QUANTA Lite ACA IgM III - inova

QUANTA Lite® ACA IgΜ III 708630
Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση
CLIA σύνθετος: ψηλός
Σκοπό Χρήση
Το QUANTA Lite TM ACA IgM III αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον
ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων IgM έναντι καρδιολιπινών σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των
αντικαρδιολιπινικών αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλες ορολογικές εξετάσεις και
κλινικά δεδομένα για τον προσδιορισμό της προδιάθεσης για θρομβώσεις σε άτομα με Συστηματικό Ερυθηματώδη
Λύκο (ΣΕΛ) ή με νοσήματα παρεμφερή με ΣΕΛ.
Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου
Τα αντικαρδιολιπινικά αντισώματα έχουν συσχετιστεί άμεσα με τη φλεβική και αρτηριακή θρόμβωση. 1 Τα ευρήματα
αυτά παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά σε μελέτες του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (ΣΕΛ), μια νόσος όπου
πολλά συμπτώματα της συμπεριλαμβάνουν θρομβώσεις. Από τα πολλά αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται στον
ΣΕΛ, δύο έχουν βρεθεί ότι παράγονται έναντι των φωσφολιπιδίων όπως οι καρδιολιπίνες. 2
Αρχη Μεθοδου
Το κεκαθαρμένο αντιγόνο καρδιολιπίνης είναι συνδεδεμένο στα πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο
υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls)
και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στις πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντισώματα καρδιολιπίνης να
συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι
ανθρώπινο IgΜ αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου
IgΜ αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος – ακινητοποιημένου αντιγόνου καρδιολιπίνης.
Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη
συγκέντρωση των αντισωμάτων καρδιολιπίνης. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η
παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων καρδιολιπίνης συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων ορών
ελέγχου και της καμπύλης αναφοράς πέντε σημείων η οποία προέρχεται από της τιμές των πρότυπων ορών
ελέγχου. Τα αποτελέσματα δίνονται ημιποσοτικά σε MPL μονάδες.
Αντιδραστηρια
1. Μικροπλάκα πολυστυρενίου ELISA με επικάλυψη από κεκαθαρμένο αντιγόνο καρδιολιπίνης καθώς και
πρωτεΐνη β 2 GPI βοοειδών (12-1 x 8 πηγαδάκια), με βάση σε αλουμινένια συσκευασία που περιλαμβάνει
υλικό απορρόφησης της υγρασίας
2. ACA Negative Control, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml ACA αρνητικός πρότυπο ελέγχου (control)
που περιέχει ανθρώπινο ορό αρνητικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό
διάλυμα
3. ACA IgM Control III, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml ACA IgM III θετικό πρότυπο ελέγχου
(control) που περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό
διάλυμα
4. ACA IgM Calibrator A III, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml ACA IgM III πρότυπο διάλυμα Α που
περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα
5. ACA IgM III Calibrator B, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml ACA IgM III πρότυπο διάλυμα Β που
περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα
6. ACA IgM III Calibrator C, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml ACA IgM III πρότυπο διάλυμα C που
περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα
7. ACA IgM III Calibrator D, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml ACA IgM III πρότυπο διάλυμα D που
περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα
8. ACA IgM III Calibrator E, Ένα φιαλίδιο, προαραιωμένο, των 1.2 ml ACA IgM III πρότυπο διάλυμα E που
περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα καρδιολιπίνης και συντηρητικά σε ρυθμιστικό διάλυμα
9. ACA III Sample Diluent, Ένα φιαλίδιο χρωματισμένο ροζ, των 50 ml ACA III αραιωτικό δειγμάτων που
περιέχει PBS ρυθμιστικό φυσιολογικό διάλυμα με σταθεροποιητές πρωτεϊνών και συντηρητικά
10. ACA III PBS Concentrate, Ένα φιαλίδιο των 50 ml ACA συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης PBS 20x,
χρώματος ερυθρού. Ανατρέξτε στο τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης.
11. HRP Conjugate IgM (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgM, 1 φιαλίδιο – χρώματος πράσινος, που περιέχει
ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml
12. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml
13. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο – άχρωμο, 10ml
Προσοχή
1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος,
στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί
καρκίνο.
2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού
του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται
από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή
απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης
προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 3
3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να
είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες
σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την
απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί
να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό.
1

4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει
κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το
δέρμα.
