1. Raportul Stiintific si Tehnic (RST) in extenso al proiectului cu titlul ...

1. Raportul Stiintific si Tehnic (RST) in extenso al proiectului cu titlul
CORELATII CLINICE, ANATOMOPATOLOGICE SI MOLECULARE IN
VEDEREA STABILIRII UNOR MODELE MATEMATICE UTILE IN PREDICTIA
EVOLUTIEI CANCERULUI DE PROSTATA
(faza de executie 1)
Se va prezenta conform urmatoarei structuri:
o CUPRINS;
o OBIECTIVELE GENERALE;
o OBIECTIVELE ETAPEI DE EXECUTIE;
o REZUMATUL ETAPEI (MAXIM 2 PAGINI);
o DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA, CU PUNEREA IN EVIDENTA A
REZULTATELOR ETAPEI SI GRADUL DE REALIZARE A OBIECTIVELOR; (SE
VOR INDICA REZULTATELE)
o ANEXE (DOCUMENTATIE DE EXECUTIE, CAIET DE SARCINI, TEME DE
PROIECTARE, BULETINE DE INCERCARI, ATESTARI, CERTIFICARI, ETC. –
DUPA CAZ);
o CONCLUZII(SE PREZINTA PUNCTUAL)
o BIBLIOGRAFIE;
2. Indicatorii de rezultat generali si specifici pentru etapa raportata
3. Procesele verbale de avizare si receptie a lucrarilor

CORELATII CLINICE, ANATOMOPATOLOGICE SI MOLECULARE IN
VEDEREA STABILIRII UNOR MODELE MATEMATICE UTILE IN PREDICTIA
EVOLUTIEI CANCERULUI DE PROSTATA
RAPORTUL STIINTIFIC SI TEHNIC (RST) AL
CUPRINS;
ETAPEI 1 DE EXECUTIE
o obiectivele generale;
o obiectivele etapei de executie;
o rezumatul etapei (maxim 2 pagini);
o descrierea stiintifica si tehnica, cu punerea in evidenta a
rezultatelor etapei si gradul de realizare a obiectivelor; (se vor
indica rezultatele)
o anexe (documentatie de executie, caiet de sarcini, teme de
proiectare, buletine de incercari, atestari, certificari, etc. – dupa
caz);
o concluzii(se prezinta punctual)
o bibliografie;
Cuvinte cheie: cancer de prostata (CaP), markeri de pronostic, biologie
moleculara (BM), consimtamant informat, comisie de etica, antigen specific de
prostata (PSA).

1. OBIECTIVE GENERALE
Dupa cancerul de plaman, cancerul de prostata (CaP) este cea de-a sasea cauza
de cancer in lume (cazuri noi) si a treia ca importanta in patologia sexului masculin.
Acest tip de cancer ramane o provocare pentru sanatatea publica in ciuda
progresului inregistrat in detectie si terapie. Inovatiile si aplicarea biotehnologiei au
permis investigarea proceselor biologice in efortul studierii patogenezei la nivel
molecular.
Numeroase studii au fost dedicate identificarii markerilor de prognostic care
diferentiaza formele indolente de cele agresive in cancerul de prostata. In contrast,
mult mai putine studii s-au concentrat pe intelegerea mecanismelor moleculare care
stau la baza dezvoltarii prostatei normale si initierii si progresiei cancerului la acest
nivel.
Scopul acestui proiect il reprezinta identificarea factorilor de risc genetici in cancerul
de prostata, propunand o viziune integrativa asupra patogenezei si evolutiei naturale
a acestei malignitati, in afara oricarui tratament. Se propune stabilirea unor modele
matematice bazate pe rezultatele evaluarii clinice, anatomopatologice si
moleculare, raportate la predictia evolutiei si susceptibilitatea familiala in cancerul
de prostata prin: analiza IHC a TGF, p53, EGFR, VEGF, AMACR; anomaliile
cromozomiale, BRCA1, BRCA2 prin FISH, MLPA, LOH, MSI, si secventiere. Se urmareste
initierea unui veritabil trial pentru investigarea cancerului de prostata, precum si
stabilirea cerintelor etice, legale si a reglementarilor indispensabile cercetarii
medicale care implica subiecti umani, respectand cerintele internationale. Subliniem
faptul ca investigatiile precum si modelele matematice ce se vor stabili vizeaza
tumora maligna a prostatei depistata si netratata.
Identificarea markerilor moleculari proteici utili diagnosticului si prognosticului si
analizati prin metoda imunohistochimica (TGF, p53, EGFR, VEGF, p63, AMACR) ar
putea in viitor sa inlocuiasca testul clasic PSA. Investigarea markerilor genetici
informativi (BRCA1, BRCA2, P53, EGFR) alaturi de anomaliile cromozomiale (Ch 8p)
prin utilizarea LOH, MSI, hibridizare in situ, vor putea intra in alcatuirea unui panel de
investigatie folositor nu numai prognozarii progresiei si recidivelor, cat si pentru
evidentierea susceptibilitatii familiale.
Proiectul nostru isi propune de asemeni interpretarea biostatistica a rezultatelor
obtinute prin aplicarea de nomograme si modele matematice specifice care sa
permita prognozare la nivel individual precum si stabilirea unui algoritm de evaluare
a stadiului si prognosticului.
Bazandu-ne pe experienta celor mai importante clinici de urologie din Bucuresti (P1,
P2 si P3), pe expertiza in diagnostic molecular a partenerilor din sfera cercetarii
biologice (CO) si pe aplicabilitatea modelelor statistice si simularilor (P4 si P5),
proiectul propune, nu in ultimul rand, stabilirea unei baze de date si un pachet de
lucru util medicilor practicieni in abordarea cancerului de prostata.
Propunerea noastra de proiect se incadreaza in obiectivele programului 4, directia
de cercetare sanatate (4.1). Misiunea proiectului este de integrare a metodelor de
investigatie si interventionale bazate pe medicina moleculara si celulara, asociate
cancerului de prostata, in scopul de a facilita aplicarea in Romania de strategii
profilactice si terapeutice moderne pentru aceasta afectiune a carei incidenta si
prevalenta este in crestere.
Ne propunem formularea si verificarea de ipoteze precum si elaborarea unor teorii
privind carcinogeneza in cancerul de prostata. Urmarim aplicarea tehnologiilor de
laborator moderne pe materialele furnizate de cele mai importante clinici de
urologie din Bucuresti. Consideram ca fiind un obiectiv important analiza statistica si

simulare a modelelor, prin combinarea celor mai importante rezultate furnizate de
laboratoare de anatomie patologica si biologie moleculara. Formularea unor
algoritmuri si nomograme de prognozare prin utilizarea unor programe
comprehensive pentru analizarea datelor, consideram ca reprezinta o noutate
internationala prin impactul pe care il pot avea rezultatele obtinute pentru clinicile
de urologie.Nu in ultimul rand, identificarea factorilor de risc ai susceptibilitatii
familiale in aceasta afectiune maligna, va ajuta in abordarea maladiei de catre
medicii practicieni.
Scopul urmarit este utilizarea datelor clinice furnizate de fisele medicale, testele de
laborator clinic, diagnosticul histopatologic, imunohistochimic si rezultatele furnizate
de metodele de biologie moleculara, pentru construirea unor modele matematice
de apreciere a prognosticului si evolutiei posibile in cancerul de prostata in afara
oricarui tratament. Toate activitatile privind cercetarea medicala avand subiecti
umani va fi bine documentata privind cerintele etice, legale si de reglementare
respectand normele internationale. Aplicarea metodelor de biologie moleculara
(dezechilibre alelice, instabilitatea microsatelitilor, MLPA, hibridizare in situ) va
identifica anomaliile celor mai importante gene implicate in cancerul de prostata,
sporadic si ereditar. Coroborarea datelor furnizate de metodele utilizate prin metode
statistice si de simulare specifice, va ajuta la evidentierea celor mai importanti
parametri privind predictia recidivelor, metastazelor si susceptibilitatea familiala.
2. OBIECTIVELE ETAPEI DE EXECUTIE
Obiectivele specifice acestei etape conform planului de realizare sunt:
Activitate I.1 Stabilirea protocoalelor de consimtatmant informat pentru subiecti
umani (CO, P1, P2, P3);
Activitate I.2 Stabilirea algoritmului de triere a pacientilor cu CaP (CO, P1, P2, P3);
Activitate I.3 Determinarea protocolului unic chirurgical (CO, P1, P2, P3);
Activitate I.4 Optimizarea procedurilor de prelucrare histopatologica a tesuturilor
prelevate (CO, P1, P2, P3;
Activitate I.5 Optimizarea protocolului in investigarea imunohistochimica si stabilirea
panelului de anticorpi (CO, P1, P2, P3);
Activitate I.6 Elaborarea metodologiei privind investigarea modificarilor genice cu rol
prognostic, metastatic si in susceptibilitatea familiala a CaP (CO, P1, P2, P3);
Activitate I.7 Stabilirea protocolului pentru prelevarea materialelor proaspete si
pentru congelarea acestora (CO, P1, P2, P3);
Activitate I.8 Fundamentarea modalitatilor de analiza statistica medicala si de
diseminare a rezultatelor (CO, P4, P5,);
3. REZUMATUL ETAPEI
In aceasta etapa ne-am propus stabilirea unui algoritm de lucru coerent, legal si
agreat de toti factorii implicati in buna desfasurare a acestui proiect: CO, P1, P2, P3,
P4, P5, pacientii depistati cu tumora maligna a prostatei precum si rudele lor.
In prima etapa a studiului ne propunem elaborarea tuturor documentelor medicale
(consimtamantul informat al pacientului, istoricul medical si cel familial), criterii de
selectie clinica a pacientilor, stabilirea protocoalelor de investigare histopatologica,

