centro universitário feevale instituto de ciências da saúde curso de ...

CENTRO UNIVERSITÁRIO FEEVALEINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDECURSO DE BIOMEDICINAJORGE ALESSANDRO DEOTTIDESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DEFUROSEMIDA EM PLASMA E URINA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDADE ALTA EFICIÊNCIANOVO HAMBURGO, JUNHO DE 2008

JORGE ALESSANDRO DEOTTIDESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DEFUROSEMIDA EM PLASMA E URINA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDADE ALTA EFICIÊNCIACentro Universitário FeevaleInstituto de Ciências da SaúdeCurso de BiomedicinaTrabalho de Conclusão de Curso IProfessor Orientador: Profº. Dr. Rafael LindenNovo Hamburgo, Junho de 20082

DADOS DO PROJETO E DO PROPONENTETítulo do Projeto:Desenvolvimento de um método paradeterminação de furosemida em plasma eurina por cromatografia líquida de altaeficiência( ) Imunologia( ) Hematologia( ) Líquidos Corporais( ) Micologia( ) BacteriologiaÁrea (s) de atuação em que se insere o( ) Bioquímica Clínicaprojeto (*):( ) Citopatologia( ) Genética( ) Parasitologia( x ) Toxicologia( ) OutrosOrientador do Projeto: Rafael LindenInstituição/Instituições Executora (s): - Centro Universitário FEEVALE;Data: Junho de 2008Palavras Chave: Furosemida, CLAE, Plasma Urina.3

SUMÁRIO1. CARACTERIZAÇÃO E JUSTIFICATIVA....................................................................... 062. OBJETIVOS.......................................................................................................................... 092.1. Objetivo Geral................................................................................................................. 092.2. Objetivos Específicos...................................................................................................... 093. EMBASAMENTO TEÓRICO............................................................................................. 103.1 Diuréticos........................................................................................................................ 103.2 Diuréticos de Alça........................................................................................................... 113.3 Furosemida....................................................................................................................... 123.4 Métodos Cromatográficos............................................................................................... 133.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência...................................................................... 133.6 Preparação das Amostras................................................................................................ 153.7 Análises Cromatográficas............................................................................................... 164. METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO............................................................... 174.1. Delineamento................................................................................................................... 174

4.2. Estratégia de ação............................................................................................................ 174.3. Solventes e Reagentes..................................................................................................... 184.4. Preparo das Amostras...................................................................................................... 184.5. Preparação da Fase Móvel e Condições Cromatográficas............................................... 194.6. Curva de Calibração........................................................................................................ 194.7. Ensaios de precisão e exatidão........................................................................................ 194.8. Equipamento.................................................................................................................... 205. RESULTADOS E IMPACTOS ESPERADOS................................................................... 216. RISCOS E DIFICULDADES............................................................................................... 227. CRONOGRAMA DE ATIVIDADES.................................................................................. 238. ORÇAMENTO E FORMAS DE FINANCIAMENTO...................................................... 24REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................... 25ARTIGO.................................................................................................................................... 31RESUMO................................................................................................................................... 33ABSTRACT............................................................................................................................... 34INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 35MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................... 38RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................................... 42CONCLUSÕES.......................................................................................................................... 47REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................... 48ANEXO....................................................................................................................................... 525

1 CARACTERIZAÇÃO E JUSTIFICATIVAA furosemida é um potente diurético de alça com estrutura química mostradana Figura 1 (WALSHE, 1996; EL-SAHARTY, 2003; DIAS, 2004; CAVALHEIRO etal., 2005; MARGALHO, 2005). Administrada tanto por via oral quanto intravenosa,com farmacocinética bem documentada em indivíduos saudáveis (WENK et al., 2006).Figura 1. Estrutura química da furosemidaEste fármaco apresenta uma rápida absorção pelo trato gastrointestinal,chegando a uma biodisponibilidade oral de aproximadamente 65% (MARGALHO etal., 2005; GILMAN, 2003; ABOU-AUDA et al., 2003), embora possa ocorrer umavariação de 10-100% (RIELLA, 2003).Freqüentemente usada no tratamento de diversas patologias e condiçõesfisiológicas, a furosemida é utilizada basicamente na hipertensão (EL-SAHARTY,2003; CAVALHEIRO et al., 2005; MARGALHO et al., 2005; WENK et al., 2006;MOREIRA, 2005; BUFFIN-MEYER et al., 2004), insuficiência renal crônica ou aguda6

(WALSHE, 1996; EL-SAHARTY, 2003; DIAS, 2004; WENK et al., 2006; HO, 2006),alguns tipos de edemas (EL-SAHARTY, 2003; DIAS, 2004; CAVALHEIRO et al.,2005; MARGALHO et al., 2005; WENK et al., 2006; MOREIRA, 2005; BUFFIN-MEYER et al., 2004; NORRIS et al., 2007), cirrose (WALSHE, 1996; EL-SAHARTY,2003 MARGALHO et al., 2005; WENK et al., 2006), insuficiência cardíaca congestiva(EL-SAHARTY, 2006; MARGALHO et al., 2005) e recuperações em cirurgiascardíacas (NORRIS et al., 2007).A ação diurética da furosemida se dá na parte ascendente da alça de Henle,inibindo o co-transportador Na + -K + -2Cl - (MILLS et al., 1997; GILMAN, 2003;BUFFIN-MEYER et al., 2004). Com esta inibição ocorre primeiramente uma perda deNa + , principalmente pelos túbulos distais e ductos coletores dos rins (BUFFIN-MEYERet al., 2004; NORRIS et al., 2007). Esta perda de Na + continua até que o organismo seadapte e diminua a excreção deste eletrólito em particular (BUFFIN-MEYER et al.,2004). Um dos efeitos adversos observados no tratamento a longo prazo com essesfármacos é a perda excessiva de K + , que em alguns casos pode causar hipocalemia(BUFFIN-MEYER et al., 2004; NORRIS et al., 2007). Esta perda maciça de K + se deveao fato de a alta concentração de Na + no lúmen do ducto coletor aumentar a secreção deK + para a urina (BUFFIN-MEYER et al., 2004).Os fármacos deste tipo têm sido utilizados em competições esportivas a fim deproporcionar uma maior perda de peso através de uma diurese aumentada, por estemotivo, outros competidores passaram a utilizar este fármaco com o intuito de obteruma menor concentração de substâncias proibidas pelo World Anti-Doping Agency(WADA) na urina dificultando ou até mesmo impossibilitando a detecção destas(WENK et al., 2006; MOREIRA, 2005).A determinação de furosemida em plasma e urina é empregada em estudosfarmacocinéticos com pacientes, por exemplo, no tratamento com combinaçõesmúltiplas de fármacos, principalmente as que são excretadas pela via renal, além deestudos de bioequivalência (WENK et al., 2006). Vários métodos de CromatografiaLíquida de Alta Eficiência (CLAE) têm sido desenvolvidos para a determinação defurosemida em fluidos biológicos (MILLS et al., 1997; WENK et al., 2006).7

