR) e biovidros cerâmicos. Mesmo em busca das propriedades
adequadas, esta classe tem revolucionado os campos das pesquisas e
tratamentos, pois além de evitar uma segunda etapa cirúrgica, tem a opção de
forma (pó, partículas, pastilhas ou blocos), tamanho, textura, grau de
porosidade (macro ou microporoso), grau de cristalinidade (cristalino ou
amorfo) e solubilidade (absorvíveis ou não absorvíveis) (GRANJEIRO et al.;
2004; BLANCH, 2004; CALASANS-MAIA et al., 2008).
Enxertos xenogênicos, como o osso bovino inorgânico (LIMEIRA
JUNIOR, 2001; BUCHAIM et al., 2002), e aloplásticos, como a hidroxiapatita
sintética (LIMEIRA JUNIOR, 2004; CONZ ; GRANJEIRO; SOARES, 2005), são
materiais osteosubstitutos que demonstraram ser capazes de favorecer a
reparação óssea em função de sua alta propriedade osteocondutora. Assim, o
uso destes materiais tem sido indicado em alguns casos de reparo periodontal
(ARTZI; NEMCOVSKY; TAL H, 2001), levantamento de seio maxilar (SARTORI
et al., 2003; TADJOEDIN et al., 2003) e preenchimento de alvéolos( ARTZI;
TAL H; DAYAN, 2000; ARTZI; TAL H; DAYAN, 2001).
Os derivados inorgânicos sintéticos como a hidroxiapatita e fosfato
tricálcio têm recebido grande atenção como materiais de preenchimento,
espaçadores e substitutos para os enxertos ósseos, principalmente devido à

sua biocompatibilidade, bioatividade e características de osteocondução em
relação ao tecido hospedeiro (SICCA et al., 2000; MOREIRA et al., 2003;
SANADA et al., 2003).
Sicca et al. (2000) desenvolveram um estudo com 60 ratos Wistar,
machos, adultos, com peso meio de 160g, divididos em 4 grupos, sacrificados
com 10, 20, 30 e 60 dias, após a implantação de materiais, na região dorsal
dos animais. Os grupos estudados foram controle, osso cortical microgranular
com 250 a 1.000µm e osso cortical macrogranular com 1.000 a 2.000µm,
acondicionados em cápsulas de colágeno. após avaliados as amostras,
concluiu-se que as partículas microgranulares induziam uma resposta
inflamatória ligeiramente maior, nos primeiros 10 dias, e que, após 60 dias,
foram similares quando comparados ao outro grupo experimental. Desta forma,
os achados observados com o osso cortical bovino desproteinado a 100ºC
foram semelhantes aos encontrados e outros estudos sobre a implantação de
osso autógeno ou alógeno desmineralizado, sugerindo que o osso
desproteinado pode ser utilizado como material de sustituição óssea e como
potencial carreador para as proteínas morfogenéticas do osso.
Orr et al. (2001) avaliaram propriedades mecânicas compressivas de
defeitos ósseos de 3,5 mm de diâmetro por 8,0 mm de profundidade
confeccionados na porção distal do fêmur de coelhos. Foram utilizados os
biomateriais derivados de osso bovino inorgânico (Bio-Oss®) e de
hidroxiapatita sintética (Calcitek®) comparados com o grupo controle (sem
preenchimento do defeito) e com o grupo anatômico (sem o defeito). Os grupos
foram avaliados nos seguintes períodos: osso bovino inorgânico (2, 6 e 26
semanas), hidroxiapatita sintética (6 e 26 semanas), grupo controle (2, 6 e 26
semanas) e o grupo anatômico (2 semanas). Os resultados mostraram não
haver diferença das forças compressivas no período de 2 semanas entre o
grupo que utilizou o osso bovino inorgânico e o grupo anatômico. Nos períodos
de 2, 6 e 26 semanas, o grupo do osso bovino inorgânico apresentou força
compressiva maior que o grupo controle. O grupo da hidroxiapatita sintética
teve força compressiva bem maior que o grupo controle e o grupo do osso
bovino inorgânico nos tempos de 6 e 26 semanas, apresentando diferença
estatística significante. Quanto ao módulo de elasticidade, o grupo do osso
bovino inorgânico apresentou valores bem próximos do grupo controle,

portanto sem diferença estatística, enquanto o grupo da hidroxiapatita sintética
obteve valores significativamente maiores que os citados grupos.
Laureano Filho (2001) realizou um estudo tendo como objetivo
comparar, histologica e histomorfometricamente, a reparação de defeitos
ósseos, de 10mm de diâmetro de espessura, na calvária de coelhos Nova
Zelândia, frente à implantação de matriz óssea humana desmineralizada e de
polímero de mamona. Foram utilizados 24 coelhos, com idade variando de 3 a
6 meses, com peso aproximado de 2,9 kg, que foram sacrificados nos períodos
de 4, 7 e 15 semanas após cirurgia. Concluiu-se que o osso desmineralizado
de origem humana foi reabsorvido mais rapidamente que o polímero de
mamona, constatando-se que tanto o grupo controle quanto o experimental
apresentaram um aumento da neoformação óssea ao longo o tempo.na
histomorfometria, os grupos experimentais apresentaram neoformação óssea
estatisticamente maior que o grupo controle e não houve diferença significante
quanto a neoformação óssea nos grupos experimentais.
Em um estudo foram colhidos 20 enxertos da área retromolar de 20
pacientes ambulatoriais para aumento da disponibilidade ósses da área
receptora de um único implante, e foram avaliadas as complicações típicas do
procedimento de uma forma prospectiva. O procedimento cirúrgico padrão para
coleta do enxerto incluiu uma incisão retromolar com extensão até o ramo,
sendo o enxerto colhido com uma broca trefina. Os autores concluíram que os
enxertos ósseos retromolares são um método viável para o aumento do volume
ósseo do leito receptor de implante para um único dente com baixos danos ao
paciente, com uma redução insignificante na abertura bucal e com um risco
mínimo de complicações, tais como lesões diretas e perdas de sensibilidade
nos nervos lingual e alveolar inferior (NKENKE et al., 2002).
Boëck-Neto et al. (2002) pesquisaram o aumento do volume ósseo
através da associação do osso autógeno, proveniente da região de sínfise
mandibular com a HA (Osteogen®) ou DFDBA ( Banco de tecidos da Costa do
Pacífico, Los Angeles). O objetivo foi avaliar histológica e
histomorfometricamente o osso formado após cirurgia de elevação do seio
maxilar pela utilização da combinação de enxertos. Dez biópsias foram
realizadas em 10 pacientes, divididos em dois grupos. Dez meses depois foram
observados bons resultados no processo regenerativo em ambos os grupos,