imunohistochimica, moleculara, de recoltare a materialelor biologice, a pacientilor si
rudelor. Analiza biostatistica a parametrilor considerati utili prin utilizarea unor
programe performante (SPSS 15.0 si modelare matematica in COMSOL) va oferi o
baza de date solida pentru crearea unei metodologii de abord a cancerelor de
prostata si derminarea rolului metodelor folosite in pronostic. Fundamentarea
algoritmului si metodologiei necesare studiului reprezinta o etapa extrem de
importanta pentru evolutia ulterioara a proiectului. Punerea la punct a unei
metodologii de lucru agreate de toti partenerii va ajuta atat in privinta colaborarii,
utilizarii si valorificarii rezultatelor precum si validarii acestora.
Un obiectiv deosebit de important de indeplinit il reprezinta stabilirea protocoalelor
de consimtamant informat pentru subiecti umani de catre cei patru parteneri(CO,
P1, P2, P3) a caror activitate e in stransa legatura cu clinica. Din acest motiv s-a
stabilit de comun acord un model de cerere catre Comisiile de etica ale celor 3
spitale implicate (anexa nr 2) prin care pacientii si rudele acestora sa fie informati de
scopul si obiectivele studiului, aspectele ce pot fi publicate dar si cele ce sunt
secretizate si sub ce forma (anexa nr 1). Atat pacientii carora li se depisteaza cancer
prostatic cat si rudele acestora, dupa ce sunt informati de diagnostic precum si de
prezentul studiu, numai in urma acceptului lor scris vor fi inrolati iar rudelor li se va
preleva sange. Stabilirea algoritmului de triere a pacientilor cu CaP de catre
partenerii implicati e o necesitate pentru ca sa fie recunoscute si utilizate aceleasi
criterii (CO, P1, P2, P3). CO a elaborat modele de tabele care vor gazdui datele
clinice si paraclinice ale fiecarui partener in parte, tabele ce pot fi procesate cu
usurinta de biostatisticieni. Codificarea pacientilor si rudelor va evidentia aportul
cantitativ al fiecarei unitati sanitare in parte, si va oferi o imagine generala a
incidentei si adresabilitatii pe unitate sanitara. Utilizarea protocolului unic chirurgical
asigura o unitate in privinta specimenelor ce vor fi procesate ulterior histopatologic si
imunohistochimic (CO, P1, P2, P3). Un protocol clar privind recoltarea fragmentelor de
parenchim prostatic va necesita un diagnostic coerent histopatologic si
imunohistochimic, cel din urma fiind stabilit pe seama unui panel de anticorpi agreat
de partenerii implicati (CO, P1, P2, P3).
Un obiectiv extrem de important il reprezinta elaborarea metodologiei privind
investigarea modificarilor genice cu rol prognostic, metastatic si in susceptibilitatea
familiala a CaP (CO, P1, P2, P3). Analiza modificarilor de la nivel cromozomal din
cancerul de prostata, la pacientii depistati cu aceasta afectiune precum si a rudelor
apropiate care consimt la aceasta investigatie este efectuata de CO dar e imperios
necesar sa fie agreata de toti partenerii caci prelevarea materialelor biologice se
efectueaza numai la nivelul unitatilor sanitare implicate, dar se stocheaza la CO care
prezinta dotarea ceruta. Nu in ultimul rand obiectivele partenerilor implicati in analiza
biostatistica este strans legata de ceilalti factori implicati. Criteriile de selectie ale
partenerilor clinicieni trebuie validate si recunoscute de matematicieni, iar
instrumentele utilizate sa poata fi aplicate (CO, P4, P5,).
4. DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA, CU PUNEREA IN EVIDENTA A
REZULTATELOR ETAPEI SI GRADUL DE REALIZARE A OBIECTIVELOR;
(SE VOR INDICA REZULTATELE)
Cancerul de prostata este o afectiune prevalenta,si in prezent reprezinta cel mai
frecvent cancer diagnosticat la barbati. Se estimeaza ca numai in US se pune un

diagnostic de CaP la 3 minute. Contrar a ce se crede, CaP este o maladie agresiva
care omoara multi oameni dintre cei afectati, 25% decedand din aceasta cauza.
Rata deceselor din cauza CaP in USA este cam un deces la 15 minute. Pentru ca
pentru moment nu exista vreo modalitate de preventie a acestei afectiuni, eforturile
depuse pentru diagnostic si tratament precoce au capatat atentie si sustinere. CaP
este prevalent la barbati varstnici, iar eforturile in privinta diagnosticarii precoce s-au
concentrat pe grupa de varsta > 50 ani. Clinicienii pot detecta CaP efectuand tuseu
rectal (TR/ DRE). Aceasta procedura nu este definitiva si daca rezultatul este suspect
trebuie sa fie acompaniata de ecografie transrectala (TRUS) iar biopsia trebuie sa
confirme diagnosticul. Este bine-cunoscut faptul ca la TR poate fi omis un numar
destul de mare de cancere chiar in eventualitatea in care este efectuat de urologi
cu experienta. Desi la prima vedere, screening-ul pentru CaP ar putea pare o
strategie foarte atractiva pentru diagnosticare precoce si tratament, este inca un
mare subiect de controversa. In mod clar raspunsurile definitive la intrebarile critice
privind prelungirea supravietuirii datorita screening-ului trebuie sa mai astepte
terminarea studiilor clinice ce acum se deruleaza.
Stadializarea este definita ca fiind extinderea anatomica a bolii. La CaP, informatiile
relevante privind stadializarea includ: estensia extracapsulara, afectarea glandelor
seminale, marginile chirurgicale pozitive, limfoganglioni pozitivi si localizari
metastatice la distanta. S-au utilizat o serie de tehnici pentru predictia extensiei
anatomice, anume tomografia computerizata (TC), imagistica cu rezonanta
magnetica (MRI), scanare osoasa cu radionuclizi, limfangiografia plantelor, disectia
limfoganglionilor pelvini, biopsia, gradarea Gleason si PSA preoperator. In mod
evident, unele din aceste tehnici s-au dovedit a fi scumpe iar altele cu morbiditate
semnificativa. Pe de alta parte, stadializarea patologica este importanta si poate
ghida clinicianul in selectia celei mai bune modalitati de tratament. Din nefericire,
numai analiza PSA nu este un bun predictor al stadializarii. Totusi, Narayan et al (1995)
a aratat ca stadializarea bazata pe biopsie concentratie serologica preoperatorie a
PSA si scorul Gleason furnizeaza o predictie buna a stadiului patologic final. In vreme
ce valori preoperatorii ale PSA (100mg) sunt un indicator al bolii avansate, Oesterling
et al (1993) a gasit ca PSA preoperativ