A CLAE é o método de escolha para análise de diuréticos devido ao custo daanálise ser inferior e a facilidade operacional, além da limitada disponibilidade demétodos alternativos como a técnica de cromatografia gasosa associada com detecçãoespectrométrica de massa (CG-EM). Para estes compostos, o uso de CG-EM é limitadodevido à baixa volatilidade dos compostos e a necessidade de uma etapa adicional dederivatização (MOREIRA, 2005).8

2 OBJETIVOS2.1 Objetivo GeralDesenvolver um método para determinação de furosemida em amostras deplasma pelo método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).2.2 Objetivos Específicos- Realizar ampla revisão sobre a farmacocinética e farmacodinâmica dafurosemida;- Determinar condições para a preparação das amostras;- Determinar condições analíticas por CLAE;- Obter uma curva de calibração;- Testar a precisão e exatidão do método;- Divulgar os resultados sob a forma de artigo em revista especializada.9

3 EMBASAMENTO TEÓRICO3.1 DiuréticosPor definição, os diuréticos são fármacos que aumentam a taxa do fluxo deurina (PADILLA et al., 2007; RIELLA, 2003; ZATZ, 2002), porém, estes que sãousados clinicamente também aumentam a taxa de excreção de cátions, principalmente oNa + , causando uma natriurese, além de um ânion associado, na sua grande maioria o Cl -(GILMAN, 2003).Embora a administração contínua de um diurético provoque um déficit efetivoe duradouro do Na + corporal total, a escala temporal da natriurese é limitada, pois hámecanismos compensatórios renais que reequilibram a excreção do mesmo com suaingestão, fenômeno este conhecido como “freio diurético” (GILMAN, 2003;FERGUSON et al., 1997).Os diuréticos são em sua grande maioria classificados de acordo com seu localde ação (diuréticos de alça), eficácia (diuréticos de alto limiar), entre outros (RIELLA,2003; ZATZ, 2002; BRATER, 1998), mas há também outra classificação de acordocom o mecanismo de ação ao qual o fármaco atua como, por exemplo, inibidores daanidrase carbônica, inibidores do simporte Na + -K + -2Cl - entre outros (GILMAN, 2003).O mecanismo de ação destes quando atuam sob a forma de anti-hipertensivosrelaciona-se inicialmente aos seus efeitos diuréticos e natriuréticos, com diminuição do10

volume extracelular. Após 4 a 6 semanas, o volume circulante praticamente senormaliza e há redução persistente da resistência vascular periférica, onde se comprovasua eficácia na redução da morbidade e da mortalidade cardiovasculares (SOCIEDADEBRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007).Destaca-se que os mais usados como anti-hipertensivos são os da classe dosdiuréticos de alça e os tiazídicos, este último em baixas doses (PADILLA et al., 2007).Os diuréticos poupadores de potássio apresentam pequena eficácia diurética, mas,quando associados aos tiazídicos e aos diuréticos de alça, são úteis na prevenção e notratamento de hipopotassemia. Seu uso em pacientes com redução da função renalpoderá acarretar hiperpotassemia (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA,2007).Atletas utilizam diuréticos a fim de perder peso rapidamente, além dediminuírem as concentrações de soluto na urina, o que não é permitido em competiçõesesportivas sendo estes proibidos, pois “mascaram” drogas com finalidades ergogênicas.Por ocorrer uma diurese acentuada, eles promovem uma leve perda de peso permitindoassim competirem em categorias de peso inferior as suas, estabelecendo uma vantagemsobre os adversários (CARVALHO et al., 2003; MOREIRA, 2005).3.2 Diuréticos de AlçaRecebem este nome por serem inibidores do simporte Na + -K + -2Cl - no ramoascendente espesso da alça de Henle, sendo altamente eficazes quando comparados comdiuréticos que atuam no túbulo proximal, os diuréticos de alça são altamente eficazes,levando também o nome de diuréticos de alto limiar (GILMAN, 2003).Apresentam como principais fármacos o Ácido Etacrínico, Bumetanida,Torasemida e Furosemida (GILMAN, 2003; BRATER, 1998), sendo este último ofármaco de maior destaque deste grupo e que será abordado neste trabalho.Os diuréticos de alça são usados principalmente em situações críticas depacientes com insuficiência renal aguda (BAGSHAW et al., 2007) e acabam excretando11

altos volumes de Na + , K + , Ca + , Cl - em todos os estágios de insuficiência renal crônica(MOURA, 2002; RISLER et al., 1998).Em situações de hipertensão arterial são mais utilizados onde há associaçãocom insuficiência renal com taxa de filtração glomerular abaixo de 30 ml/min/1,73m 2 ena insuficiência cardíaca com retenção de volume (SOCIEDADE BRASILEIRA DECARDIOLOGIA, 2007).3.3 FurosemidaA furosemida possui o nome químico de ácido 4-Cloro-N-furfuril-5-sulfamoilantranílico, com nome comercial Lasix ® , da marca Aventis, dentre outros(CAVALHEIRO et al., 2005; PINGARRÓN et al., 2003; ZATZ, 2002).Acredita-se que o sítio de ação da furosemida é na superfície do lúmen,possuindo assim uma alta variação na farmacocinética, devido a este ter diferentesfunções em vários órgãos, ou os tipos de pacientes tratados com o mesmo e asdiferentes reações de cada indivíduo a diferentes protocolos de estudo (ABOU-AUDAet al., 1998).Alguns estudos têm demonstrado que este fármaco possui atividadesantiinflamatórias, pois inibe a liberação de algumas citocinas e do fator de necrosetumoral (YUENGRIGUL, 1999; LAKHANI et al., 1997). Há relatos de que a inalaçãode furosemida alivia a sensação de dispnéia, devido a broncodilatação, quando testadoem pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (IWAMOTO et al., 2003 ONGet al., 2004).O monitoramento da furosemida em fluidos biológicos é importante não apenaspara a prática clínica e para o tratamento do paciente, mas também utilizada no campode controle de dopagem, como já foi abordado anteriormente (SATÍNSKÝ et al., 2005).12