com infiltrado inflamatório insignificante e resquícios, não reabsorvidos, dos
materiais enxertados. Os resultados indicam que tanto o DFDBA como a HA,
associados ao osso autógeno, são biocompatíveis e promevem a
osteocondução.
Perri de Carvalho et al.(2004) avaliaram a manutenção de volume do
processo alveolar após exodontia por meio de implantes imediatos ou
regeneração óssea guiada, associada ou não ao uso de biomateriais. Os
autores apresentam um caso clínico de reabilitação com implante
osseointegrado em área de exodontia por motivo periodontal, seguida da
tentativa de manutenção de volume do processo alveolar com regeneração
óssea guiada e raspa de osso cortical autógeno. Os resultados obtidos neste
caso, com raspa de osso autógeno, foram bastante satisfatórios na
manutenção de volume e na qualidade óssea obtida. A qualidade óssea pôde
ser observada clinicamente (durante fresagem e travamento inicial do implante)
e histologicamente (por meio de biópsia). A utilização de osso autógeno
raspado no preenchimento de defeitos ósseos, associado ao uso de
membranas, é uma alternativa nos casos de tentativa de manutenção de
volume ósseo, após exodontias visando a colocação de implantes
osseintegrados.
Miranda et al. (2005) realizaram um estudo experimental comparativo
de enxerto ósseo orgânico (osso autógeno – crista ilíaca) e material inorgânico
(Osteosynt® - hidroxiapatia + tricálcio-fosfato) em fraturas de rádio em coelhos.
Foram utilizados 20 animais, divididos em 2 grupos, que se submeteram a
remoção de um segmento osteoperiosteal em todo seu diâmetro com 1 cm de
comprimento. No grupo 1, colocaram-se fragmentos de enxerto orgânico e no
grupo 2, fragmentos do material inorgânico. Os animais foram sacrificados com
15, 30, 45, 60 e 75 dias. Na avaliação radiográfica, foi possível observar a
completa reparação óssea em todos os grupos, sendo de forma mais rápida
com menor tempo de evolução no grupo 2 que utilizou o osso inorgânico. Esse
fato foi confirmado pela análise histológica. Como conclusão, os autores
afirmam que o material ósseo inorgânico pode ser usado de rotina em cirurgia
ortopédica, proporcionando uma cicatrização óssea precoce.
Horch et al. (2006) estudaram o efeito a longo prazo da cerâmica de
beta-tricálcio fosfato (β-TCP - Cerasorb®) em diferentes sítios da reconstrução

alveolar. Cento e cinqüenta e dois (152) pacientes foram avaliados, onde a
maioria das indicações para o β-TCP foi para o preenchimento de cistos
mandibulares (n=52), seguido de fissura alveolar (n=38), defeitos periodontais
(n=24) e aumento de assoalho do seio maxilar (n=16). Nos defeitos maiores
que 2,0cm de diâmetros, o β-TCP foi combinado com enxerto autógeno
esponjoso, na proporção de 1:1, proveniente da região retro-molar, da
tuberosidade ou do mento mandibular. Avaliação clínica, radiológica e por
ultrasonografia (na verificação da presença de micropartículas do material nos
nódulos linfáticos regionais) foi realizada com 4, 12 e 52 semanas no pósoperatório.
Em 16 casos, foram realizadas biópsias que demonstraram
completa regeneração óssea. Este fato foi possível devido à necessidade de
um segundo procedimento cirúrgico para remoção de material de fixação
(placas e parafusos) e/ou para inserção de implantes dentários. Distúrbios na
cicatrização foram observados em 9,2% dos pacientes, perda parcial do
material em 5,9%, enquanto a perda total em 2%. Devido à sua versatilidade,
baixa taxa de complicações e bons resultados ao longo prazo, o β-TCP
sintético apresentou-se como adequado material para o preenchimento de
defeitos ósseos em região alveolar.
Xié et al. (2007) avaliaram a eficiência e a segurança do material
derivado do osso humano no reparo de defeitos ósseos confeccionados no
osso radio de 15 macacos rhesus. As amostras de fêmur de humano
congelado ( Banco de Osso da província de Sichuan) foram processadas e a
finalização se deu através do recebimento de células mesenquimais da medula
óssea alógena, sendo denominado tissue-engineered (TE). Depois de 1, 2, 3, 6
e 12 semanas o material foi colhido e submetido á analise histológica,
mostrando que os defeitos ósseos foram bem reparados em ambos, com e
sem adição de células mesenquimais, enquanto que os defeitos ósseos sem
tratamento permaneceram do mesmo tamanho após 12 semanas. As amostras
TE obtiveram uma neoformação óssea 3 vezes mais rápida que o enxerto sem
células mesenquimais. Não foi observado nenhum efeito tóxico e nenhuma
reação imune nos animais analisados. Desta maneira, sugere-se que os
enxertos TE e que as células mesenquimais de medula óssea alógena
funcionam como um método ideal para a repação dos defeitos ósseos.

Molly et al. (2008) avaliaram a cpacidade de guiar a regeneração óssea
de três materiais : o ácido polilático-poliglicólico (Fisiograft®, osso bovino (Bio-
Oss®), e uma cerâmica derivada de carbonato de cálcio (Biocoral®), onde
estes preencheram os alvéolos de 36 dentes de 8 indivíduos. Alvéolos também
foram deixados vazios como grupo controe e todos foram recobertos com uma
membrana colágena (Core-Tex®). Após 6 meses foram retiradas amostras dos
materiais, e analisadas histologicamente. Depois de 4 e 6 meses após a
colocação dos implantes foi feita uma medição eletrônica de sua
mobilidade(Medizintechnik Guiden®, Bensheim). O estudo mostrou uma
grande quantidade de Bio-Oss® e de Biocoral® remanescente após 6 meses,
sendo a reabsorção do Fisiograft® mais rápida. Todos os locais, inclusive o do
grupo controle, revelaram adequada rigidez do implante, portanto conclui-se
que a abreviação do período de osteointegração do implante não
foiinfluenciada pelo uso de biomateriais, mostrando semelhantes resultados
entre os grupos que receberam enxerto e os que permaneceram vazios.
Quatorze cirurgias foram realizadas em 14 pacientes, que foram
divididos aleatoriamente em dois grupos: Grupo A (estudo) e Grupo B
(controle). No Grupo Controle usou-se somente enxerto de osso autógeno. O
grupo de estudo recebeu uma mistura de osso autógeno com tetraciclina. Um
total de sete biópsias foi feita no tempo da instalação dos implantes, seis a 12
meses após o levantamento do assoalho do seio maxilar. Nos exames
histológicos dos enxertos ósseos mesclados com tetraciclina, osso trabecular
contendo osteócitos viáveis estava presente e era do tipo lamelar maduro,
mostrando uma aparência histológica madura. A partir das observações
histológicas, concluiu-se que a mistura de osso autógeno particulado com
tetraciclina é uma promissora alternativa para prevenir infecções pósoperatórias,
não prejudicando a qualidade e não diminuindo a quantidade
óssea (GONÇALVES et al., 2008)
Foram caracterizados seis biomateriais de enxerto ósseo, sendo cinco
de origem xenógena e um de origem alógena. A caracterização físico-química
englobou análise granulométrica, microscopia eletrônica de varredura (MEV),
difração de raios-X (DRX), determinação da área superficial específica e
cristalinidade das amostras. O resultado demonstrou que todas as amostras,
exceto uma, eram constituídas de hidroxiapatita com diferentes intensidades de