aporturi intre volumul total sau volumul tumorii. Unii autori au investigat potentialul
interes suscitat de velocitatea PSA la nivelul scazut care ar putea sa prezica evolutia
ulterioara a CaP. Desi timpul de dublare al PSA este in stransa legatura cu predictia
privind agresivitatea tumorala, interesul sau in screening si detectare precoce sunt
controversate. Din fericire au aparut noi markeri ce pare ca vor ajuta in depasirea
limitelor PSA. Acesti markeri ar trebui sa fie capabili sa creasca specificitatea
diagnosticului. PCA3 (DD3) este un astfel de exemplu. Este gena cu cea mai mare
specificitate in CaP pana acum, supraexprimata in mai mult de 95% din cancerele
primare pe fragmente tisulare, si apta in dezvoltarea unei metode de analiza
moleculara a urinii. O alta abordare promitatoare o reprezinta studierea modificarilor
epigenetice precum promotorul hipermetilarii aberante a genelor supresoare
tumorale implicate in patogeneza CaP. Recent, Hoque et al. a sugerat ca
cercetarea status-ului de metilare a patru gene (p16, ARF, MGMT si GSTP1) pe probe
de urina a pacientilor a permis detectarea a 87% din CaP cu 100% specificitate.
Multe studii au sustinut ca receptorul androgen (AR) este un actor important in stadiile
precoce si tardive ale CaP. Confirmarea directa a rolului AR in cresterea CaP este
furnizata de experimentele ce utilizeaza fie oligonucleotide antisens care sa reduca
expresia mARN a AR., fie oligonucleotide ale ADN dublu catenar ce adapostesc
elemente ale raspunsului androgenilor la inhibitia competitiva a activitatii
transcriptionale a AR, sau ribozomi si anticorpi specifici care sa opreasca functia AR.
Cateva mutatii a AR care modifica selectivitatea ligandului s-au descris la
fragmentele prelevate din metastazele pacientilor cu CaP tratati prin ablatie
androgena. Au fost descrise formele mutante ale AR care cresc raspunsul la
androgenii suprarenalei dehidroepiandrosteron si androstendion, a antiandrogenilor
si altor steroizi ca estrogenii si glucocorticoizii. Interesant e ca mutatia T877A,
modificarea cel mai frecvent descrisa, induce genei AR sensibilitate la stimularea
cresterii de catre antiandrogeni si posibil, ar putea fi responsabila de regresia tumorii
observata la pacienti cu tratament anti-androgen discontinuu.
De asemenea, s-a raportat intersectarea de cai mediate intre AR si ErbB2 ce
conduce la stimularea AR independenta de androgeni si crestere tumorala.
Supraexpresia ErbB2 conduce la activarea Akt si proliferare androgen-independenta
a celulelor neoplazice, in vreme ce inhibarea activarii ErbB2 ligand mediata de catre
anticorpi monoclonali are ca rezultat inhibitia proliferarii celulare si cresterea
xenogrefelor tumorii. Unele analize ADN microarray au aratat ca expresia alfa
metilacil coenzima A racemaza (AMACR) este puternic supraexprimata in CaP: atat
la nivel ARN mesager cat si la nivel proteic, in comparatie cu prostata normala
histologic si hiperplazia benigna (adenomul). Nivele crescute ale expresiei AMACR sau
observat in multe tumori: limfom, melanom, carcinoame colorectal, ovarian,
mamar, vezica urinara, pulmonar si renal. Valorile cele mai mari ale supraexpresiei sau
semnalat totusi la cancerul de prostata si colorectal. Testele imunohistochimice
(IHC) pe biopsiile la CaP au aratat imunocolorare intens pozitiva la AMACR.
Experimente similare au aratat ca toate CaP exprima AMACR. De asemenea,
carcinomul cu celule spumoase si ce pseudohiperplazic, doua forme de CaP ce sunt
foarte dificil de diagnosticat in primele stadii, exprima AMACR.
Interesant este ca variatiile secventei asociata cu riscul mai mare de CaP s-a
identificat la gena AMACR. Functional AMACR este o enzima peroxizomala si
mitocondriala ce joaca un rol important in b-oxidarea lanturilor ramnificate ale
acizilor grasi, dar motivul pentru care expresia sa este crescuta in diferite forme de
cancer, ramane necunoscuta. Determinarea nivelelor de AMACR ar putea sa
imbunatateasca diagnosticul CaP, mai ales cand materialul biologic se limiteaza la
punctia-biopsie.
Au fost facute eforturi pentru elaborarea unor teste pentru investigarea AMACR,
utilizand lichide din corp. (1) Testul ce utilizeaza extracte derivate din fragmentele
tisulare din biopsii are 92.3% sensibilitate si 89.2% specificitate in detectarea CaP. (2)
Un test al reactivitatii imune al AMACR a aratat 71.8% specificitate si 61.6%
sensibilitate pentru distingerea serurilor pacientilor cu cancer fata de cei sanatosi, si

ar putea fi utilizat in combinatie cu PSA seric, pentru reducerea numarului de biopsii
inutile. (3) Un studiu mic a indicat ca analiza bazata pe real time PCR a AMACR in
urina, dupa masajul prostate are posibilitatea sa excluda pacientii cu boala clinica
nesemnificativa, de vreme ce expresia AMACR se normalizeaza pentru PSA. (4)
Analiza Western blot pe esantioane de urina obtinute dupa masajul prostatei are
sensibilitate 100%, specificitate 58%, valoare pozitiva predictiva (VPP) de 72% si
valoare negativa predictiva (VNP).
Numeroase studii au indicat ca hepsina este una din cele mai consistent
supraexprimate gene in CaP. Este o proteina codificata tip serin proteaza
transmembranara tip II identificata pe suprafata hepatocitelor. Nivelul hepsinei se
coreleaza cu gradul tumoral in primele stadii, expresia sa scazuta s-a identificat in
stadiile tardive, hormonal refractare. Nu se stie functia fiziologica. Rapoartele privind
rolul sau in controlul cresterii celulare sunt contradictorii; hepsina este necesara
pentru proliferarea celulelor in hepatom dar supraexpresia sa inhiba cresterea si
invazia celuleoor in CaP.
Sunt numeroase studii privind expresia factorilor proangiogenici precum factorul de
crestere vascular al endoteliilor (VEGF), factorul de crestere al celulelor endoteliale
derivat din plachete (PD-ECGF), factorul de crestere asemanator insulinei (IGF),
factorul de crestere transformator (TGF) in CaP. Un reglator cu functie cheie al
fenotipului angiogenic in multe cancere este VEGF, care este un potential mitogen
pentru celulele endoteliale. Cresterea expresiei VEGF s-a raportat in Cap, si pe linii
celulare derivate si pe fragmente de tumora. De asemenea nivele crescute ale
receptorilor VEGF (VEGFR) kinaza 1 din ficat fetal (Flk-1) si fms-asemanator tirozinkinaza
1 (Flt-1) s-au detectat in tumori de prostata la om. Administrarea anticorpilor
anti VEGF ce tinteste neovascularizatia, suprima efectiv cresterea xenogrefelor CaP
la soricei imunodeprimati inainte de faza initiala de crestere prevasculara precum si
inainte de metastazarea CaP stabilizat.
FIGURE 1. Modelul de progresie in CaP. Pasii histopatologici in tumorigeneza
prostatica.
In faza initiala, apar leziunile de neoplazie intraepiteliala prostatica de grad scazut si
inalt (LGPIN si HGPIN) , leziuni ce se pot identifica histopatologic. Este dificil de facut
deosebirea intre leziunea dormanda (verde) si cea progresiva (rosu/ HGPIN)
Progresia catre invazie locala si apoi metastazare (verde cu stelute) este probabil o
consecinta a acumularii continue de alterari genetice.
Grupuri de lucru au elaborat indreptare pentru o evaluare sistematica si critica a
celor mai importanti markeri din CaP , evaluare care are 6 faze:

1. Studiul preclinic de explorare
2. Dezvoltarea unor teste de cercetare de generatia a doua
3. Analiza retrospectiva
4. Analiza prospectiva
5. Comercializarea markerilor
6. Aprobare de catre factorii de decizie (ex in USA FDA/ Food and Drug
Administration)
Testele cantitative moleculare privind angiogeneza vor fi de un real folos in
determinarea profilului angiogenezic in diferitele stadii de progresie ale CaP. Testul Q-
PCR (real time PCR) se asteapta sa identifice numerosi markeri angiogenezici care
includ VEGF si VEGFRs care pot fi cuantificati dovedindu-se masura a sensibilitatii si
specificitatii. Aceasta ar putea ajuta in evaluarea rolului predictiv al angiogenezei al
potentialului malign si progresiei CaP. Utilizarea lor ca biomarkeri independenti va
suplimenta parametri actuali utilizati: scorul Gleason, titrurile unor antigeni. Folosirea
testelor moleculare cantitative ca proceduri de screening inalt sensibile si sigure in
trialurile pentru CaP, ar putea fi de ajutor in detectarea precoce a bolii,
monitorizarea eficientei diversilor agenti chimipreventivi si identificarea tintelor
moleculare specifice pentru interventie.
(A) RAPORT TEHNIC PRIVIND PRINCIPALELE METODE
DE INVESTIGARE CLINICA SI HISTOPATOLOGICA
Intrucat materialul bioptic de la nivelul glandei prostatice va fi obţinut prin diverse
metode de recoltare:
• Rezecţie transuretrală (TUR-P),
• Puncţie – biopsie ecoghidată cu ac subţire, transrectal,
• Rezecţie transvezicală (adenomectomie),
• Prostatectomie radicală.
P2 propune o metodologie de prelucrare histopatologica in functie de tehnica
chirurgicala de recoltare folosita astfel :
Studiul fragmentelor de rezecţie transuretrală
Rezecţia endouretrală va fi efectuată pentru tulburări disurice de origine prostatică
sau cervico-prostatică. Materialul rezecat se prezintă sub formă de fragmente
corespondente zonei de tranziţie (zona glandulară anteromediană ce înconjoară
uretra) dar şi fragmente de ţesut uretral şi periuretral, fragmente de col vezical şi
stromă fibromusculară anterioară. Fragmentele recoltate vor fi aşezate în casete şi
fixate timp de 24 ore în formol 10% şi apoi incluse în parafină. Numărul fragmentelor
per casetă va fi de aproximativ 1,5 - 2g ţesut deoarece peste această greutate
fragmentele riscă să se suprapună şi ar trebui realizate foarte multe planuri de
secţiune per bloc pentru a putea observa fiecare fragment. Eşantioanele se vor
preleva prin examinarea macroscpică: fragmentele de consistenţă fermă şi culoare
cenuşiu-gălbuie fiind suspecte de a fi sediul unei leziuni carcinomatose.
Aspectul nu este specific deoarece poate fi întâlnit şi în leziunile benigne bogate în
glande. Vom elimina fragmentele hemoragice şi necrozate datorită electrorezecţiei.
Pentru fiecare caz vom repartiza materialul în 4-6 casete. În cazurile în care materialul
rezecat va fi abundent vom creste numărul fragmentelor în jur de 5g per casetă. De
asemeni vom include întregul meterial rezecat în 2 circumstanţe:
pacient tânăr (sub 65 de ani) cu o speranţă de viaţă crescută la care
diagnosticarea unui cancer în stadiul T1a poate aduce în discuţie instituirea unui
tratament radical.
la toţi pacienţii care prezinta un nivel mai ridicat al PSA-ului seric decât în
hiperplazia prostatică benignă.

Rezecţia trasnuretrală (TUR-P) are avantajul recoltării unei cantităţi suficiente de
material cu şanse crescute de depistare a leziunilor tumorale. Metoda presupune însă
utilizarea electrocauterului ceea ce a făcut de multe ori impropriu materialul obţinut
pentru prelucrarea histopatologică. Pe buletinele ce însoţesc materialul rezecat în
mod obligatoriu se va consemna numele şi prenumele pacientului; foaia de
observaţie, vârsta şi nivelul PSA-ului seric în cazul în care a fost posibilă evaluarea
acestuia.
Rezultatul final.
• Trebuie să indice greutatea fragmentelor de rezecţie prelevate pentru
examenul microscopic.
• Incluzionarea totală sau parţială.
• Numărul casetelor.
• Descrierea leziunilor : în cazurile de adenocarcinom prostatic se vor indica :
- diferenţierea histologică în sistem Gleason,
- se caută existenţa unui eventual contingent de grad 4 sau 5,
- numărul fragmentelor interesate de leziune în raport cu numărul
fragmentelor prelevate,
- stadiul patologic ; ex.:
a) adenocarcinom bine diferenţiat al zonei de tranziţie Gleason 2+2=4 infiltrând două
fragmente din cele 60 prelevate – stadiul anatomic pT1a ;
b) adenocarcinom puţin diferenţiat al zonei de tranziţie Gleason 4+3=7 interesând 15
fragmente din cele 30 prelevate – stadiul anatomic pT1b.
• Alte leziuni :
- hiperplazie prostatică benignă cu predominenţa sau cantitatea
echivalentă a contigentului glandular şi stromal ;
- prezenţa sau nu a unei prostatite (sau adenomite) deoarece poate
determina creşterea nivelului PSA-ului seric;
- se descrie starea mucoasei uretrale : normală, distrofică sau existenţa
unui eventual CIS de origine vezicală.
Studiul fragmentelor obţinute prin puncţia biopsie ecoghidată
Puncţiile biopsice ecoghidate pe cale endorectală se efectueza în ambulator, fără
anestezie. Pacientul a făcut în prealabil antibioprofilaxie şi o pregătire rectală. Va fi
aşezat în poziţie ginecologică sau genupectorală culcat pe partea stângă. Sonda
de ecografie cuplată la un inel metalic permite dirijarea acului pentru biopsie cât
mai precis posibil. Se introduce sonda prin canalul anal până în rect. Va fi acoperită
cu un gel ecografic ce permite o bună rezoluţie a imaginilor. Se va explora glanda
prostatică cu măsurarea contururilor şi a volumului ei. Se vor efectua prelevări din
zonele cu anomalii ecografice (zonele hipoecogene) utilizându-se ace fine de 18G.
pentru evitarea deformărilor şi a rupturilor fragmentelor care au forma unor cilindrii
tisulari foarte fragili fiecare fragment recoltat se va plasa într-o casetă utilizată
obişnuit pentru tehnica histopatologică
(PBP)
VARIANTA PRESCURTATĂ A INTERPRETĂRII PUNCŢIILOR BIOPTICE PROSTATICE
• Trebuie specificat numărul fragmentelor, lungimea fiecărui fragment şi
orientarea (atunci când este desemnat de către urolog)
• Ţesutul prelevat se prelucrează în totalitate pentru examenul histopatologic
• Se fixează între 3 – 24 ore în formol 10 %
• Se includ la parafină şi se efectuează secţiuni seriate la 4 nm
• Se colorează standard hematoxilină – eozină
• Când se constată prezenţa adenocarcinomului prostatic pe fragmentul
bioptic raportul final trebuie să includă :
- tipul histologic
- gradul histologic (scorul Gleason)

- trebuie să se măsoare talia focarului tumoral (ambele lungimi ale
tumorii exprimate în milimetri) pe fiecare fragment
- se estimează apoi procentul fragmentelor pe care se constată
prezenţa de focare tumorale
- se notează extensia tumorii (invazia perineurală, invazia vasculară şi a
ţesutului fibroadipos periprostatic precum şi a organelor adiacente (veziculele
seminale)
- toate acestea trebuie consemnate pentru fiecare fragment biopsiat.
• Când se constată leziuni de neoplazie prostatică intraepitelială (PIN)
- se continuă efectuarea de secţiuni seriate pentru a încerca să se
evidenţieze prezenţa unui microfocar de adenocarcinom
- prezenţa leziunilor de PIN de grad înalt se consemnează în diagnostic
- leziunile de PIN de grad scăzut nu trebuie consemnate în diagnostic.
• În cazul PBP negative
- „hiperplazia” prostatică este rareori prezentă dacă biopsiile sunt de
regulă prelevate din zona periferică; hiperplazia este o leziune aproape exclusiv a
zonei de tranziţie (la pacienţii cu o hiperplazie prostatică pronunţată zona de tranziţie
comprimă zona periferică şi poate apare astfel în fragmentul prelevat)
- prostatita cronică trebuie consemnată deoarece poate determina
creşterea nivelului seric al PSA-ului
prostatita granulomatoasă de asemenea trebuie consemnată deoarece şi
ea poate determina niveluri crescute ale PSA-ului şi poate să indice astfel suspiciuni
pentru prezenţa tumorală.
Studiul materialului de rezecţie transvezicală (adenomectomia)
Adenomectomia este practicată de fapt ca metodă terapeutică în cazul
hiperplaziei prostatice benigne fiind de fapt o rezecţie a porţiunii centrale a glandei,
lăsând pe loc porţiunea periferică a acesteia – sediul cel mai frecvent al leziunilor
maligne prostatice.
Se vor efectua secţiuni seriate transversale la nivelul nodulilor de adenomectomie la
o distanţă de 5mm. Fragmentele se vor preleva prin examinare macroscopică la fel
ca şi în cazul rezecţiei transuretrale. În cazul nodulilor mici se va prelucra tot
materialul recoltat. În hiperplaziile voluminoase se va încerca pe cât posibil
prelucrarea a cât mai multe fragmente ţinându-se cont de vârstă, datele clinice şi
paraclinice. În cazul în care microscopic vor fi decelate leziuni de PIN de grad înalt
sau în cazul unor proliferări glandulare marcate se procedeaza la reorientarea piesei
şi punerea în lucru a cât mai multe fragmente.
Studiul unei piese de prostatectomie radicala
Piesa de prostatectomie radicală trebuie să conţină cele două vezicule seminale şi
după tehnica utilizată una sau două bandelete neurovasculare cu localizare
posterolaterală.
Pentru orientarea piesei se iau următoarele repere :
- veziculele seminale sunt situate superior şi posterior ;
- apexul : inferior ;
- faţa anterioară este convexă ;
- faţa posterioară este plană.
Trebuie îndepărtate cu grijă clipsurile sau firele operatorii pe piesa proaspătă
înainte de fixarea în formol pentru a evita falsele margini pozitive (deoarece ţesuturile
fixate sunt friabile şi ablaţia unui fir poate antrena smulgerea capsulei.
După aceea piesa este badijonată cu tuş de China pe toată suprafaţa
inclusiv suprafaţa veziculelor seminale.
Pentru comoditatea lecturii fiecare hemiprostată se va colora diferit prin
consens – ex.: hemiprostata dreaptă în roşu ; hemiprostata stângă în negru. Se
foloseşte un tuş tisular special sau un tuş de tatuaj de uz veterinar. Acest tuş aderă