3.4 Métodos CromatográficosA cromatografia é um método físico-químico de separação, fundamentada namigração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentesinterações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária (DEGANI,1998).Conforme a Figura 2 (COLLINS et al., 2002) há diferentes tipos de métodoscromatográficos de acordo com a forma física do equipamento, pela fase móvel a serempregada, pela de fase estacionária utilizada, além do modo de separação (LOUGH,1995).Figura 2. Diferentes métodos cromatográficosNeste trabalho se dará ênfase na Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE), como será abordado melhor no próximo tópico.3.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica deseparação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos maisutilizados para fins qualitativos e quantitativos (MAJORS, 1997). As razões para este13

crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para determinações quantitativascom boa sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamenteinstáveis, com destaque para a indústria farmacêutica, bem como as suas aplicações emdeterminações ambientais e em muitos outros campos da ciência, como o da medicina(COLLINS et al., 2002).Estima-se que mais de 90% dos laboratórios de análise espalhados pelo mundoutilizam pelo menos um método que aplica a modalidade de CLAE em fase reversa(FR) (MAJORS, 1997). Sistemas de CLAE-FR consistem de uma fase estacionária demenor polaridade e uma fase móvel de maior polaridade, enquanto a fase normal tem aspolaridades invertidas. Estas fases apresentam várias vantagens, tais como: uso de fasesmóveis menos tóxicas e de menor custo, como metanol e água; fases estacionáriasestáveis de muitos tipos diferentes; rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fasemóvel; facilidade de empregar eluição por gradiente; maior rapidez em análises e boareprodutibilidade dos tempos de retenção (COLLINS et al., 2002). Além disso, sãomuito aplicadas à separação de solutos de diferentes polaridades, massas molares efuncionalidades químicas em um fluxo líquido (SILVA, 2007).A fase móvel mais utilizada é a mistura de acetonitrila e água, sendo aacetonitrila, quando necessário, substituída por metanol ou tetrahidrofurano (SILVA,2007). O uso desses três solventes apenas deve-se à pequena quantidade de solventesorgânicos miscíveis com água, onde na fase reversa a retenção diminui para compostosmais hidrofílicos, assim quando um ácido ou uma base é ionizada estes se tornammenos hidrofóbicos e, conseqüentemente, a retenção é reduzida (BOTTOLI, 2008).Existem relatos de emprego de CLAE para a determinação de furosemida emurina, plasma, tecidos, fluido ascítico e formulações farmacêuticas (BARANOWSKA,2006).14

3.6 Preparação das AmostrasDiversas metodologias são usadas para preparação das amostras a seremutilizadas pelo método de CLAE, descritas por Baranowska et al. (2006), El Saharty(2003), Abou-Auda et al. (1998), conforme Tabela 1.Tabela 1. Condições para a preparação de amostraBaranowska et al. (2006) El Saharty (2003) Abou-Auda et al. (1998)VolumedeamostraSoluçãoparaajustede pH0,75 mL 1,0 mL 0,5 mLTampão fosfato pH 6,0 Tampão fosfato pH 6,0 Tampão fosfato pH 6,515

3.7 Análises CromatográficasNa maior parte dos relatos encontrados, a análise é realizada por CLAE,empregando diferentes fases móveis e estacionárias, conforme apresentado na Tabela 2.Tabela 2. Condições Cromatográficas Empregadas para a Análise de Furosemidaem Amostra de Plasma e UrinaBaranowska et al. (2006) El Saharty (2003) Abou-Auda et al. (1998)ColunaFase reversa LiChrospherC18 (125 × 3 mm, partículade5µm) com pré-colunaLiChrospher C18 (4 × 4mm, partícula de 5 µm)Nucleosil C18(250 x 4.6 mm, d.i.,partícula de 10 µm).Bondapak C 18 fase reversa(150 x 3,9 mm, d.i, partículade 10 µm) para plasma e C 18(15 x 3,9 mm, d.i., partículade 5 µm) para urinaDiferentes proporções deDihidrogenofosfato deDihidrogenofosfato deFase Móvelacetonitrila, metanol e ácidopotássio 20 mM pH 4,5 epotássio 10 mM pH 3,0,trifluoracético 0,05% emacetonitrila, (80:20, v/v),acetonitrila (62:38, v/v),águaajustado pH com H3PO4ajustado pH com H3PO4Modo deEluiçãoIsocrático Isocrático IsocráticoVazão(fluxo) FaseMóvel1,5 ml/min 3 ml/min 1,5 ml/minIntervaloDinâmicoComprimento0,05 – 18 µg/mL 0,1 – 200 µg/mL 0,05 – 2 µg/mL (plasma)0,5 – 50 µg/mL (urina)de Onda 234 nm 235 nm 225 nmTemperatura Ambiente Ambiente AmbienteVolumeInjetado20 µl 20 µl 20 µl16