incorporação de carbonatos, com diferentes faixas granulométricas, área de
superfície variando de 0,18 m 2 /g a 81,4 m 2 /g e cristalinidade variando de baixa
a alta, demonstrando que apesar da semelhança de suas composições, os
biomateriais analisados apresentaram grande diferença de parâmetros físicoquímicos.
O comportamento dos diferentes biomateriais utilizados como
substitutos ósseos, quando inseridos no tecido ósseo, serão dependentes de
suas propriedades físicas e químicas e devem ser sempre analisadas e
levadas em consideração antes de sua aplicação. Dentre essas, destacaríamos
como mais importantes à composição química, a cristalinidade, bem como, a
área superficial. As amostras apresentaram uma grande variabilidade nos
resultados de suas características físico-químicas, apesar de serem
empregadas para o mesmo propósito, segundo seus fabricantes
(DALAPICULA; CONZ, 2008).
Os autores relatam um caso clinico no qual foi utilizado osso homólogo,
obtido de banco de tecidos, para reconstrução de um defeito ósseo, na região
anterior da maxila, que impossibilitava a reabilitação com implantes.
Demonstrou-se através de analises clínicas e histológicas que o uso do osso
homólogo, previamente a colocação de implantes, pode ser uma alternativa
promissora no aumento ósseo, uma vez que possui a vantagem de não
sacrificar uma segunda área para remoção do enxerto e pela viabilidade e a
praticidade dessa técnica cirúrgica. Concluiram que os diferentes tipos de
biomateriais vem mostrando bons resultados, principalmente quando
combinados ao osso humano seco congelado desmineralizado ou ao osso
autógeno, sendo bastante atrativa a utilização dos mesmos em virtude da
menor morbidade pós-operatória, em situações de defeitos ósseos críticos
necessita-se de um maior potencial osteogênico/osteoindutor do material de
enxertia, materiais não absorvíveis limitam a formação com tecido ósseo vital, e
os mecanismos biológicos pelos quais se da o processo de cicatrização óssea,
inclusive nas situações de enxertia, obedecem aos princípios fundamentais da
formação óssea (FIGUEIREDO, et al., 2008).

3 Objetivos
Objetivos

3.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito do biomaterial de origem sintética na reparação óssea de
defeitos de 5,0mm de diâmetro confeccionados na calota craniana de ratos
Wistar nos períodos de 15, 30 e 45 dias através de avaliação histológica e
morfométrica.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar comparativamente o processo de reparo de defeitos ósseos
padronizados como controle( preenchido com o próprio coágulo do
animal) e submetido ao biomaterial de origem sintética (cerâmica de
hidroxiapatita + β-tricálcio-fosfato) na calvária do mesmo rato.
Analisar histologicamente a reparação óssea do grupo controle e do
grupo enxertado.
Analisar morfometricamente a área de defeito ósseo após cada tempo
pós-cirúrgico pré determinado, 15,30,45 dias.

Materiais e Métodos

4. Materiais e Métodos
4.1 Animais
No presente trabalho, foram utilizados 18 ratos albinos (Rattus
norvegicus da família Muridae, da variedade Wistar), do gênero masculino,
adultos , com idade média de 6 meses e massa corporal variando entre 270 e
370g, advindos do Biotério do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da
Universidade Federal da Paraíba – LTF / UFPB (Figura 4.1). Estes foram
mantidos durante o período experimental acondicionados em gaiolas plásticas
atapetadas com maravalha de pinus, sendo 6 animais por gaiola sob ração
sólida peletizada (Labina®) com alto teor de proteína (20 a 27%) e água ad
libitum, no Laboratório de Experimentação Animal do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal da Paraíba – LEA / CCS / UFPB na
temperatura de 23ºC ± 2ºC, ciclo claro-escuro de 12 horas( Figura 5.12).
Figura 4.1 – Rato Wistar, albino, macho, adulto,
com massa corporal variando entre 270 e 370g.

Figura 4.2 Acondicionamento dos animais na gaiola
O tamanho da amostra foi baseado na literatura científica, na qual o
número de animais é compatível com a necessidade de resultados confiáveis,
do ponto de vista de significância estatística, como também às questões
bioéticas (LIMEIRA JÚNIOR et al., 2003; LIMEIRA JÚNIOR, 2004).
Foram excluídos e substituídos os animais que apresentassem lesão da
dura-máter, infecção, deiscência da sutura e exposição do enxerto, bem como
alguma patologia no transcorrer dos períodos de experimentação. Do ponto de
vista histológico, aqueles que apresentassem perda do material testado
durante o processamento da amostra e os com interposição de tecido mole
(tecido intracraniano) na área avaliada.
Os 18 ratos foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos com 6
animais para os períodos de 15, 30 e 45 dias. Em cada animal foram
confeccionados dois defeitos de 5,0mm de diâmetro no osso parietal em cada
lado da sutura sagital, de forma que o lado esquerdo correspondeu ao
experimento (preenchido pelo biomaterial) e o lado direito ao controle
(preenchido pelo coágulo sanguíneo).
Cada gaiola foi identificada, bem como cada animal, onde constaram:
nome do experimento, responsável pela pesquisa, grupo, massa corporal do
animal, data da cirurgia e do acrifício. A identificação foi realizada em
formulário específico e com lápis pincel na cauda do rato, onde cada animal
conteve marcações específicas, identificando seu grupo (Formulário 1).