mai bine la ţesut dacă prostata a fost deja introdusă câteva minute în formol sau
lichid Bouin.
Fixatorul utilizat este Formol 10 % dar, dacă se utilizează tehnica fragmentelor
topografice mari aşezate în megacasete se recomandă o postfixare de câteva zile
în Bouin pentru a se obţine o întărire a ţesutului prostatic.
Timpul de fixare este variabil funcţie de tehnica de includere utilizată 24-48
ore în cazul includerii în casete de tip standard, 4-6 zile în cazul utilizării
megacasetelor.
Trebuie cântărită şi măsurată prostata înainte şi după ablaţia veziculelor
seminale. Se măsoară distanţa apex – bază (înălţimea), diametrul transversal
(lăţimea), diametrul anteroposterior (grosimea). Volumul prostatei este sensibil egal
cu greutatea.
Orientarea piesei de prostatectomie radicală
Prelevarea separată a veziculelor seminale, a bazei prostatei şi a apexului.
Veziculele seminale.
• Se detaşează complet de baza prostatei.
• Se realizează în partea lor inferioară o secţiune transversală de 8 mm grosime
ce cuprinde inserţia veziculelor, ţesut de la nivelul bazei prostatice şi ţesut adipos
periseminal de vecinătate.
Această secţiune transversală este tăiată în fragmente sagitale la 3 mm (conizaţie) şi
incluse în totalitate.
Această orientare permite aprecierea invaziei căilor spermatice intraprostatice şi a
bazei veziculelor.
Apoi se efectuează una sau două secţiuni transversale ale corpului şi extremităţilor
distale.
Baza prostatei sau marginea chirurgicală proximală.
Este prelevată printr-o secţiune transversală de 5 mm grosime care este apoi
retăiată într-o manieră sagitală din 3 în 3 mm şi se include în totalitate.
Apexul sau marginea chirurgicală distală.
Este de asemenea prelevat printr-o secţiune transversală de 5 mm grosime
care retaie în fragmente sagitale din 3 în 3 mm şi se include în totalitate.
Restul blocului prostatic.
Se prelevează secţiuni transversale etajate de la apex spre bază
perpendicular pe suprafaţa rectală şi uretră. Numărătoarea secţiunilor se face de
asemenea în sens apex – bază. Grosimea secţiunilor variază între 3-5 mm funcţie de
tehnica incluziei care se poate efectua în două moduri :
- utilizarea casetelor de tip standard : secţiunea prostatică este separată în 2
sau 3 fragmente printr-o resecţionare sagitală mediană sau paramediană. Dacă
prostata cuprinde o zonă de tranziţie foarte dezvoltată se pot face resecţionări ale
părţii anterioare pentru a diminua înălţimea secţiunii. Aceste secţiuni anterioare
cuprinzând stroma fibromusculară anterioară şi zona de tranziţie pot fi puse deoparte
pentru o incluzionare ulterioară în eventualitatea unui carcinom situat în această
regiune.
- utilizarea de megacasete : grosimea secţiunii prostatice este mai mare (5-6
mm), secţiunea trebuie să fie perfect plană pentru a obţine cupe ce cuprind
întreaga suprafaţă tisulară. Se vor realiza două niveluri de cupe pe blocul de
parafină la o distanţă de 2,5 – 3 mm între două secţiuni. În cazul în care prostata este
foarte voluminoasă (superior la 5,5 cm în diametrul transversal) se realizează o
secţiune sagitală mediană. Oricare ar fi tehnica utilizată toate secţiunile vor fi incluse
în totalitate. Ele trebuie orientate corect punându-se de fiecare dată faţa anterioară
a secţiunii pe fundul casetei.

Nu trebuie niciodată să resecţionăm ţesutul adipos localizat lateral
(bandelete neurovasculare, ţesut pericapsular).
Interpretarea histopatologică
- Descrierea tumorii (determinarea tipului histologic)
- Determinarea gradului histologic.
Se utilizează sistemul Gleason exprimat prin scorul Gleason.
Ex.: 3 + 4 = 7 sau 3 + 3 = 6 pentru o tumoare de aspect omogen.
Pentru o tumoare dată, scorul este apreciat pe ansamblul secţiunilor unde
este localizată tumora. Dacă există două tumori de grad diferit, trebuie gradate
separat.
Ex.: adenocarcinom Gleason 4 + 3 = 7 al zonei periferice al doilea focar
tumoral Gleason 2 + 3 = 5 al zonei de tranziţie.
Dacă pacientul a urmat un tratrament hormonal preoperator, modificarea
ţesutului tumoral face imposibilă utilizarea sistemului Gleason.
- Sediul tumorii :
• lobul drept sau stâng
• 1 sau 2 lobi
• zona periferică sau de tranziţie
- Extensia anatomică.
Evaluarea extensiei tumorale este apreciată în funcţie de stadializarea anatomică a
sistemului pTNM.
Stadiul pT1 nu există pe piesa de prostatectomie deoarece în acest caz este vorba
despre un stadiu anatomoclinic rezervat cancerelor nepalpabile (la tuşeul rectal)
detectate pe material de rezecţie sau puncţie bioptică (PBP).
Stadiul pT2 se aplică la toate tumorile intracapsulare indiferent de mărime
distingându-se pT2a (invadarea a mai puţin de jumătate dintr-un lob), pT2b (invadarea
a mai mult de jumătate dintr-un lob), şi pT2c (invadarea ambilor lobi).
Stadiul pT3 se aplică tumorilor care depăşesc capsula şi/sau invadează veziculele
seminale.
⇒ Penetrarea capsulei care corespunde stadiului pT3a (penetrarea capsulară
unilaterală) şi pT3b (penetrarea capsulară bilaterală) este definită prin prezenţa
structurilor neoplazice în ţesutul adipos periprostatic.
Penetrarea capsulară incompletă, fără trecerea prin capsulă nu trebuie luată
în considerare deoarece nu are semnificaţie prostatică.
Epstein distinge un stadiu extracapsular focal (prezenţa câtorva glande
neoplazice în ţesutul adipos pe unul sau două nivele de cupă) şi o penetrare
periprostatică extensivă.
⇒ Infiltrarea veziculelor seminale reprezintă stadiul pT3c. Este asociată cu volume
tumorale mari dar este şi în legătură cu topografia cancerului în raport cu localizarea
căilor spermatice intraprostatice deoarece unul din mecanismele de invazie este
diseminarea pe cale endocaniculară. Această invazie este altfel mai frecventă şi mai
rapidă de cât faptul că tumora atinge partea centrală a bazei prostatice. Pentru
Epstein singurul criteriu de invazie al veziculelor seminale este infiltrarea peretelui lor
muscular. Numai invazia ţesutului adipos periseminal aparţine stadiului extracapsular
(pT3a).
3. Limitele rezecţiei chirurgicale sau „marginile” sunt apreciate pe întregul
contur al glandei. Există patru tipuri de margini :
• Margini negative :
- ţesutul tumoral este situat la distanţă de linia marcată cu tuş de China.
• Margini pozitive :
- sunt definite prin prezenţa ţesutului tumoral la nivelul liniei marcate cu tuş şi sunt în
legătură fie cu o tumoare voluminoasă a cărei extensie extracapsulară este masivă,
fie cu o smulgere a capsulei din zona tumorală în legătură cu gestul chirurgical.
• Margini suspecte :