4 METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO4.1 DelineamentoDesenvolvimento de método analítico.4.2 Estratégia de AçãoSerá revisada a bibliografia localizada através do sítio da internet Scielo(http://www.scielo.org/php/index.php),PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), Bireme (http://www.bireme.br/) utilizandocomo palavras-chave furosemida, diuréticos de alça, anti-hipertensivos, HPLC, dentreoutros. Também serão buscados em outras fontes bibliográficas tais como livros,monografias, dissertações e teses disponíveis em outros meios de publicação. Emseguida será feito todo o embasamento teórico para finalização do projeto e suaconseqüente apresentação.Após a apresentação do mesmo, será iniciado o processo de formulação dametodologia a ser empregada no teste no Laboratório de Análises Toxicológicas doCentro Universitário Feevale, seguindo alguns métodos já validados em outros estudos.Caso a metodologia empregada não atinja as expectativas, será realizada outra17

metodologia e assim sucessivamente até obtermos o teste que cumpra os critérios devalidação. De acordo com que vamos obtendo os resultados, será feita toda a tabulaçãodos dados para posterior redação do Trabalho de Conclusão de Curso, onde esta seráfeita também sob a forma de artigo científico para posterior publicação em revistaespecializada.4.3 Solventes e ReagentesA água purificada será obtida através de um sistema Elga Purelab Ultra (LaneEnd, Reino Unido). As soluções de trabalho de Furosemida serão preparadas em sorohumano e urina a partir das soluções comerciais de furosemida. A fase móvel serácomposta por tampão fosfato pH 4,5, obtido através da dissolução dedihidrogenofosfato de potássio em água purificada para obter uma solução de 20 mM. OpH será ajustado pela adição de ácido fosfórico (Merck, Darmstadt, Alemanha).4.4 Preparo das AmostrasSerá transferido 1 mL de plasma humano para um tubo de ensaio de 15 mL (16x 125 mm) contendo 100 µl de propranolol HCl em água destilada como padrão interno(250 µg e 100 µl), 1,5 mL de acetonitrila e 2 mL de acetato de etila. A mistura seráhomogeneizada em vórtex e após centrifugação, a fase orgânica será transferida para umtubo de vidro e evaporada a 45 ºC. O resíduo será dissolvido em 100 µl da fase móvel e20 µl desta solução será injetado no CLAE.Para obtenção da curva de calibração, concentrações de furosemida, emsoluções metanólicas, serão adicionadas a amostras de plasma e urina. As amostrascalibradoras serão tratadas da forma descrita acima.18

4.5 Preparação da Fase Móvel e Condições CromatográficasA fase móvel será preparada através da mistura de tampão fosfato 20 mM (pH4,5) e acetonitrila (80:20, v/v). Antes da utilização, a fase móvel será filtrada através demembrana de acetato de celulose com poros de 0,45 µm (Sartorius, Alemanha) edesgaseificada em banho ultra-sônico por 5 min. Será empregada uma coluna analíticaLicrospher C18 (250 x 4.0 mm, tamanho da partícula de 5 µm). O fluxo da fase móvelserá de 1,0 mL/min. O volume de injeção será de 20 µL. A detecção será realizada a235 nm para todos os compostos, com a aquisição de espectros de varredura entre 200 e380 nm.4.6 Curva de CalibraçãoAs curvas de calibração serão obtidas através da análise de amostras de sorofortificadas com furosemida na faixa de 0,1 a 200 µg/mL. Para a construção da curva decalibração, será utilizada a média de seis determinações de cada calibrador. Esta seráconstruída através do estabelecimento da correlação entre a área dos picos referentes acada analito (y) e as concentrações adicionadas e será avaliada com base no coeficientede determinação (r²).4.7 Ensaios de Precisão e ExatidãoA precisão e a exatidão do método serão avaliadas através de análises em trêsníveis de concentração para cada analito, realizadas em triplicata e repetidas em 5 diasdiferentes. Os calibradores utilizados serão preparados em soro isento dos compostosavaliados. A precisão intra-ensaios e a precisão inter-ensaios foram calculadas pelaanálise de variância (ANOVA), usando dia como variável agrupadora. A exatidão foicalculada como percentagem média obtida do valor teórico adicionado na amostra.19

4.8 EquipamentoSerá utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Shimadzu Class VP(Kyoto, Japão), composto de um sistema quaternário de bombas LC-10AT, módulocontrolador SCL-10A, desgaseificador DGV-14A, forno de coluna CTO-10AS, autoinjetorSIL-10AF e detector de arranjo de diodos SPD-M10A. A coluna utilizada seráLiChrospher® RP 18ec (250 X 4 mm, d.i. 5µm) da Merck (Darmstadt, Alemanha). Osistema de cromatografia será controlado pelo programa Class VP 6.13 SP2, daShimadzu.20

5 RESULTADOS E IMPACTOS ESPERADOSEspera-se padronizar uma metodologia adequada para a determinação deconcentrações variadas de furosemida em plasma e urina de diferentes indivíduos,possibilitando assim, auxiliar na terapêutica dos mesmos, para que haja uma avaliaçãode dose/resposta mais específica.Outro impacto esperado é a possibilidade de desenvolvimento ou continuaçãode outros projetos que envolvam a determinação deste fármaco no Laboratório deAnálises Toxicológicas do Centro Universitário Feevale.21

6 RISCOS E DIFICULDADESPor ser uma validação de teste, este tem por apresentar como um dos principaisriscos a falta de tempo na obtenção de um teste preciso e exato, já que este necessitaráde testes com diferentes protocolos para a obtenção dos mesmos, que dificulta adeterminação do fármaco.Devido ao aparelho de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ser usado pordiversos projetos durante o andamento dos testes, este poderá apresentar algum defeito,impossibilitando a realização dos mesmos.Este pode apresentar dificuldades quanto às diluições adequadas para oprocessamento das amostras, no que se refere a sua fase móvel, necessitando dediferentes concentrações para cada tipo de procedimento.Caso ocorra algum problema que inviabilize o término deste trabalho, o mesmoserá projetado apenas com amostra de plasma, e persistindo as dificuldades, será feitosob a forma de revisão bibliográfica.22

6 CRONOGRAMA DE ATIVIDADESJan/Fev/Mar/Abr/Mai/Jun/Jul/Ago/Set/Out/Nov/Dez/RevisãoBibliográficaEntrega do Pré-ProjetoEntrega doProjetoApresentação doProjetoFormulação edesenvolvimentodos testes08 08 08 08 08 08 08 08 08 08 08 08X X X X X X X X X X X XXXXX X X XAnálise de dados X X XRedação ArtigoFinalApresentação doTrabalho FinalXXX23