PESQUISA: ESTUDO HISTOMORFOMETRICO DA
REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS APÓS O USO DE
BIOMATERIAL DE ORIGEM SINTÉTICA
(HIDROXIAPATITA + BETA-TRICALCIOFOSFATO).
RESPONSÁVEIS PELA PESQUISA:
Orientador – Francisco Limeira Júnior
Pesquisadora – Caroline d’ Fatima Santos de Sousa
GRUPO*:
Animais**
Data da
Cirurgia
Massa
corporal
Sacríficio
01
02
03
04
05
06
Formulário1- Identificação da gaiola
* Identificação dos grupos:
G1-01 círculo – 15 dias
G2- 02 círculos – 30 dias
G3-03 círculos – 45 dias
** Identificação dos animais:
01 – I 02 - II 03 - III 04 - IIII 05 - IIIII 06 - IIIIII

4.2 Procedimento Cirúrgico
Para a administração de drogas e procedimentos cirúrgicos, cada rato
foi pesado no dia anterior no intuito de minimizar o estresse no momento da
cirurgia. Para a anestesia geral destes animais, foi utilizado o Hidrato de cloral
10% (0,4ml/100g de peso) aplicado no músculo da coxa do animal.
Imediatamente após a anestesia, foi reallizada a tricotomia da região
mediana da calota craniana dos ratos e os animais foram imobilizados em uma
mesa cirúrgica específica.
Figura 4.3 - Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica

Descrição dos procedimentos cirúrgicos segundo Frota (2003, 2006):
Anti-sepsia da região da calota craniana, com Polivinilpirrolidona-iodo 1 a
10% na região a ser incisada. Em seguida, foram feitas aposição do campo
cirúrgico e infiltração anestésica local de 0,2ml de Xylocaína com Epinefrina 2 ,
na concentração de 1:200.000. Este procedimento foi adotado, com o intuito de
diminuir o sangramento no trans-operatório e promover um maior conforto no
pós-operatório imediato (Figura 4.4);
Figura 4.4 - Anti-sepsia e infiltração anestésica local
Incisão linear foi efetuada através da pele e periósteo, indo da região
fronto-nasal a protuberância occipital externa, com o uso de lâmina de bisturi 3
nº 15, montada em cabo de bisturi 4 Bard-Parker número 3 (Figura 4.5);
1 Povidine Degermante ® - Ceras Johnson
2 Xylocaína ® com Epinefrina 1:200.000 - AstraZeneca
3 Feather Safety Razor CO., LTD. Medical Division
4 Bard-Parker TM

Figura 4.5- Incisão linear através da pele e periósteo
Descolamento do periósteo com o destaca-periósteo 5
afastamento do retalho com descoladores delicados (Figura 4.6);
de Molt e
Figura 4.6 – Exposição do osso parietal após descolamento do retalho
5 Quinelato Schobell Industrial Ltda

Ostectomia por meio de broca trefina 6 5mm de diâmetro montada em
uma peça de mão reta para micro motor elétrico Dentec 7 - modelo 405N,
acionado a uma velocidade de 25.000rpm e com irrigação externa com
sorofisiológico 8 0,9% ;
A ostectomia criou um defeito ósseo circular de 5mm de diâmetro e de
espessura total (1mm), nos lados direito (localização mais caudal) e esquerdo
(loalização mais cefálica), na região parietal, tendo-se o cuidado de não
comprometer a dura-máter;
O preenchimento do defeito ósseo no lado esquerdo (experimento)com
enxerto sintético e do lado direito (controle) com coágulo sanguíneo (Figura
4.7);
hidroxiapatita + β-tricálcio-fosfato
Coágulo sanguíneo
.
Figura 4.7 – Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro.
6 Sistema de implantes PPMM
7 Dentec Indústria e Comércio Ltda
8 Soro Fisiológico ® - Darrow

Sutura interrompida simples para o periósteo e contínua simples para
pele com o fio poliamida 9 (mononylon 5-0), (Figuras 4.8-4.9);
Figura 4.8 – Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0)
Figura 4.9 – Sutura contínua simples da pele (mononylon 5-0)
A obtenção dos espécimes, após os períodos de 15, 30 e 45 dias
(CARDOSO, 2008):
Eutanásia dos animais através da dose letal do anestésico;
Incisão trapezoidal de espessura total abrangendo os tecidos moles da
região parietal da calota craniana(Figura 4.10);
9 Ethicon ® - Johnson & Johnson

Figura 4.10 – Incisão trapezoidal de espessura total para obtenção dos
espécimes
Ressecção parcial da calota craniana, efetuada com broca carbide 10
número 702, montadas em peça de mão reta e acionadas por micromotor
elétrico Dentec - modelo 405N, a uma velocidade de 25.000 rpm, com margem
de segurança(Figura 4.11), com o objetivo de não haver um superaquecimento
do espécime, com conseqüente necrose e alteração dos resultados.
10 Genius - Baumer S.A., Mogi Mirim/SP.

Figura 4.11 – Espécime obtido após ressecção parcial da calota craniana
4.8. BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS ORIGEM SINTÉTICA
O biomaterial substituto ósseo de origem sintética utilizado apresentava
a seguinte composição:
Gen-phos® 10
Material ósseo cerâmico bifásico, biocerâmica sintética, de alta pureza,
porosa e microgranular (0,5 – 0,75 mm).
Composição:
1. Hidroxiapatita porosa absorvível (60 - 70%)
2. β-tricálcio-fosfato (30 - 40%)
4.3 Cuidados pós-operatórios
Os animais foram mantidos a temperatura corpórea, com o intuito de o
ambiente permanecer aquecido no período pós-anestésico, evitando hipotermia
corporal. Foi efetuada a limpeza da ferida cirúrgica, para evitar canibalismo
entre os animais devido ao odor exalado pelo sangue presente na ferida
cirúrgica. A dieta foi mantida sem alterações.

4.4 Análise Histológica
O processamento histológico dos espécimes obtidosfoi realizado no
laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia de Pernambuco –
FOP / UPE, de acordo com as seguintes etapas:
- Fixação com formol neutro (paraformaldeído 4%);
- Descalcificação com ácido nítrico a 0,5% por 15 dias;
- Lavagem em água corrente por 24h;
- Desidratação em cadeia crescente de álcool (70 a 100%);
- Diafanização em banhos de xilol ;
- Inclusão em parafina;
- Secção em cortes semi-seriados de 3 m;
- Coloração de rotina com Hematoxilina e Eosina (H.E.).
Foi realizada análise histológica no Laboratório de Patologia Geral do
Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba - CCS /
UFPB. Como parâmetros histológicos foram observados: infiltrado inflamatório,
vascularização, reação de corpo estranho (RCE), tecido conjuntivo fibroso
(TCF), atividade osteoblástica e neoformação óssea. Para a avaliação dos
resultados histológicos nos diferentes parâmetros, utilizou-se :
1) Qualificação dos dados morfológicos
Presente (1) e ausente (0)
2) Inflamação e vascularização
Leve (1), moderado (2) e intenso (3)
3) Atividade osteoblástica
Presente (1), fortemente presente (2)
4) Neoformação Óssea
Leve (1), leve-moderada (2), moderada (3), moderada-intensa (4), intensa
(5) e completa (6)
5) Reação de corpo estranho
Presente (1), Ausente (0)
6) Tecido conjuntivo fibroso
Presente (1), Ausente (0)