5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν
καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και
επαφή με το δέρμα ή τα μάτια.
6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες,
διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα
μάτια.
7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια.
8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς,
εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων.
Ειδικα Μετρα
1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro.
2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει
σε ανακριβή αποτελέσματα.
3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα
στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου.
4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει
διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του
κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας.
5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των
αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του
πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του
φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και
επαναλήψιμα αποτελέσματα.
6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου.
7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει
αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας.
8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις
της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης.
9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των
αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα
προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και
συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών.
Αποθήκευση
1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη
τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες.
2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην
αλουμινένια συσκευασία τους ,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C.
3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2 - 8 ο C.
Δείγματα
Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο
υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα.Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα
ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να
αποφεύγονται.
Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (NCCLS)
Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα
πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία
δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 – 8 ο C)
μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους –20 ο C. Τα κατεψυγμένα
δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση.
Διαδικασία
Υλικά που παρέχονται
1 ACA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση
1 1.2 ml ACA αρνητικός πρότυπο ελέγχου (control) (έτοιμος προς χρήση)
1 1.2mL αραιωμένος ACA IgM III Control Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση)
1 1.2mL αραιωμένος ACA IgM III Calibrator A Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση)
1 1.2mL αραιωμένος ACA IgM III Calibrator B Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση)
1 1.2mL αραιωμένος ACA IgM III Calibrator C Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση)
1 1.2mL αραιωμένος ACA IgM III Calibrator D Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση)
1 1.2mL αραιωμένος ACA IgM III Calibrator E Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση)
1 50 ml ACA III αραιωτικό δειγμάτων που περιέχει PBS
1 50 ml ACA III συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης PBS 20x
1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgM (αίγας),
1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο
1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ
2

Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται
Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 – 300 και 500 μL
8κάναλη πιπέτα ρυθμιζόμενου όγκου
Σωληνάρια RIA των 4 ml για τις αραιώσεις των δειγμάτων
Απεσταγμένο νερό
Ένα δοχείο ενός λίτρου για την αραίωση του ACA III Διάλυμα πλυσίματος
Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm
Μεθοδολογια
Πριν ξεκινήσετε
1. ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΣ: Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία
δωματίου (20 -26°C) και να έχουν αναδευτεί καλά.
2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο PBS 1:20 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου ACA III PBS
Concentrat σε 950 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη
μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 4 ml συμπυκνωμένου PBS
και 76 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια.
3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό
δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Τα διαλύματα αναφοράς, οι
πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση.
4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των
διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης
των δειγμάτων.
5. Προετοιμασία της καμπύλης αναφοράς πέντε σημείων που βασίζεται στις τιμές των προαραιωμένων ACA
HRP IgΜ διαλυμάτων αναφοράς.
ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ
ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ (ΜPL)
ACA IgΜ III διάλυμα αναφοράς A 150.0
ACA IgΜ III διάλυμα αναφοράς B 75.0
ACA IgΜ III διάλυμα αναφοράς C 37.5
ACA IgΜ III διάλυμα αναφοράς D 18.8 ή 18.75
ACA IgΜ III διάλυμα αναφοράς E 9.4 ή 9.375
Διαδικασία
1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου και να
έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδίων που απαιτούνται, και φυλάξτε τις
υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την
μικροπλάκα από την υγρασία.
2. Προσθέστε στα πηγαδάκια 100µL για κάθε έναν από τους πέντε ρυθμιστές, τα αραιωμένα δείγματα των
εξεταζόμενων, τον αρνητικό ορό ελέγχου σε ACA και τον ορό ελέγχου IgM έναντι ACA III.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ο ορός ελέγχου για IgM έναντι ACA III και ο αρνητικός ορός ελέγχου σε ACA είναι
προαραιωμένοι και έτοιμοι για χρήση. Η τιμή και το αποδεκτό εύρος τιμών για τον ορό ελέγχου IgM έναντι
ACA III αναγράφεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Αν ο ορός ελέγχου δεν εμπίπτει εντός του αποδεκτού
εύρους τιμών που αναγράφεται στην ετικέτα, επαναλάβετε την ανάλυση. Αν με τη νέα δοκιμασία ο ορός
ελέγχου συνεχίζει να βρίσκεται εκτός των αναφερόμενων τιμών, επικοινωνήστε με το τμήμα τεχνικής
υποστήριξης της INOVA. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης όλων των δειγμάτων.
3. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης
ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος.
4. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου
ρυθμιστικού διαλύματος ACA III PBS σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο
ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε
απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό
κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την
πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων.
5. Προσθέστε 100 μl HRP IgM συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα
φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από
το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ
ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ
ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ.
Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 3.
6. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 4.
7. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου και επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος.
8. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε
την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop
Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο,
για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια.
9. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της
διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm και αναφοράς 620 nm.
3

Ποιοτικός έλεγχος
1. Τα διαλύματα αναφοράς, οι πρότυποι οροί θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική
διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά.
2. Τα διαλύματα αναφοράς, οι πρότυποι οροί είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να
χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των αντιδραστηρίων
3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία
θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή
επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα
μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους ≤-20°C.
4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση
που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία.
α. Η απορρόφηση του διαλύματος αναφοράς Α θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση
του θετικού πρότυπου ορού η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του
αρνητικού πρότυπου ορού .
β. Η απορρόφηση του διαλύματος αναφοράς Α θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η
απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2.
γ. Η απορρόφηση του ορού ελέγχου ACA IgM III Control πρέπει να είναι δύο φορές εκείνη του
αρνητικού ορού ελέγχου ACA Negative Control ή πάνω από 0.25.
δ. Η συγκέντρωση του θετικού πρότυπου ορού θα πρέπει να βρίσκεται εντός του αποδεκτού εύρους
που αναγράφεται στην ετικέτα.
ε. Ο χρήστης θα πρέπει να παραπέμπεται στις οδηγίες που δίνονται από το CLSI (NCCLS) C24-A3
κείμενο για επιπλέον πληροφορίες στα θέματα ποιοτικού ελέγχου.
Υπολογισμός Αποτελεσμάτων
1. Υπολογίστε τη μέση τιμή σε όλες τις εις διπλούν μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων.
2. Κατασκευάστε την καμπύλη αναφοράς η οποία θα προκύψει από τη μέση τιμή της μέτρησης της οπτικής
πυκνότητας και την αντιστοιχία της σε λογαριθμική βάση στη δεδομένη γνωστή συγκέντρωση όπως
αναφέρεται στον παραπάνω πίνακα.
3. Με βάση την καμπύλη αναφοράς υπολογίστε τη συγκέντρωση IgΜ καρδιολιπίνης (άξονας Χ) στα υπο
έλεγχο δείγματα, αντιστοιχώντας την απορρόφηση τους σε συγκέντρωση ουσίας (άξονας Ψ).
Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων
Η ανοσοενζυμική μέθοδος είναι μια ευαίσθητη τεχνική που είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές
διαφοροποιήσεις στα εξεταστέα δείγματα. Κάθε εργαστήριο είναι υποχρεωμένο να υπολογίσει το δικό του αποδεκτό
εύρος φυσιολογικών τιμών με βάση τις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό.
1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει ύπαρξη IgΜ τάξης αντισώματα καρδιολιπίνης και μπορεί να
χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλες ορολογικές εξετάσεις και κλινικά δεδομένα για τον προσδιορισμό
της προδιάθεσης για θρομβώσεις σε άτομα με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) ή με νοσήματα
παρεμφερή με ΣΕΛ.
2. Τα αποτελέσματα πρέπει να δίνονται σε MPL μονάδες. Με βάση την εκτίμηση 489 δειγμάτων από
φυσιολογικούς δότες και 142 δειγμάτων από εξεταζόμενους θετικούς σε αντισώματα IgG, IgM ή/και IgA
έναντι καρδιολιπινών, ορίστηκε προτεινόμενη οριακή τιμή 12,5 MPL. Συνιστάται κάθε εργαστήριο να
καθιερώσει το δικό του εύρος φυσιολογικών τιμών. Ακόμα και όταν χρησιμοποιείται καμπύλη
βαθμονόμησης, εξακολουθεί να υπάρχει διακύμανση στα αποτελέσματα σε χαμηλά επίπεδα και είναι συχνή
η εμφάνιση ψευδών θετικών αποτελεσμάτων. 4 Για το λόγο αυτό, συνιστούμε οι τιμές που κυμαίνονται από
12.5 έως και 20 MPL (συμπεριλαμβανομένου), να θεωρούνται ακαθόριστες, με θετικά αποτελέσματα να
εκχωρούνται σε δείγματα ασθενών >20 MPL. Οι Harris και Pierangeli προτείνουν μια εναλλακτική ημιποσοτική
μέθοδο για την έκφραση των αποτελεσμάτων. 4 Συνιστούμε τιμές μεταξύ 20-80 MPL να
θεωρούνται από χαμηλές μέχρι μετρίως θετικές, και τιμές άνω των 80 MPL να θεωρούνται ως υψηλά θετικά
αποτελέσματα.
3. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα υποδηλώνει απουσία αντισωμάτων καρδιολιπίνης IgΜ τάξης ή τα επίπεδα των
αντισωμάτων είναι χαμηλότερα από τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου.
4. Προτείνεται η αναφορά των αποτελεσμάτων να συνοδεύεται από τη φράση « Το ακόλουθο δείγμα
επεξεργάστηκε με αντιδραστήρια της INOVA QUANTA Lite® ACA IgΜ III ELISA. Η ανίχνευση αντισωμάτων
καρδιολιπίνης IgΜ τάξης με διαφορετική μέθοδο και αντιδραστήρια μπορεί να δώσει διαφορετικά και μη
συγκρίσιμα αποτελέσματα. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων του IgM δεν μπορεί να συσχετιστεί με
τίτλο.»
Περιορισμοί της Μεθόδου
1. Η κλινική σημασία της ανίχνευσης των αντικαρδιολιπινικών αντισωμάτων σε άλλα νοσήματα πέραν του
ΣΕΛ είναι ακόμα υπό διερεύνηση.
2. Σε δημοσιευμένες μελέτες ο επιπολασμός των θετικών ACA σε ασθενείς με ΣΕΛ κυμαίνεται από 5 – 40%
για τα τάξης IgM.
3. Όταν βρεθεί αρνητική ισχύς διαλύματος ACA παρουσία των κλινικών ενδείξεων, ίσως χρειαστεί δοκιμασία
για κύτταρα λύκου ή άλλη δοκιμασία, όπως για αντισώματα anti-β 2 GPI.
4. Η ανεύρεση αντισωμάτων καρδιολιπίνης δεν μπορεί να θεωρηθεί διαγνωστικός δείκτης. Τα θετικά
αποτελέσματα θα πρέπει να αξιολογούνται σε συνδυασμό με τα κλινικά στοιχεία.
5. Η θεραπευτική αγωγή δεν μπορεί να βασίζεται μόνο στην ανεύρεση αντισωμάτων καρδιολιπίνης.
6. Μεγάλο ποσοστό ατόμων με ενεργή ή οροθετική σύφιλη έχουν θετικά ACA. Γι αυτό το λόγο θα πρέπει να
γίνεται επιβεβαιωτικός έλεγχος που να αποκλείει την περίπτωση της σύφιλης.
7. Τα ACA μπορεί να εμφανιστούν παροδικά σε περίπτωση μόλυνσης. Στην περίπτωση θετικών
αποτελεσμάτων προτείνεται επανέλεγχος με τη πάροδο κάποιου λογικού χρονικού διαστήματος.
8. Η ύπαρξη ρευματειδούς παράγοντα μπορεί να επηρεάσει τη ανίχνευση των IgM τάξης ACA.
9. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων ανοσοσφαίρινων στο δείγμα του ασθενή μπορεί να
προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο μη-συγκεκριμένης σύνδεσης και να παράγουν ψευδή θετικά σε αυτή την
ανάλυση.
4

10. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού.
11. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και
άλλες ορολογικές εξετάσεις.
12. Αν το διάλυμα ACA PBS Concentrate δεν θερμανθεί και δεν αναμιχθεί καλά πριν από τη χρήση, μπορεί να
προκύψουν ασταθή αποτελέσματα.
Αναμενόμενες Τιμές
Φυσιολογικές τιμές
Εξετάστηκαν 489 τυχαία δείγματα φυσιολογικού δότη για IgM έναντι ACA. Από αυτό τον αριθμό, τρία δείγματα
βρέθηκαν εντός του ασαφούς εύρους τιμών 12.5-20 MPL. Κατά την εξέταση τυχαίων δειγμάτων φυσιολογικών
δοτών βρέθηκαν επίσης πέντε θετικά δείγματα. Αυτά τα δείγματα προσδιορίστηκαν ως θετικά με βάση την
πρόσθετη εξέταση με άλλα 510 (k) εγκεκριμένα κιτ. Οι τιμές για το 95.3% των δειγμάτων από φυσιολογικούς δότες
βρέθηκαν να είναι κάτω από 12.5 MPL.