7 ORÇAMENTO E FORMAS DE FINANCIAMENTOO material necessário à realização deste projeto de pesquisa encontra-sedescrito na Tabela 3.Tabela 3: Discriminação do material de pesquisa.MATERIAL QUANTIDADE PREÇO UNITÁRIO(R$)PREÇO MATERIAL(R$)Solvente para 1 Litro 10,00/L 10,00extraçãoSolução de 4 Litros 10,00/L 40,00furosemidaSolventes para 2 Litros 20,00/L 40,00cromatografiaTubos de ensaio 10 Unid. 1,00/Unid. 10,00Ponteiras 100 Unid. 0,01/Unid. 1,00Microtubos de 100 Unid. 0,01/Unid. 1,00polipropilenoMaterial de- - 200,00expediente (folhas deofício, cartucho paraimpressão,fotocópias)Transporte- - 150,00(combustível)TOTAL 452,00* Os custos do projeto serão de responsabilidade do acadêmico.24

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JORGE ALESSANDRO DEOTTIDESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DEFUROSEMIDA EM PLASMA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTAEFICIÊNCIACentro Universitário FeevaleInstituto de Ciências da SaúdeCurso de BiomedicinaTrabalho de Conclusão de Curso: ArtigoProfessor Orientador: Prof. Dr. Rafael LindenNovo Hamburgo, Novembro de 200831

DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO PARADETERMINAÇÃO DE FUROSEMIDA EM PLASMAPOR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTAEFICIÊNCIAJorge Alessandro Deotti, Marina Venzon Antunes, Rafael Linden*Laboratório de Análises Toxicológicas, Instituto de Ciências da Saúde, CentroUniversitário Feevale* Laboratório de Análises Toxicológicas, Instituto de Ciências da Saúde, CentroUniversitário FeevaleRodovia RS 239, n. 2755, 93352-000 – Novo Hamburgo – RS, BrasilEmail: rafael.linden@feevale.br32

RESUMOFurosemida é um importante fármaco diurético, usado no tratamento dediversas patologias e condições fisiológicas. Um prático, seletivo e eficiente método porcromatografia líquida de alta eficiência por fase reversa (CLAE-FR) foi desenvolvidopara a determinação de furosemida em plasma humano. O fármaco foi eluído através deuma coluna Nucleosil ® C8 com uma fase móvel composta de tampão fosfato pH 2,3(50mM) e acetonitrila (63:37, v/v) e monitorados a 235 nm. Este método apresentouadequada linearidade (r 2 > 0,99), utilizando calibradores nas concentrações 1 - 200µg/mL. A precisão intra-dias e inter-dias variaram de 5,11 a 8,82% e 3,31 a 9,62%,respectivamente, e a exatidão variou de 94 a 114%. Este método pode ser utilizado emestudos farmacocinéticos bem como ensaios de bioequivalência com furosemida.UNITERMOS: Cromatografia líquida de alta eficiência, furosemida, plasma.33

ABSTRACTDevelopment of a method for determination in plasma of furosemide by highperformance liquid chromatographyFurosemide is an important diuretic drug, used on treatment of various diseasesand physiological conditions. A practical, selective and efficient reversed-phase highperformanceliquid chromatography (RP-HPLC) method was developed for thedetermination of furosemide in human plasma. The drug was eluted through aNucleosil ® C8 column with a mobile phase composed of phosphate buffer pH 2.3 (50mM) and acetonitrile (63:37, v/v) and monitored at 235 nm. This method showedadequate linearity (r 2 > 0.99) using calibrators at concentrations 1 - 200 µg/mL. Theprecision intra and inter-day ranged from 5.11 to 8.82% and 3.31 to 9.62%,respectively, and accuracy ranged from 94 to 114%. The method can be used either inpharmacokinetic studies as well as in bioequivalence assays of furosemide.UNITERMS: High performance liquid chromatography, furosemide, plasma.34

INTRODUÇÃOPor definição, os diuréticos são fármacos que aumentam a taxa do fluxourinário (Zatz, 2002; Riella, 2003; Padilla et al., 2007), onde a furosemida é um potentediurético de alça com estrutura química mostrada na Figura 1 (Walshe, Kelly, Smyth,1996; El-Saharty, 2003; Dias, Neto, Martins, 2004; Cavalheiro et al., 2005; Margalho etal., 2005). Administrada tanto por via oral quanto intravenosa, com farmacocinéticabem documentada em indivíduos saudáveis (Wenk et al., 2006).FIGURA 1. Estrutura química da furosemidaEste fármaco apresenta uma rápida absorção pelo trato gastrointestinal,chegando a ter uma biodisponibilidade oral de aproximadamente 65% (Abou-Auda etal., 1998; Gilman, Hardman, Limbird, 2003; Margalho et al., 2005), embora possaocorrer uma variação de 10-100% (Riella, 2003).Freqüentemente usada no tratamento de diversas patologias e condiçõesfisiológicas, a furosemida é utilizada basicamente na hipertensão (El-Saharty, 2003;Buffin-Meyer et al., 2004; Moreira, Moreau, 2005; Cavalheiro et al., 2005; Margalho etal., 2005; Wenk et al., 2006), insuficiência renal crônica ou aguda (El-Saharty, 2003;35

Dias, Neto, Martins, 2004; Wenk et al., 2006; Ho, Sheridan, 2006; Bagshaw et al.,2007), alguns tipos de edemas (El-Saharty, 2003; Dias, Neto, Martins, 2004; Buffin-Meyer et al., 2004; Cavalheiro et al., 2005; Margalho et al., 2005; Moreira, Moreau,2005; Wenk et al., 2006; Norris et al., 2007), cirrose (El-Saharty, 2003, Margalho et al.,2005; Wenk et al., 2006), insuficiência cardíaca congestiva (El-Saharty, 2003;Margalho et al., 2005), recuperações em cirurgias cardíacas (Norris et al., 2007) esituações de hipercalcemia, onde há necessidade de um aumento da excreção urinária deCa + , causada por patologias específicas (Farias, 2005).A ação diurética da furosemida se dá na parte ascendente da alça de Henle,inibindo o co-transportador Na + -K + -2Cl - (Mills et al., 1997; Gilman, Hardman,Limbird, 2003; Buffin-Meyer et al., 2004; Abbott, Kovacic, 2008). Com esta inibiçãoocorre primeiramente uma perda de Na + , principalmente pelos túbulos distais e ductoscoletores dos rins (Buffin-Meyer et al., 2004; Norris et al., 2007). Esta perda de Na +continua até que o organismo se adapte e diminua a excreção deste eletrólito emparticular (Buffin-Meyer et al., 2004). Um dos efeitos adversos observados notratamento a longo prazo com esses fármacos é a perda excessiva de K + , que em algunscasos pode causar hipocalemia (Buffin-Meyer et al., 2004; Norris et al., 2007). Estaperda maciça de K + se deve ao fato de a alta concentração de Na + no lúmen do ductocoletor aumentar a secreção de K + para a urina (Buffin-Meyer et al., 2004).Os fármacos deste tipo têm sido utilizados em competições esportivas a fim deproporcionar uma maior perda de peso através de uma diurese aumentada, por estemotivo, outros competidores passaram a utilizar este fármaco com o intuito de obteruma menor concentração de substâncias proibidas pelo World Anti-Doping Agency36