- când ţesutul tumoral se întinde foarte aproape de linia de marcaj cu tuş de China,
dar fără să o penetreze. Realizarea a câteva cupe semi-seriate din această regiune
permite adesea aprecierea mai corectă a acestui parametru.
• Margini nedeterminabile :
- apar printr-un defect de tehnică. Cel mai adesea este vorba despre o cupă
defectuoasă, incompletă în care limitele nu sunt marcate cu tuş.
Frecvenţa pozitivităţii marginilor depinde de topografia cancerului.
Cancerele zonei periferice determină margini pozitive în regiunea
posterolaterală deoarece extensia extracapsulară este importantă şi au fost
prezervate la acest nivel bandelete neurovasculare.
În regiunea posterioară, marginile pozitive sunt rezultatul tumorilor
voluminoase şi extracapsulare.
4. Determinarea volumului tumoral.
Volumul tumoral va fi apreciat cel mai adesea aproximativ secţiune de
secţiune, fie utilizând o metodă de morfometrie manuală ţinând de puncte, fie
înscriind tumora într-un volum geometric simplu (cub, paralelipiped). Trebuie ţinut
cont de un coeficient de retracţie care pentru Mc Neal este de aproximativ 1,5.
5. Topografia tumorii.
Nu este un indicator indispendsabil deoarece nu are importanţă pentru
pronostic. Este interesantă pentru chirurg care poate să compare datele
anatomopatologice cu datele clinice (tuşeu rectal, ecografie).
6.Alte leziuni.
• Tumorile accesorii trebuie să fie citate în rezultatul final; gradul lor poate fi
diferit de cel al tumorii primitive şi pot determina margini pozitive. Volumul lor însă nu
trebuie adăugat volumului tumorii principale.
• Displazia (PIN) este o noţiune interesantă de precizat pentru înţelegerea
dezvoltării şi extensiei leziunilor canceroase; se va nota gradul şi topografia acestei
displazii.
Pentru ca rezultatul să fie complet se vor semnala leziunile asociate:
hiperplazia zonei de tranziţie, prostatite, zone de atrofie glandulară.
7. Examinarea ganglionilor ileo-obturatori.
Acest examen trebuie efectuat tuturor ganglionilor prelevaţi ce trebuie incluzionaţi în
totalitate şi eventual secţionaţi la mai multe niveluri pentru a decela micrometastaze.
Prostatectomiile efectuate după un tratament antiandrogenic sunt adesea foarte
dificil de studiat din cauza modificărilor atrofice ale proliferării tumorale care este
uneori dificil de identificat. De aceea ar trebuzie să folosim teste imunohistochimice –
o anticitokeratină cu spectru larg (ex. K 4) pentru a detecta mici focare tumorale, în
mod particular la nivelul marginilor sau în ţesutul pericapsular care este sediul unei
fibroze importante.
Prostatectomiile care conţin un minuscul focar tumoral sau chiar absenţa totală a
leziunii canceroase reprezintă o situaţie mai frecvent întâlnită actualmente datorită
eforturilor care se fac pentru detectarea şi tratamentul chirurgical al cancerelor
prostatice în stadiu precoce.
În aceste cazuri este importantă prelevarea prostatei în totalitate şi de a efectua
cupe seriate din regiunea în care biopsia a fost pozitivă şi din zonele de unde
cancerul este mai frecvent localizat.
Tehnici histopatologice uzuale
Coloraţia curentă cu hematoxilină-eozină (H.E.) este metoda de colorare standard.

Hematoxilina se prezintă sub formă de cristale galben-brune solubile în apă, alcool, glicerină.
Adevăratul colorant nu este hematoxilina ci produsul său de oxidare, hematina. Pentru
obţinerea acestuia se oxidează hematoxilina cu diverse substanţe (permaganat de potasiu,
hidroxid de potasiu) sau substanţa a fost lăsată să se matureze în aer. Ea colorează specific
nucleii sau substanţele anionice în albastru sau în negru. În prealabil colorantul a fost mordasat,
mordantul acţionând în general în acelaşi timp cu acesta. Amestecul în care sunt conţinute
atât mordantul cât şi colorantul se numeşte în funcţie de mordant (aluminiu, fier, crom). Se
disting diverse tipuri de hematoxilină: aluminică sau hemalaum, ferică, cromică, etc. În
proiectul de faţă vom folosi coloraţia hemalaun Meyer.
În practica medicală, un diagnostic anatomopatologic precis şi complet stă la baza unei
strategii terapeutice ţintite şi eficiente. Criteriile diagnosticului histopatologic au rămas mai mult
sau mai puţin nemodificate din timpul lui Virchow şi coloraţia cea mai utilizată este încă
hematoxilină-eozină. Utilizând exclusiv tehnicile convenţionale de microscopie optică în
examenul histopatologic concordanţa diagnostică poate uneori să nu depăşească 75% chiar
la experţii în domeniu.
Imunohistochimia este o tehnică pentru identificarea constituenţilor celulari sau tisulari prin
reacţii antigen-anticorp, situl legăturii cu anticorpul fiind identificat fie prin marcarea directă a
anticorpului, fie printr-o metodă secundară de marcare.
Mai ales în ultimii 10 ani, imunohistochimia a devenit metoda calitativă cea mai valoroasă
alături de anatomia patologică convenţională permiţând o analiză structurală, topografică şi
fenotipică. Ea utilizează criteriul molecular în diagnosticul histopatologic cu impact imediat
asupra studiului histogenezei, diferenţierii, clasificării şi progresiunii tumorale.
Aceste tehnici se bazează pe legătura antigen tisular.anticorp, acesta din urmă fiind
evidenţiat prin conjugare directă cu molecule trasoare (reacţie directă) sau prin intermediul
unui lanţ de alte legături cu anticorpi liberi sau marcaţi (reacţie indirectă cu două sau mai
multe faze).
Tehnica de lucru:
• secţiunile de 2 microni grosime deparafinate vor fi spălate într-un tampon fosfatsalin
ph=7 (PBS)
• secţiunile se incubează apoi timp de 20 de minute cu ser normal pentru legarea
situsurilor nespecifice, după care se aplică anticorpul primar în diluţia de lucru şi se incubează
peste noapte
• a doua zi se spală în PBS timp de 20 de minute şi se incubează cu anticorpul
secundar drept punte (30 de minute) şi apoi cu complexul avidină-biotină (ABC) 45 de minute
(kit Vector, Burlingame SUA)
• după spălare în apă curentă se developează într-o soluţie de diaminobenzidină
(DAB) 10mg în 88ml PBS şi 0,025% apă oxigenată. DAB scindată de peroxidaza liberă din
complexul ABC produce un precipitat de culoare brună localizând net antigenul căutat, fie în
citoplasmă fie în nucleu
• Contracolorarea nucleară: hemalaun Mayer
• Deshidratare
• Clarificare
• Montare în balsam de Canada.
(B) RAPORT TEHNIC PRIVIND PRINCIPALELE METODE MOLECULARE UTILIZATE
Din probele de sange si de tesut tumoral de la rude si respectiv pacientii cu
neoplasm prostatic se va extrage ADN si ARN utilizand kit-uri dedicate si foarte
scumpe. Materialul genetic va fi ulterior utilizat in tehnici care urmaresc evaluarea
modificarilor la nivelul structurii materialului genetic (ADN) care vor fi corelate cu
evaluarea modificarii expresiei genice. Partenerul CO din proiectul CAPMAT isi asuma
obligatia realizarii urmatoarelor tipuri de tehnici: Secventiere, MLPA, LOH, MSI,
identificare SNP-uri prin microarray, CGH si CGH-array, care vor fi corelate cu