4.5 Análise Morfométrica
Realizada no departamento de informática da Universidade Federal da
Paraíba (UFPB), independente do observador, quantificando a área (μm 2 ) de
matriz óssea neoformada, através do método de segmentação de imagens
(QUEIROGA et al., 2008) (Figuras 4.10, 4.11 e 4.12).
Passos da Segmentação de Imagens:
1. Transformação da imagem do sistema RGB para o sistema L*a*b*
2. Segmentação utilizando o algoritmo k-médias com 7 clusters (classes) a
partir das bandas “a” e “b” do sistema L*a*b*.
3. Nova segmentação usando o k-médias com 3 clusters a partir da classe da
segmentação anterior que apresentou a região de neoformação óssea.
4. Binariazação da imagem pelo método de Otsu.
5. Contagem de pixels com valor “1” (brancos) da imagem binária para
mensurar a área (em pixels).
6. Cálculo da área (em μm²) a partir de dados obtidos usando uma escala como
referência.
Figura 4.12 – Imagem do defeito ósseo (com biomaterial) após 45 dias.
Figura 4.13 – Imagem extraída correspondente ao conteúdo do defeito ósseo
que será segmentada em sete classes.

Figura 4.14 – Classe utilizada para cálculo da área (μm2) da matriz óssea
neoformada.
4.6 Análise Estatística
Como forma de análise descritiva, foram obtidas as distribuições
absolutas, percentuais uni e bivariadas e medidas estatísticas (média,
mediana, desvio padrão e coeficiente de variância). Diante dos dados obtidos,
poderam ainda ser utilizados os seguintes testes: Qui-quadrado (será utilizado
o exato de Fisher quando as condições para utilização do X2 não forem ideais).
O nível de significância ou margem de erro na aplicação dos testes será de
5.0%. Os dados serão digitados na planilha Excel e processados no programa
estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences).
4.7 Considerações Éticas
O estudo foi desenvolvido segundo as normativas contidas no Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal e após aprovação pelo Comitê de Ética
em Pesquisa Animal do Laboratório Animal da Universidade Federal da
Paraíba – CCS / UFPB.
4.8 Fonte de Fomentos
Os itens previstos no orçamento para realização desta pesquisa foram
financiados pelo próprio pesquisador.

5 Resultados
Resultados

As análises foram feitas de acordo com o grupo(G1,G2,G3) ao qual os
animais pertenciam, destacando-se os subgrupos A ( experimento) e B
(controle) para facilitar a compreensão.
5.1 Análise Histológica
Em todos os espécimes estudados, independentemente do tempo de
observação e dos subgrupos, foram verificadas a presença de tecido conjuntivo
fibroso e a ausência de reação de corpo estranho. Os demais parâmetros
histológicos (inflamação, vascularização, atividade osteoblástica e
neoformação óssea) estiveram presentes, variando quanto à classificação.
G1-A
Houve inflamação predominantemente moderada, exceto dois casos
que foram leve. Quanto à vascularização dois casos foram moderado e os
demais intensos. A atividade osteoblástica em um espécime esteve presente;
os demais foram fortemente presente. A neoformação óssea em um caso foi
leve, leve-moderada em quatro e moderada em outro (Figuras 5.1, 5.2 e 5.3).
G1-B
Inflamação foi leve em dois casos e moderada em quatro. A
vascularização identificada foi leve em apenas um caso, moderada em três e
intensa nos outros dois. A atividade osteoblástica foi predominantemente
presente, excetuando um caso fortemente presente. A neoformação óssea foi
leve em cinco espécimes e apenas um foi leve-moderado (Figuras 5.4, 5.5 e
5.6).
G2-A
Em dois casos observou-se inflamação leve. Vascularização intensa em
cinco casos e apenas um leve. A atividade osteoblástica fortemente presente
nos seis animais. A neoformação óssea leve-moderada em quatro espécimes,
apresentando apenas dois casos do tipo moderado (Figuras 5.7, 5.8, 5.9 e
5.10).
G2-B
Inflamação foi leve em cinco espécimes, no outro moderado. A
vascularização leve em dois casos, moderada em três e intensa em um. A
atividade osteoblástica foi presente em quatro animais, apresentando-se

fortemente presente nos outros dois. A neoformação óssea foi
predominantemente leve com quatro casos e leve-moderada nos outros dois
(Figuras 5.11, 5.12 e 5.13).
G3-A
Nos seis animais, a inflamação identificada foi leve. A vascularização foi
leve em apenas um caso, moderada em dois e intensa nos outros três. A
atividade osteoblástica foi fortemente presente em todos os espécimes. A
neoformação óssea apresentou-se nas formas moderada, moderada-intensa e
intensa, cada uma com dois casos (Figuras 5.14, 5.15 e 5.16).
G3-B
A inflamação foi predominantemente leve, excetuando um caso
moderado. Dos seis animais, um apresentou vascularização leve e os demais
na forma intensa. A atividade osteoblástica foi presente e fortemente presente
com três casos cada uma (Figuras 5.17, 5.18 e 5.19).
Figura 5.1. – Partículas do biomaterial (*). Bordas do defeito (>). G1-A (H.E.)

Figura 5.2 – Neoformação óssea incipiente (>) na borda do
defeito.G1-A (H.E.)
Figura 5.3-Pavimentação osteoblástica (>) envolta da trabécula óssea.
Presença de vasos sanguíneos congestos (*).G1-A (H.E.)

Figura 5.4 -Sem evidência de neoformação óssea no interior da
cavidade (*). Bordas do defeito (>). G1-B (H.E.)
Figura 5.5 -Neoformação óssea incipiente a partir da borda do
defeito (>). G1-B (H.E.)

Figura 5.6 -Trabécula óssea neoformada (*) e atividade
osteoblástica(>). G1-B(H.E.)
Figura 5.7 -Neoformação óssea a partir das bordas do defeito (>). G2-A (H.E).

Figura 5.8 -Neoformação óssea (>) a partir da borda do defeito
e das partículas do biomaterial. G2-A (H.E.).
Figura 5.9 -Trabécula óssea neoformada (*) entre as partículas
do biomaterial.G2-A (H.E).