(WADA) na urina dificultando ou até mesmo impossibilitando a detecção destas(Carvalho et al., 2003; Moreira, Moreau, 2005; Wenk et al., 2006).A determinação de furosemida em plasma e urina é empregada em estudosfarmacocinéticos com pacientes, por exemplo, no tratamento com combinaçõesmúltiplas de fármacos, principalmente as que são excretadas pela via renal, além deestudos de bioequivalência (Wenk et al., 2006). Vários métodos de CromatografiaLíquida de Alta Eficiência (CLAE) têm sido desenvolvidos para a determinação defurosemida em fluidos biológicos (Mills et al., 1997; Wenk et al., 2006), mas tambémno campo do controle de dopagem (Satínský et al., 2005).A CLAE é o método de escolha para análise de diuréticos devido ao custo daanálise ser inferior e a facilidade operacional, além da limitada disponibilidade demétodos alternativos como a técnica de cromatografia gasosa associada com detecçãoespectrométrica de massa (CG-EM) (Moreira, Moreau, 2005). Para estes compostos, ouso de CG-EM é limitado devido à baixa volatilidade dos compostos e a necessidade deuma etapa adicional de derivatização (Abou Auda et al., 1998; Moreira, Moreau, 2005;Gomez et al., 2005).O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método para determinação defurosemida em amostras de plasma pelo método de CLAE, empregando um detector dearranjo de diodos (DAD), além da determinação das condições para o preparo dasamostras, condições analíticas por CLAE, obtenção de uma curva de calibração,testando a precisão e exatidão do mesmo.37

MATERIAIS E MÉTODOSReagentes e soluçõesCloridrato de furosemida foi obtido da Henrifarma (São Paulo, Brasil).Cloridrato de propranolol foi proveniente da Purifarma (São Paulo, Brasil). Acetonitrilagrau HPLC e ácido fosfórico foram da Merck (Darmstadt, Alemanha). Fosfato depotássio monobásico foi adquirido pela Synth (Diadema, Brasil). Ácido clorídrico foi daNuclear (São Paulo, Brasil). Metanol foi obtido pela JT Baker (Cidade do México,México). Éter etílico foi fornecido pela Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg, EUA).Água purificada foi obtida através de um sistema Elga Purelab Ultra da Elga Labwater(Lane End, Reino Unido). A preparação do tampão fosfato foi feita através dadissolução de 6,66g de fosfato de potássio monobásico (KH 2 PO 4 ) em 900 mL de águapurificada, seguida da adição de 4,8g de ácido ortofosfórico 85% (v/v). O volume foicompletado para a adição de 1000 mL com água purificada e o pH (2,3) foi ajustadocom adição de ácido fosfórico 0,1 M. A preparação da solução-mãe de padrão interno(PI) foi feita através da dissolução de 10 mg de cloridrato de propranolol em 10 mL demetanol. A solução de trabalho de padrão interno (300 µg/mL) foi obtida através dadiluição da solução-mãe com metanol. A preparação da solução mãe de furosemida foirealizada através da dissolução de 111,035 mg de cloridrato de furosemida em 10 mLde metanol, obtendo-se uma concentração de 10 mg/mL de furosemida, sendo feitasdiluições para se obter as concentrações de 1, 5, 10, 50, 100 e 200 µg/mL.38

Análise cromatográficaFoi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência Shimadzu Class VP(Kyoto, Japão), composto de um sistema quaternário de bombas LC-10AT, módulocontrolador SCL-10A, desgaseificador DGV-14A, forno de coluna CTO-10AS, autoinjetorSIL-10AF e detector de arranjo de diodos SPD-M10A. A coluna utilizada foiNucleosil ® RP 8ec (250 X 4 mm, d.p. 5 µm) da Macherey Nagel (Düren, Alemanha). Osistema de cromatografia foi controlado pelo programa Class VP 6.13 SP2, daShimadzu.Preparo da fase móvel e condições cromatográficasA fase móvel foi preparada através da mistura de tampão fosfato pH 2,3(50mM) e acetonitrila (63:37, v/v). Antes da utilização, a mesma foi filtrada através demembrana de acetato de celulose com poros de 0,45 µm (Sartorius, Alemanha) edesgaseificada em banho ultra-sônico por 5 min. O fluxo da fase móvel foi de 1,0mL/min. A coluna foi mantida a 30 ºC durante a análise. O volume de injeção foi de 50µl. A detecção foi realizada a 235 nm, com aquisição de espectros de varredura entre200 e 380 nm.39

Curva de calibraçãoPara a construção da curva de calibração, foi utilizada a média de seisdeterminações de cada calibrador A curva de calibração foi construída através doestabelecimento da correlação entre a razão das áreas dos picos referentes aos analitos edo padrão interno (y) e as concentrações adicionadas (x). A curva foi avaliada com baseno coeficiente de determinação (r). Foram utilizados calibradores nas concentrações de1, 5, 10, 50, 100 e 200 µg/mL para furosemida.Preparação da amostraInicialmente, a uma alíquota de 500 µL de plasma, branco ou calibradores foiadicionada de 50 µL de padrão interno (300 µg/mL de propranolol em Metanol), 100µL de HCl 0,1 M e 1000 µL de éter etílico, em microtubos de polipropileno de 2 mL.Esta mistura foi homogeneizada em agitador vórtex por 30 s e posteriormentecentrifugada a 12.000 RPM por 10 min, à temperatura de 4 ºC. A seguir, 900 µL dossobrenadantes foram transferidos para vials, para posterior evaporação por banho seco a45 ºC. Em seguida, 100 µL de fase móvel foram colocados nos mesmos, com mais umaetapa de homogeneização em agitador de vórtex por 15 s e centrifugação a 1.500 RPMpor 15 min. Uma alíquota de 50 µL da solução resultante foi injetada no CLAE-DAD.40