experimentele de determinare a nivelului de expresie prin Quantitative PCR (Real-
Time RT-PCR si RT-PCR, Microarray-transcriptomica.
Deoarece moleculele de ARN sunt foarte usor degradabile este foarte importanta
concentratia si integritatea moleculelor obtinute in urma extractiei si purificarii acesti
parametrii contribuind in proportie 90% la obtinerea unor rezultate corecte si
reproductibile care sa poata fi publicate in reviste recunoscute si cu impact. In acest
context, metodologiile de prelevare a tesuturilor si depozitarea acestora imediat
dupa rezectie sunt FOARTE IMPORTANTE. Pentru a evita degradarea ireversibila si
ulterior obtinerea unor valori inexacte si necorelate privind expresia genelor luate in
studiu este absolut indispensabila scurtarea la MAXIM a timpului de manipularea a
probei/probelor de tesut tumoral. Imediat dupa prelevare probele se vor introduce
in solutie stabilizanta RNAlater. Fiecare proba trebuie taiata steril in bucati cat mai
mici, pentru ca solutia sa vina in contact cu toata suprafata probei. Aceasta solutie
are rolul de a permeabiliza peretele celular si de a stabiliza imediat toate tipurile de
molecule de ARN. Orice recoltare a probelor din care urmeaza sa se extraga ARN se
va face intr-un interval de la 10 minute la maxim 30 de minute de la prelevare pentru
a minimiza efectul RNazelor, enzime foarte active care degradeaza ARN.
ATENTIE! Trebuie evitat contactul direct cu pielea sau cu mucoasa a solutiei
stabilizator RNAlater.
ADN este mai stabil la temperatura camerei decat ARN, dar pentru o
acuratete cat mai mare a analizelor ulterioare este de dorit ca si tesutul
normal/tumoral din care urmeaza sa se extraga ADN sa fie depozitat la -80 0 C
in maxim 1ora de la prelevare.
Prelevarea, depozitarea şi transportarea probelor de sânge în vederea
extracţiei ADN
Se vor recolta 2-5 ml de sânge atât de la bonavi cât şi de la rudele de gradul I
ale acestora în vacutainere cu EDTA şi se vor depozita la 4°C. Livrarea
acestora catre CO se va face în maximum 24-48 de ore de la recoltare,
menţinându-se la temperatura de 4°C.
Prelevarea, depozitarea şi transportarea probelor de ţesut tumoral si normal în
vederea extracţiei ADN
Se va preleva cate un cm de ţesut tumoral în tuburi Eppendorf de 2,0 ml (5
tuburi tesut tumoral/ pacient şi se vor depozita la temperatura de -80 0 C in
interval de maxim o ora. Livrarea probelor se va face în maxim 24-48 de ore
de la prelevare şi vor fi menţinute în cutii frigorifice la temperatura de -20°C.
Prelevarea, depozitarea şi transportarea probelor de ţesut tumoral şi normal în
vederea extracţiei ARNSe va preleva câte 0,5-1cm ţesut în tuburi Eppendorf
de 2 ml (5 tuburi/ pacient/ tip de tesut) care contin 1,0 ml soluţie de stabilizare
(RNAlater RNA Stabilization Reagent). Inainte de introducere in tub, probele
vor fi maruntite foarte bine in conditii cat mai sterile. Tuburile astfel preparate
se vor depozita la 4 0 C. Livrarea probelor se va face în maxim 24-48 de ore de
la prelevare, transportul lor făcându-se în cutii frigorifice la temperatura de
4°C.
Conservarea şi transportarea probelor de ţesut tumoral/normal prelevat în
urma biopsiei, în vederea extracţiei ADN si ARN
Toate recipientele cu solutie stabilizatoare ARN (tuburi Ependorf de 1,5ml si
2ml) vor fi sterile si vor fi furnizate de partenerul P1. Vacutainele du EDTA
pentru recoltare sange vor fi furnizate de spitalele in care se face recoltarea
probelor.
Pentru o buna colaborare in vedere recoltarii si transportului probelor apare
necesitatea anuntarii prealabile a datei interventiei chirurgicale (48-24 ore)
astfel incat medicii si cercetatorii implicati in proiect de la nivelul diferitelor
colective (spitale/laborator de cercetare DBBM) sa stabileasca de comun
acord momentul realizarii transportului la Departamentul de Biochimie si
Biologie Moleculară (DBBM), Universitatea din Bucuresti.

Pe aceleasi fragmente arhivate, tot in cadrul departamentului de biologie
moleculara CO aplica testele de hibridizare in situ in fluorescenta (FISH) pentru
analiza mutatiilor genice (CO).Dupa optimizarea metodei se trece la analiza prin FISH
a nucleilor in interfaza pentru investigarea EGFR, BRCA1 si 2 si P53. Tehnica hibridizarii
in situ presupune predigestia proteinelor, denaturarea ADN in solutie de formamida,
hibridizare prin incubare si posthibridizare si tratare cu DAPI, apoi examinare la
microscopul cu fluorescenta. Reactia in lant a polimerazelor, bazata pe procesul
replicarii semiconservative este utilizata tot pentru detectarea alterarilor genetice in
cancerul de prostata. Utilitatea acestor examene rezida din prezenta de anomalii
genice de importanta majora in etiopatogenia cancerului prostatic. Reacţia PCR
(„Polymerase Chain Reaction”) este o tehnica care permite amplificarea in vitro a
secventelor de ADN prin repetarea reactiilor de alungire, in prezenta unei ADN
polimeraze si a primerilor nucleotidici specifici, detectarea şi analiza microsateliţilor –
prin utilizarea secvenţializatorul automat ABIPrism. Determinarea marimii
fragmentelor si a cantitatii de ADN este posibila prin folosirea unui soft de analiză
„GeneMapper ID v3.1” care permite automatizarea detectarii marimii fragmentelor
de ADN. Concomitent cu efectuarea analizelor anomaliilor cromozomale prin FISH si
PCR, se va proceda si la analiza pierderii heterozigozitatii (LOH) precum si analiza
MSI. In vederea analizei posibilelor dezechilibre alelice care apar, s-au utilizat
urmatoarele tehnici: microdisectia manuala, izolarea ADN din probele de tesut
tumoral si normal cu ajutorul „Wizard® Genomic DNA Purification kit, analiza
microsateliţilor - secventele scurte repetitive in tandem (STR) care sunt markeri ADN
inalt polimorfi aplicati pe scara larga in cercetarea biomedicala, amplificarea PCR a
microsateliţilor.
Tehnica MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)
Tehnica MLPA este o metoda de inalta rezolutie, care permite amplificarea intr-o
singura reactie PCR a pana la 45 de fragmente de ADN. In 2002, a fost descrisa
pentru prima data de Schouten JP si cu ajutorul acesteia pot fi detectate o gama
larga de modificari genetice de tipul duplicatiilor sau deletiilor in diferite tipuri de
maladii, inclusiv cancer.Pe baza acestui test, poate fi apreciata predispozitia la
anumite boli genetice, prin screening familial. Avantajele principale ale metodei sunt
usurinta detectiei deletiilor/ duplicatiilor prin screening-ul regiunlor codante ale
genelor propuse in studiu. Pentru aceste gene au fost desenate kit-uri care contin un
amestec de sonde, dupa cum urmeaza:
A). Pentru gena BRCA1 au fost desemnate 3 kituri:
kit-ul P002B in care cu exceptia exonului 4, permite amplificarea exonilor 1 –
24, iar pentru exonului 1, datorita lungimii sale, au fost desemnate 2 sonde – 1A si 2B.
In kit mai sunt incluse sonde pentru alte 9 gene cu localizare pe cromozomi diferiti,
folosite drept controale interne.
kitului P087-B1 – utilizat pentru a confirma rezultatele obtinute cu kitul P002B;
kitul P239 – in cazul in care se doresc investigatii suplimentare privind
deletiile si duplicatiile de la nivelul genei BRCA1, si al carui screening se bazeaza pe
examinarea zonelor inaintea exonului 1 si dupa exonul 27.
B). Pentru gena BRCA2 a fost desemnat kitul P090 pentru toti cei 27 de exoni.
C). Pentru gena EGFR a fost desemnat kitul P315 pentru toti cei 28 de exoni.
D). Pentru gena TP53 a fost desemnat kitul P056 pentru toti cei 11 de exoni.
In plus, se mai gasesc 4 fragmenete de control ale cantitatii ADN, notat cu DQ (DNA
Quantity). Acestea nu trebuie sa fie mult mai mici decat ale produsilor de amplificare