Figura 5.10- Neoformação óssea a partir da borda do defeito (*). G2-A (H.E.).
Figura 5.11 – Ausência de neoformação óssea no interior dacavidade(*).Bordas
do defeito (>). G2-B (H.E).

Figura 5.12 –Tecido conjuntivo no interior do defeito ósseo com presença de
vasos sanguíneos congestos (>). G2-B (H.E).
Figura 5.13– Osso neoformado a partir da borda do defeito (*).
G2-B (H.E).

Figura 5.14 – Neoformação óssea em toda extensão da cavidade
(*). Bordas do defeito (>). G3-A ( H.E.).
Figura 5.15 – Tecido ósseo neoformado (*) a partir da borda do defeito (>),
estendendo-se para o interior do defeito. G3-A (H.E.).

Figura 5.16 –Trabéculas ósseas no interior do defeito (*)
nas adjacências das partículas do biomaterial. G3-A (H.E.).
Figura 5.17 –Tecido conjuntivo fibroso no interior da cavidade (*) e presença
de neoformação óssea incipiente (>) a partir das bordas do defeito. G3-B
(H.E.).

Figura 5.18 –Neoformação óssea incipiente a partir da borda
do defeito (>).G3-B (H.E.).
Figura 5.19 – Tecido conjuntivofibroso com vasos sanguíneos congestos (>).
G3-B (H.E.).

5.2 Análise Morfométrica
O método de segmentação de imagens em sete classes foi utilizado
para análise morfométrica da matriz neoformada nos períodos de 15, 30 e 45
dias. Não houve segmentação das imagens para os grupos G1 e G2, devido à
impossibilidade de contagem da área (μm2) nos subgrupos experimentais e
controles. Para o G3, observou-se uma área correspondentemente a
(10.598,37 ± 3.071,55) para G3-A.
5.3 Análise Estatística
De acordo com a Tabela 1, na avaliação com 15 dias, todos os animais
apresentaram inflamação que variou de leve a moderada, tanto nos subgrupos
experimentais quanto controles. Aos 30 e 45 dias, os subgrupos experimentais
apresentaram inflamação leve e nos subgrupos controles, com exceção de um
caso no grau moderado para ambos os tempos, todos tiveram inflamação leve.
Os resultados estatísticos não foram significantes (p > 0,05).

Tabela 1 – Infiltrado inflamatório
____________________________________________________________
Avaliação/Subgrupo Inflamação n % Valor de p
______________________________________________________________
15 dias
Experimental Leve 2 33,3 p(1) = 0,567
Moderada 4 66,7
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 2 33,3 p(1) = 1,000
Moderada 4 66,7
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
30 dias
Experimental Leve 6 100,0 **
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 5 83,3 p (1) = 1,000
Moderada 1 16,7
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
45 dias
Experimental Leve 6 100,0 **
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 5 83,3 p (1) =1,000
Moderada 1 16,7
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.
(1) Através do teste Exato de Fisher.

A Tabela 2 mostra que no resultado da vascularização com 15 dias todos os
animais do subgrupo experimental apresentaram-se com vascularização
moderada a intensa, onde as freqüências variaram de um a quatro casos, e no
subgrupo controle, os espécimes tiveram vascularização leve, moderada e
intensa, variando de um a quatro casos. Com 30 dias, no subgrupo
experimental, o grau de vascularização intenso foi predominante e apenas um
animal apresentou vascularização leve. Quanto ao subgrupo controle, a
vascularização foi leve, moderada e intensa, variando de um a três casos. Aos
45 dias, cada subgrupo experimental teve apenas um caso de vascularização
leve, sendo dois casos da forma moderada e os demais espécimes do grau
intenso. Nos subgrupo controle, a maioria dos casos foram de vascularização
intensa e apenas um foi da forma leve. Os resultados não foram
estatisticamente significantes (p > 0,05).

Tabela 2 – Vascularização
_______________________________________________________________
Avaliação/Subgrupo Vascularização n % Valor de p
15 dias
Experimental Moderada 2 33,3 p(1) = 1,000
Intensa 4 66,7
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 1 16,7 p(1) = 0,740
Moderada 3 50,0
Intensa 2 33,3
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
30 dias
Experimental Leve 1 16,7 p(1) = 1,000
Intensa 5 83,3
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 2 33,3 p(1) = 1,000
Moderada 3 50,0
Intensa 1 16,7
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
45 dias
Experimental Leve 1 16,7 p(1) = 0,697
Moderada 2 33,3
Intensa 3 50,0
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 1 16,7 p(1) = 1,000
Intensa 5 83,3
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
(1) Através do teste Exato de Fisher.

De acordo com a tabela 3, não houve reação de corpo estranho em
nenhum dos animais analisados de acordo com grupo (tempo de avaliação) e
subgrupo .
Tabela 3 – Reação de corpo estranho (RCE)
_______________________________________________________________
Avaliação/Subgrupo RCE n % Valor de p
_______________________________________________________________
15 dias
Experimental Ausente 6 100,0 **
Controle Ausente 6 100,0 **
_______________________________________________________________
30 dias
Experimental Ausente 6 100,0 **
Controle Ausente 6 100,0 **
_______________________________________________________________
45 dias
Experimental Ausente 6 100,0 **
Controle Ausente 6 100,0 **
_______________________________________________________________
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.
A Tabela 4 mostra a presença de tecido conjuntivo fibroso em todos os
animais analisados, independente do grupo e subgrupo.
Tabela 4 – Tecido conjuntivo fibroso
_______________________________________________________________
Avaliação/ Subgrupo TCF n % Valor de p
_______________________________________________________________
15 dias
Experimental Presente 6 100,0 **
Controle Presente 6 100,0 **
_______________________________________________________________
30 dias
Experimental Presente 6 100,0 **
Controle Presente 6 100,0 **
_______________________________________________________________
45 dias
Experimental Presente 6 100,0 **
Controle Presente 6 100,0 **
_______________________________________________________________
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.