Ensaios de precisão e exatidãoA precisão e a exatidão do método foram obtidas através de análises em trêsníveis de concentrações conhecidas de furosemida em amostra de plasma para cadaanalito, realizadas em triplicata e repetidas em 3 dias diferentes. Os calibradoresutilizados foram preparados em plasma isento dos compostos avaliados. A precisãointra-ensaios e a precisão inter-ensaios foram calculadas pela análise de variância(ANOVA), usando dia como variável agrupadora. A exatidão foi calculada comopercentagem média obtida do valor teórico adicionado na amostra. As concentraçõesutilizadas no estudo de precisão e exatidão foram 4, 40 e 160 µg/mL de furosemida.Limites de quantificaçãoOs limites e quantificação de cada analito foram determinados como sendo ovalor do menor calibrador com coeficiente de variação inferior a 20%, baseado segundoShah et al.. (2000)41

RESULTADOS E DISCUSSÃOSeparação e detecção cromatográficaCom as condições cromatográficas utilizadas, demonstramos em amostra deplasma isento de furosemida, que não houve a presença de picos interferentes nocromatógrafo, como podemos notar na Figura 2. O padrão interno (propranolol) e afurosemida foram claramente separados, sem nenhum comprometimento dos picos.Conforme apresentado na Figura 3, o tempo de retenção do padrão interno foi de 4,4minutos e o tempo da furosemida foi de 7,1 minutos, com adequada resolução dosanalitos e com tempo total da análise cromatográfica de 10 min. Gomez et al. (2005)obtiveram como tempo de retenção 3,7 minutos para padrão interno (propranolol) e 7,9minutos para furosemida e tempo total de análise igual ao nosso trabalho. Já Wenk et al.(2006) conseguiram 2,1 minutos para furosemida e 3,7 para o padrão interno(naproxeno), com um fluxo de 3,5 mL/min, porém o tamanho da coluna utilizada nestetrabalho foi de 100 mm, menor do que a nossa utilizada, aumentando a pressão internada mesma, diminuindo os tempos de retenção dos analitos. Em nosso método,utilizamos um fluxo de 1,0 mL/min, obtendo pressões operacionais mais baixas e porconseqüência evitando um maior desgaste do equipamento.Como preconizado em nosso trabalho, para isolar a furosemida de outrosinterferentes o método de extração utilizado foi na forma líquido-líquido, sendo este o42

mais comum e o que apresenta melhor eficácia (Abou Auda et al., 1998; Abdel-Hamid,2000; Moreira , Moreau, 2005; Gomez et al., 2005; David et al., 2006). Em nossotrabalho utilizamos como solvente de extração éter etílico, mas há relatos do uso deacetato de etila, onde estes são mais empregados em procedimentos, como acidificação,etapas de desproteinização e adições de padrões internos (Jankowski, Skorek-Jankowska, Lamparczyk, 1997; Gomez et al., 2005; David et al., 2006 ). El Saharty(2003) utilizou como preparação das amostras 1 mL de plasma e 2 mL de acetato deetila como solvente de extração. Abou Auda et al. (1998) utilizaram 0,5 mL de plasma e3 mL éter etílico, enquanto que Wenk et al. (2006) utilizaram 0,5 mL de plasma e 5 mLde éter etílico. No presente trabalho, empregamos apenas 1 mL de éter etílico para 0,5mL de plasma, diminuindo o gasto de solvente e conseqüentemente reduzindo o custoda análise, minimizando a produção de resíduos, com resultados semelhantes aosdemais trabalhos citados.mAU0 200 400 6006004002000mAU0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10MinutesFIGURA 2. Análise cromatográfica obtida com monitoramento em 235 nm de plasmaisento de furosemida43

mAU0 200 400 600126004002000mAU0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10MinutesFIGURA 3. Separação cromatográfica obtida com monitoramento em 235 nm deplasma contendo PI (1) e furosemida (2) na concentração de 50 µg/mL.Curva de calibração e validaçãoA curva de calibração em plasma adicionado com concentrações de 1, 5, 10,50, 100 e 200 µg/mL de furosemida está representada na Figura 4. A curva expressapela função y = 0,0116x – 0,0025, onde x é representado pela concentração adicionada aamostra e y como sendo a área dos picos do padrão interno e da furosemida, apresentouexcelente linearidade, com coeficiente de determinação (r 2 ) de 0,9994, estecorroborando com outros trabalhos, como de Abou Auda et al. (1998), El Saharty(2003), Pingarrón et al. (2003), Cavalheiro et al. (2005) Wenk et al. (2006) onde estesapresentaram r 2 de 0,9980 a 0,9998. A preparação das amostras foi simples, compostade poucas etapas, e rápida, com um tempo total de preparação para posterior análise da44

amostra de no máximo 30 min, otimizando assim uma rotina de laboratório que possuauma grande quantidade de amostras a serem analisadas. Os parâmetros precisão intradias,precisão inter-dias e exatidão, avaliados nas concentrações 4, 40, 160 µg/mL emtrês dias diferentes, foram calculados pelo método de ANOVA, sendo este métodopreciso e exato, com precisão intra-dias de 5,11 a 8,82%, precisão inter-dias de 3,31 a9,62% e exatidão de 94 a 114%, como podemos visualizar na Tabela I, ficando deacordo com relatos de outros autores (Abou Auda et al., 1998; Valizadeh et al., 2006).Segundo Shah et al. (2000), estes resultados estão de acordo com os valoresdeterminados para validação de métodos bioanalíticos, que determina como aceitávelvariações de até 20 % no coeficiente de variação. El Saharty (2003) teve comoresultados de precisão uma variação de 1,77 a 2,49% e exatidão de 99,5 a 100,9%enquanto que Wenk et al. (2006) encontraram uma variação na precisão de 2,4 a 7,0% eexatidão de 94,6 a 109%, resultado este similar ao desenvolvido em nosso trabalho.2,5Área Furosemida/Área PI21,510,500 50 100 150 200 250Concentração (µg/mL)FIGURA 4. Curva de calibração da furosemida45