Ευαισθησία και Ειδικότητα
Συσχετισμός με το IgM έναντι ACA δεύτερης γενιάς της INOVA
Εξετάστηκαν συνολικά 631 δείγματα για IgM έναντι ACA δεύτερης γενιάς και IgM έναντι ACA τρίτης γενιάς. Αυτά τα
δείγματα περιλαμβάνουν 489 δείγματα από φυσιολογικούς δότες που αναφέρονται στη μελέτη Normal Range
καθώς και 142 δείγματα από εξεταζόμενους που είναι θετικοί ή ακαθόριστοι σε αντισώματα IgG, IgM ή/και IgA
έναντι καρδιολιπινών. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω.
QUANTA Lite®ACA IgM III (τρίτης γενιάς)
- I +
- 493 11 0 Σχετική Ευαισθησία 94.0%
ACA IgM ELISA I* 18 19 7 Σχετική Ειδικότητα 97.8%
δεύτερης γενιάς + 0 5 78 Σχετική Ευκρίνεια 93.5%
*Ακαθόριστο
Αντιπροσωπευτική πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας IgM Sapporo
EY2C9
Παρακάτω εικονίζεται μια αντιπροσωπευτική πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα
Sapporo EY2C9 ως πρότυπο. Αυτό το υλικό προέρχεται από το εργαστήριο του Δρ. Takao Koike. Χρησιμοποιείται
στο QC των μικροπλακών ACA και είναι διαθέσιμο από την INOVA Diagnostics ξεχωριστά (αριθμός παραγγελίας #
5086673). Η καμπύλη προετοιμάστηκε με αραίωση του EY2C9 σε αναλογία 1:100 σε αραιωτικό δείγματος ACA
Sample Diluent και, στη συνέχεια, με διαδοχική αραίωση του υλικού στο ίδιο υλικό αραίωσης.
Σημείο OD Sapporo Τιμές µg/mL
A EY2C9 1:100 2.181 0.156
B EY2C9 1:200 1.179 0.078
C EY2C9 1:400 0.568 0.039
D EY2C9 1:800 0.271 0.0195 or 0.02
E EY2C9 1:1600 0.144 0.00975 or 0.0098
F EY2C9 1:3200 0.084 0.004875 or 0.0049
Στην παραπάνω καμπύλη των δειγμάτων, η οριακή τιμή των 12.5 MPL αντιστοιχεί σε 0.0195 μg/mL EY2C9. Κάθε
εργαστήριο χρειάζεται να καθορίσει το δικό του φυσιολογικό εύρος τιμών.
5

Ακρίβεια και Αναπαραγωγικότητα
Η επαναληψιμότητα μεταξύ των εκτελέσεων και η αναπαραγωγιμότητα της ανάλυσης μετρήθηκε μέσω της
εκτέλεσης δύο αντιγράφων, ενός θετικού και ενός Aρνητικός, σε τέσσερις ξεχωριστές αναλύσεις, τέσσερις
διαφορετικές ημέρες. Η επαναληψιμότητα κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης και η αναπαραγωγιμότητα της ανάλυσης
μετρήθηκε μέσω της εκτέλεσης δεκαέξι αντιγράφων, ενός θετικού και ενός Aρνητικός, σε μία μεμονωμένη ανάλυση.
Η μέση τιμή, τυπική απόκλιση και συντελεστής διακύμανσης για κάθε δείγμα συνοψίζονται παρακάτω.
Θετικό
Aρνητικός
μέση τιμή MPL SD %CV μέση τιμή MPL SD %CV
Σύνολο 66.0 5.4 8.2% 4.1 0.8 19.1%
Εντός Διαδικασίας 65.0 4.4 6.8% 4.1 0.9 0.2%
Ενδιάμεσα της Διαδικασίας 67.8 7.5 11.0% 3.9 0.6 15.9%
Βιβλιογραφία
1 Lancet i, 912-913, 1985.
2. Clinics in Rheumatic Diseases 8, 137-151, 1982.
3. Centers for Disease Control/National Institutes of Health Manual Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories: Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition,
2007.
4. The VII th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies, October 9-13, 1996. Louisiana
State University Medical Center.
QUANTA Lite και INOVA Diagnostics είναι σήματα κατατεθέντα Copyright 2011 All Rights Reserved©
Κατασκευαστής:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745
Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950
support@inovadx.com
Aντιπροσωπευτικός:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Germany
Tel.: +49-6894-581020
Fax.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628630GRC July 2011
Revision 17
6