Segundo a Tabela 5, na avaliação com 15 dias, a atividade
osteoblástica apresentou-se, fortemente presente com 83,0% e presente com
16,7% no subgrupo A, e praticamente invertendo estes valores para o
subgrupo B. Após 30 dias, o subgrupo experimental teve atividade
osteoblástica fortemente presente em 100% dos espécimes e o subgrupo
controle apresentou a maioria presente, 66,7% e 33,3% fortemente presente.
Com 45 dias, todos os animais do subgrupo experimental teve atividade
osteoblástica fortemente presente (100%), enquanto que o subgrupo controle
apresentou igualmente presente (50%) e fortemente presente (50%). Não se
verificaram diferenças significantes entre os grupos para nenhum dos
subgrupos (p > 0,05).
Tabela 5 – Atividade osteoblástica segundo o grupo e o subgrupo
_______________________________________________________________
Grupo /Subgrupo Atividade osteoblástica n % Valor de p
_______________________________________________________________
G1
A Presente 1 16,7 p(1) = 1,000
Fortemente presente 5 83,3
TOTAL 6 100,00
B Presente 5 83,3 p(1) = 1,000
Fortemente presente 1 16,7
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
G2
A Fortemente presente 6 100,0 **
TOTAL 6 100,0
B Presente 4 66,7 p(1) = 1,000
Fortemente presente 2 33,3
TOTAL 6 100,0
______________________________________________________
G3
A Fortemente presente 6 100,0 **
TOTAL 6 100,0
B Presente 3 50,0 p(1) = 0,545
Fortemente presente 3 50,0
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
(**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.
(1) Através do teste Exato de Fisher.

A Tabela 6 mostra os resultados da neoformação óssea segundo o
grupo e o subgrupo, classificando-a em: 1) leve, 2) leve-moderada, 3)
moderada, 4) moderada-intensa, 5) intensa e 6) completa. Não houve
diferenças estatisticamente significantes (p > 0,05).
Tabela 6 – Neoformação óssea
_______________________________________________________________
Grupo / Subgrupo Neoformação óssea n % Valor de p
_______________________________________________________________
G1
Experimental Leve 1 16,7 p(1) = 0,740
Leve-moderada 4 66,7
Moderada 1 16,7
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 5 83,3 p(1) = 1,000
Leve-moderada 1 16,7
TOTAL 6 100,0
______________________________________________________
G2
Experimental Leve-moderada 4 66,7 p(1) = 0,481
Moderada 2 33,3
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 4 66,7 p(1) = 1,000
Leve-moderada 2 33,3
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
G3
Experimental Moderada 2 33,3 p(1) = 0,610
Moderada-intensa 2 33,3
Intensa 2 33,3
TOTAL 6 100,0
Controle Leve 3 50,0 p(1) = 0,766
Leve-moderada 2 33,3
Moderada 1 16,7
TOTAL 6 100,0
_______________________________________________________________
(1) Através do teste Exato de Fisher.

Da tabela 7 é possível concluir que a neoformação óssea estava
presente nos grupos G1, G2 e G3 do subgrupo A e ausente ou incipiente nos
grupos G1, G2 e G3 do subgrupo B portanto existe diferença fortemente
significativa entre os grupos para os subgrupos.
Tabela 7 – Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação
óssea
_______________________________________________________________
Avaliação Subgrupo Média ± DP Valor de p (%)
_______________________________________________________________
G1 A 2,00 ± 0,63 p(1) = 0,604
B 1,17 ± 0,41 p(1) = 0,727
_______________________________________________________________
G2 A 2,33 ± 0,52 p(1) = 0,275
B 1,33 ± 0,52 p(1) = 1,000
_______________________________________________________________
G3 A 4,00 ± 0,89 p(1) = 0,470
B 1,67 ± 0,82 p(1) = 0,316
_______________________________________________________________
(1) Através do teste de Mann-Whitney.
A tabela seguinte mostra a neoformação óssea através da análise
morfométrica no período de 45 dias entre o subgrupo experimental e controle.
Tabela 8 - Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação óssea
através da segmentação morfométrica.
Subgrupo Média ±DP Valor de p
_______________________________________________________________
• Experimental 10598,37 ± 3071,55 p(1) = 0,222
_______________________________________________________________
• Controle 3689,09 ± 2194,10 p(1) = 0,222
_______________________________________________________________
(1)Através do teste de Mann-Whitney

Discussão

6 Discussão
Os enxertos autógenos ainda são tidos como “padrão ouro”, para
lesões acima do limite crítico de reparo, devido à sua capacidade de
osteogenicidade, osteocondutividade, osteoindução e aspectos de segurança
dentro da janela imunológica do receptor (VON ARX et al., 2001; NKENKE et
al., 2002). Todavia os enxertos autógenos implicam em morbidade causada á
área doadora e consiste de uma fonte esgotável (KHAN et al., 2005; FELLAH
et al., 2008; WALSH et al., 2008).
Para que estas e outras limitações sejam superadas e também devido
aos grandes desenvolvimentos científico e tecnológico, os profissionais em
saúde lançam mão da utilização de biomateriais de origem sintética que
possibilitam, em muitos casos, a diminuição ou a eliminação do uso de
materiais de origem biológica (DALAPICULA; CONZ, 2008).
O ponto crítico para as pesquisas em biomateriais sintéticos é a
utilização de um modelo animal que tenha características semelhantes ao
reparo ósseo, intramembranoso, do complexo buco-maxilo-facial. No entanto,
vários modelos animais têm sido propostos no desenvolvimento de um
protocolo padrão. (BUCHAIM et al., 2002; LIMEIRA JÚNIOR, 2004; FELLAH et
al., 2008).
No experimento utilizou-se calota craniana de ratos Wistar já que
possibilita um estudo pareado, sem efeitos indesejáveis entre os subgrupos
experimental e controle, são de fácil manuseio e acesso no mercado, além do
que agrega os benefícios de possuírem osso com reparo semelhante aos
maxilares. O osso parietal é formado por uma placa que apresenta corticais
externa e interna compactas, relativamente espessas, com faixa intermediária
estreita de osso medular e com ossificação intramembranosa (FROTA, 2006).
Ainda neste trabalho foram estabelecidos critérios como animais devidamente
anestesiados para diminuir a morbidade pós-operatória e defeitos acima do
limite crítico de reparo fisiológico 5,0 mm de diâmetro, definido como limite
crítico para o osso parietal de ratos Wistar (JONES et al., 2007).
Foi utilizado na presente pesquisa o biomaterial sintético composto de
hidroxiapatita e tricálcio fosfato (Gen-phos®) Estes biomateriais são de
micropartículas com características osteocondutoras e reabsorção