TABELA I - Parâmetros de validação do método para a determinação de Furosemidaem plasmaConcentraçãoPrecisão intra-diasPrecisão inter-diasExatidão(µg/mL)(C.V. %)(C.V. %)(%)160,0 7,29 9,07 9740,0 8,82 9,62 944,0 5,11 3,31 114O comprimento de onda para monitoramento dos cromatogramas utilizadoneste trabalho, 235 nm, foi o de maior absortividade da furosemida, com menorinterferência de outros compostos e também foi aplicado em diversos trabalhosanteriores (Abou Auda et al., 1998; El Saharty, 2003; Cavalheiro et al., 2005; Wenk etal., 2006).Os parâmetros de precisão, exatidão, linearidade, especificidade e sensibilidadeobtidos neste trabalho possibilitam a sua utilização nas rotinas laboratoriais, devido aocusto baixo, rapidez pelo qual é realizada a análise e o emprego de eluição isocrática, aqual permite o emprego de sistemas de CLAE mais simples, além da recirculação dafase móvel, o que contribui para a redução dos custos analíticos.46

CONCLUSÕESFoi desenvolvido e validado um método simples para determinação defurosemida em amostras de plasma por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE), utilizando coluna de fase reversa e eluição isocrática, tornando-o adequadopara sua utilização em estudos farmacocinéticos além de ensaios de bioequivalênciaenvolvendo o fármaco em questão.47

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ANEXONormas da revista escolhida (Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas)Instruções para apresentação dos trabalhos1. Estrutura dos originais1.1.Cabeçalho: constituído por:- Título do trabalho: deve ser breve e indicativo da exata finalidade do trabalho.- Autor(es) por extenso, indicando a(s) instituição(ões) a(s) qual(is) pertence(m)mediante números. O autor para correspondência deve ser identificado com asterisco,fornecendo o endereço completo, incluindo o eletrônico. Estas informações devem constar emnotas de rodapé.1.2 Resumo (em português): deve apresentar a condensação do conteúdo, expondometodologia, resultados e conclusões, não excedendo 200 palavras. Os membros da Comissãopoderão auxiliar autores que não são fluentes em português.1.3 Unitermos: devem representar o conteúdo do artigo, evitando-se os de naturezagenérica e observando o limite máximo de 6(seis) unitermos.1.4 Introdução: deve estabelecer com clareza o objetivo do trabalho e sua relaçãocom outros trabalhos no mesmo campo. Extensas revisões de literatura devem ser substituídaspor referências aos trabalhos bibliográficos mais recentes, onde tais revisões tenham sidoapresentadas.52

1.5 Material e Métodos: a descrição dos métodos usados deve ser breve, porémsuficientemente clara para possibilitar a perfeita compreensão e repetição do trabalho.Processos e Técnicas já publicados, a menos que tenham sido extensamente modificados,devem ser apenas referidos por citação. Estudos em humanos devem fazer referência àaprovação do Comitê de Ética correspondente.1.6 Resultados e Discussão: deverão ser acompanhados de tabelas e materialilustrativo adequado, devendo se restringir ao significado dos dados obtidos e resultadosalcançados. É facultativa a apresentação desses itens em separado.1.7 Conclusões: Quando pertinentes, devem ser fundamentadas no texto.português.1.8 Resumo em inglês (ABSTRACT): deve acompanhar o conteúdo do resumo em1.9 Unitermos em inglês: devem acompanhar os unitermos em português.1.10 Agradecimentos: devem constar de parágrafos, à parte, antecedendo asreferências bibliográficas.1.11 Referências: devem ser organizadas de acordo com as normas da ABNT NBR-6023, ordenadas alfabeticamente no fim do artigo incluindo os nomes de todos os autores.A exatidão das referências é de responsabilidade dos autores.2. Apresentação dos originaisOs trabalhos devem ser apresentados em lauda padrão (de 30 a 36 linhas com espaçoduplo). Utilizar Programa Word for Windows. Os autores devem encaminhar o trabalho53

acompanhado de carta assinada pelo autor de correspondência, que se responsabilizará pelatransferência dos direitos à RBCF.3. Infomações adicionais3.1 Citação bibliográfica: As citações bibliográficas devem ser apresentadas notexto pelo(s) nome(s) do(s) autor(es), com apenas a inicial em maiúsculo e seguida do ano depublicação. No caso de haver mais de três autores, citar o primeiro e acrescentar a expressãoet al. (em itálico)3.2 Ilustrações: As ilustrações (gráficos, tabelas, fórmulas químicas, equações,mapas, figuras, fotografias, etc) devem ser incluídas no texto, o mais próximo possível dasrespectivas citações. Mapas, figuras e fotografias devem ser, também, apresentados emarquivos separados e reproduzidas em alta resolução (800 dpi/bitmap para traços) comextensão tif. e/ou bmp. No caso de não ser possível a entrega do arquivo eletrônico dasfiguras, os originais devem ser enviados em papel vegetal ou impressora a laser.Ilustrações coloridas somente serão publicadas mediante pagamento pelos autores.As tabelas devem ser numeradas consecutivamente em algarismos romanos e asfiguras em algarismos arábicos, seguidos do título. As palavras TABELA e FIGURA devemaparecer em maiúsculas na apresentação no texto e na citação com apenas a inicial emmaiúsculo.3.3 Nomenclatura: pesos, medidas, nomes de plantas, animais e substânciasquímicas devem estar de acordo com as regras internacionais de nomenclatura. A grafia dosnomes de fármacos deve seguir, no caso de artigos nacionais, as Denominações Comuns54

Brasileiras (DCB) em vigor, podendo ser mencionados uma vez (entre parênteses, com inicialmaiúscula) os registrados.55