elativamente lenta. A utilização de derivados inorgânicos sintéticos
(hidroxiapatita e β- tricálcio fosfato) como materiais de preenchimento,
espaçadores e substitutos para os enxertos ósseos, sugere biocompatibilidade
em relação ao tecido hospedeiro, pois as reações inflamatórias observadas
histologicamente (Tabela 1) foram comparadas entre os espécimes enxertados
e de controle, variando de leve a moderado entre os grupos G1, G2 e G3 e
diminuindo de intensidade no subgrupo A de acordo com o tempo, aliado ao
aumento da vascularização (Tabela 2) demonstrando que o processo
inflamatório não é devido exclusivamente ao material utilizado, mas do próprio
processo de reparação tecidual, semelhante a encontrados em ensaios
experimentais( SICCA et al., 2000; MOREIRA et al., 2003; SANADA et al.,
2003).
É interessante o fato de não ter sido observada reação de corpo
estranho (Tabela3) em nenhum dos subgrupos, seja no experimento ou
controle, independente do período observado nesta pesquisa, corroborando
com os padrões aceitos para materiais biocompatíveis de acordo com Estrela
(2001), onde deve haver discreta ou nenhuma reação tecidual nos períodos
avaliados e ainda diminuindo com o decorrer dos períodos sendo insignificante
aos 60 dias. De acordo com os achados de Frota (2006), esses resultados
insignificantes de reação a corpo estranho pode ser evidenciado
histologicamente devido à permeabilidade do tecido conjuntivo entre os
grânulos do material implantado, o que confere um aspecto reticular, menos
evidente aos 30 dias, sem que isto tenha promovido algum tipo de reação
tecidual. Dessa forma é comum este tipo de reação ao material quando
implantado em tecido mole, sendo a reação minimizada no uso em defeitos
ósseos (FELLAH et al., 2007).
O tecido conjuntivo fibroso (Tabela 4) esteve presente em todos os
animais analisados, independente do grupo e subgrupo, no entanto houve
aumento considerável da celularidade no G3 em comparação ao G1, podendo
este fato ser atribuído a uma maior proliferação e transformação das células
osteoprogenitoras observada histologicamente pela morfodiferenciação celular.
Estes achados coadunam com os estudos de Cardoso (2008).
Em todos os animais deste estudo foi visualizada a atividade
osteoblástica entretanto, a atividade osteoblástica esteve, nos subgrupos

experimentais, mais fortemente presente em comparação ao controle.
Segundo a Tabela 5, na avaliação com G1, a atividade osteoblástica
apresentou-se, fortemente presente em 5 animais e presente em apenas 1 no
subgrupo A, praticamente invertendo estes valores para o subgrupo B. para
G2, o subgrupo A teve atividade osteoblástica fortemente presente em todos os
espécimes e o subgrupo B apresentou a maioria presente em 4 e 2 espécimes
fortemente presente. No G3, todos os animais do subgrupo A apresentou
atividade osteoblástica fortemente presente, enquanto que o subgrupo B
apresentou igualmente presente em metade destes. Os achados histológicos
mostraram pavimentação osteoblástica em trabéculas ósseas neoformadas,
tanto a partir das bordas do defeito quanto da superfície das partículas do
biomaterial, o que vai de encontro aos resultados de Handschel et al. (2002)
que atribuíram ao tricálcio fosfato (TCP) a ausência de osteocondutividade
quando implantados na calvária de ratos Wistar. No entanto, esta propriedade
do TCP foi relatada por Frota (2006), assim como da hidroxiapatita por Limeira
Júnior (2004).
Observou-se neoformação óssea em todos os espécimes da amostra,
apresentando maior intensidade no subgrupo A, havendo aumento gradativo da
reparação, sendo melhor identificado (Tabela 6) em G2 e G3. Tanto o grupo
controle quanto o experimental apresentaram um aumento da neoformação
óssea ao longo o tempo, confirmando os resultados de Laureano Filho (2001).
Na histomorfometria, os grupos experimentais apresentaram neoformação
óssea estatisticamente maior que o grupo controle concordando com os
resultados de Horch et al. (2006). Esse fato também foi confirmado pela análise
histológica de Miranda et al. (2005), concluindo que o material ósseo inorgânico
pode ser usado de rotina em cirurgia ortopédica, proporcionando uma
cicatrização óssea precoce.
Nesta pesquisa, a matriz óssea neoformada foi submetida à análise
morfométrica através do método de segmentação de imagens (QUEIROGA et
al., 2008). Para a segmentação, foi utilizado o algoritmo k-médias com 7
clusters (classes) a partir das bandas “a” e “b” do sistema L*a*b*. No entanto,
nos períodos de 15 e 30 dias, as imagens segmentadas não apresentaram
classes que pudessem ser aproveitadas no cálculo de área (μm²). Desta forma,
apenas o período de 45 dias foi considerado. Este fato pode ter ocorrido em

função da neoformação óssea incipiente e da presença marcante das
partículas dos biomateriais nos grupos G1 e G2 que, provavelmente,
dificultaram uma dissociação efetiva das imagens. De acordo com a tabela 7, o
subgrupo A apresentou média de escores da neoformação óssea ligeiramente
maior que o B em G3, pois a regeneração óssea aconteceu pelas bordas do
defeito e de forma incipiente. A neoformação óssea no subgrupo A ocorreu
entre as partículas do biomaterial, principalmente nos grupos 2 e 3. Neste
último, foi possível a identificação do preenchimento de toda extensão do
aspecto basilar do defeito ósseo na maioria dos animais.
Verifica-se que o biomaterial utilizado tem importante papel sobre o
metabolismo ósseo, na osteogênese, e apresenta característica
osteocondutora, tendo indicação para ser implantado em defeitos ósseos acima
do tamanho crítico, contribuindo para o tratamento de lesões ósseas do
complexo bucomaxilofacial.

Conclusão

7 Conclusão
De acordo com os resultados obtidos conclui-se que reparação dos
defeitos ósseos na calota craniana de ratos Wistar, com a utilização de
biomaterial de origem sintética (hidroxiapatita + β-tricalcio fosfato) nos períodos
de 15, 30 e 45 foi melhor no subgrupo experimental (A) comparado ao controle
(B), constatando a estímulo da formação de osso pelo biomaterial.

Referências
Bibliográficas

Referências Bibliográficas
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Apêndice
Formulário1- Identificação da gaiola
PESQUISA: ESTUDO HISTOMORFOMETRICO DA
REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS APÓS O USO DE
BIOMATERIAL DE ORIGEM SINTÉTICA
(HIDROXIAPATITA + BETA-TRICALCIOFOSFATO).
RESPONSÁVEIS PELA PESQUISA:
Orientador – Francisco Limeira Júnior
Pesquisadora – Caroline d’ Fatima Santos de
Sousa
GRUPO*:
Animais**
Data da
Cirurgia
Massa
corporal
Sacríficio
01
02
03
04
05
06
* Identificação dos grupos:
G1-01 círculo – 15 dias
G2- 02 círculos – 30 dias
G3-03 círculos – 45 dias
** Identificação dos animais:
01 – I 02 - II 03 - III 04 - IIII 05 - IIIII 06 - IIIIII