generati prin reactia MLPA. Interpretarea rezultatelor obtinute sa va face cu ajutorul
unui soft dedicat care va evalua produsii de reactie rezultati in functie de greutatea
lor moleculara si expresia cantitativa.
In cazul acestei tehnici de analiza se va face mai intai izolarea ADN genomic total
din proba biologica, urmand ca in a doua etapa sa se realizeze o reactie de
hibridizare a sondelor specifice pe ADN genomic, urmata de o reactie PCR a hibrizilor
rezultati. Produsii de amplificare obtinuti sunt analizati prin electroforeza capilara si
detectia in fluorescenta a produsilor formati.
( C) RAPORT TEHNIC PRIVIND METODELE DE STATISTICA UTILIZATE SI
FORMULAREA MODELELOR MATEMATICE
In etapa 1 a proiectului P4 urmareste fundamentarea algoritmului si a metodologiei
de lucru pentru ca apoi in urma discutiilor cu partenerii clinicieni sa se aleaga dintre
aspectele teoretice posibile cele mai adecvate studiului.
Modelele analizei statistice propuse sunt: : analiza descriptiva, analiza corelatiei si
regresiei , ANOVA, teste parametrice si neparametrice, analiza discriminanta, teste
exacte, verificarea ipotezelor statistice, estimatori. Ca instrument efectiv de lucru
vom folosi pachetul de programe SPSS 15.0. (modul de baza, modele de regresie ,
teste exacte, tabele). Rezultatele obtinute vor fi utile in formularea si verificarea
ipotezelor unor teorii privind carcinogeneza in cancerul de prostata .
1. Elemente conceptuale si metodologice de statistica
Statistica studiaza fenomene de masa , de tip proces aleatoriu. Astfel ca in
loc de o singură realitate posibilă despre cum pot evolua procesele în timp (aşa cum
este cazul soluţiilor unei ecuaţii diferenţiale ordinare, de exemplu), într-un proces
aleatoriu( stohastic) există o incertitudine în evoluţia viitoare descrisă de distribuţii de
probabilitate. Acest lucru înseamnă că deşi se cunoaşte condiţia iniţială (sau punctul
de plecare), există mai multe posibilităţi de continuare a procesului, dar unele căi
sunt mai probabile decât altele.
Prin studiul statistic al fenomenelor se desprind trasaturile comune,
comportarea normala a fenomenelor la nivelul ansamblului, nu al fiecarui individ in
parte. Statistica observa fiecare element al unei colectivitati in variabilitatea sa si
ajunge prin prelucrarea datelor obtinute din observarea statistica si compararea
rezultatelor prelucrarii , la cunoasterea intregului.
Procesul cunoasterii statistice parcurge urmatoarele etape: punerea
problemei, observarea statistica, prelucrarea si analiza datelor statistice, decizia
statistica (fig.1).
Definirea
problemei :
scopul si aria
de investigatie
Observarea statistica a fenomenelor reale

Date
statistice
Prelucrarea si analiza datelor satistice
Informatii
statistice
Fundamentarea
d i iil
DECIZII ASUPRA FENOMENELOR REALE
Fig.1 Etapele procesului statistic
In fiecare etapa se aplica procedee si tehnici specifice, inlesnind observarea si
prelucrarea datelor statistice, precum si testarea si analiza informatiilor statistice.
Ca partener in acest proiect (P4) ne vom ocupa in special organizarea si
introducerea datelor, prelucrarile statistice ale datelor si impreuna cu ceilalti
parteneri vom participa la interpretarea si diseminarea rezultatelor.
Prelucrarea statistica presupune un set de operatii efectuate prin procedee si
tehnici de lucru specifice, si anume:
- sistematizarea materialului faptic brut obtinut in etapa observarii statistice.
Aceasta operatie se poate realiza prin procedee de centralizare si
grupare statistice, in urma carora se obtin indicatori primari si serii de date
statistice;
- prezentarea datelor statistice , care se poate realiza prin procedee
tabelare si grafice;
- calcularea indicatorilor derivati, cum ar fi indicatori ai tendintei centrale,
ai dispersiei, ai formei de repartitie, folosind procedeul mediei, variantei
etc., sau indicatori ai variatiei in timp si spatiu, folosind de exemplu,
procedeul indicilor statistici;
- masurarea gradului de intensitate a legaturilor statistice, folosind
procedeul covariantei si corelatiei;
- masura influentei factorilor asupra variatiei fenomenelor , folosind
procedeul ANOVA;

- aproximarea modelelor de regresie si de trend, folosind procedeul ajustarii
statistice;
- prognozarea fenomenelor, folosind extrapolarea statistica;
- estimarea parametrilor si verificarea ipotezelor statistice, folosind
procedee inferentiale.
Rezultatul prelucrarii se concretizeaza in indicatori primari si derivati , purtatori
ai informatiei statistice. Etapa prelucrarii datelor se imbina cu analiza acestora.
Procesul cunoasterii statistice fiind iterativ , prelucrarea pe o anumita treapta se face
numai dupa analiza rezultatelor obtinute din prelucrarea precedenta.
2. Pregatirea, sistematizarea si introducerea datelor
Un aspect esential il constituie organizarea , introducerea datelor si alcatuirea
bazei de date. Alcatuirea acestei baze de date va conduce la initierea unui veritabil
trial pentru investigarea cancerului de prostata, precum si stabilirea cerintelor etice,
legale si a reglementarilor indispensabile cercetarii medicale care implica subiecti
umani, respectand cerintele internationale. Crearea acestei baze de date este
bazata pe experienta celor mai importante clinici de urologie din Bucuresti, pe
expertiza in diagnostic molecular a partenerilor din sfera cercetarii biologice si pe
aplicabilitatea modelelor statistice si simularilor, ea devenind un pachet de lucru util
medicilor practicieni in abordarea cancerului de prostata.
Campurile propuse sunt grupate pe trei directii urmarind sa cuprinda
protocoale inter si intradisciplinare de investigare a cancerului de prostata:
- istoricul bolii , prezenta /absenta ei la rudele de gr I
- datele furnizate de examenul imunohistochimic
- datele furnizate in urma examenului histopatologic
- Metodele propuse si prezentarea rezultatelor
Metodele pe care le vom utiliza sunt cele oferite de SPSS , prezente in modulele pe
care le avem. Ele au fost enumerate la inceputul raportului. In functie de discutiile pe
care le vom avea cu partenerii medici, si de datele culese mai putem adauga si
altele . De asemenea se pot achizitiona si alte module SPSS daca aceasta este util.
Descrierea pe larg a metodelor se va face in etapele urmatoare pe masura ce le
vom utiliza in cadrul prelucrarilor statistice pe care le vom face.
In prezentarea rezultatelor vom folosi instrumentele puse la dispozitie de SPSS:
rapoarte, tabele, grafice. Aceste instrumente sunt flexibile si usor de adaptat la
cerintele utilizatorilor.
In final consideram ca SPSS este util deoarece poate rezolva probleme complexe
prin instrumentele statistice pe care le are , prin prezentarea sugestiva a rezultatelor,
prin suplete in stabilirea conditiilor de prelucrare a datelor prezente intr-o mare
diversitate si prin simplitate in exploatare.
In ceea ce priveste statistica subscriem afirmatiei lui Constantin Noica:
“ statistica lasa intregurile sa iasa din elementele infinitezimale”.
Mecanismele psihologice în anatomia omului, progresul bolilor la fiecare pacient în
parte, managementul spitalului, sunt doar câteva din complicatele procese studiate
de cercetătorii în biomedicină şi îngrijire medicală. Pentru a putea controla creşterea
acestor câmpuri este necesară înţelegerea profundă a proceselor care le
alcătuiesc. Caracteristicile proceselor variază în mare măsură, deşi doar o parte din
multitudinea factorilor de care ele sunt conduse pot fi observaţi în practică. Mai mult,
procesele includ efectele individuale precum şi variaţia aleatoare. Esenţial, ele sunt
incerte; aceste incertitudini implicate fac înţelegerea completă greu de obţinut.
Modelele ce captează aceste procese şi metodele pentru utilizarea modelelor sunt
astfel necesare pentru luarea deciziilor în viaţa reală. COMSOL Multiphysics este un
program care se poate utiliza cu succes pentru realizarea modelării şi simulării
proceselor amintite si pe care P5 il aplica in proiectul CAPMAT.

Reţelele Bayesian cu metodele lor asociate sunt potrivite pentru captarea şi analiza
incertitudinii [1]. Ele sunt prezente în biomedicină şi în îngrijirea medicală de mai bine
de un deceniu şi au devenit extrem de populare în manevrarea noţiunilor incerte
implicate în stabilirea diagnosticelor, în stabilirea tratamentului optim alternativ şi în
estimarea rezultatului tratamentului. Reţelele Bayesian sunt de asemenea extrem de
dezvoltate în domenii de îngrijire medicală care nu au legătură directă cu tratarea
bolilor pacienţilor. Spre exemplu putem enunţa folosirea acestui tip de reţele în
epidemiologia clinică pentru construirea unor modele de boli şi în cadrul
bionformaticii pentru interpretarea datelor ce caracterizează genele
micromatriceale.
Telemedicina este folosirea telecomunicaţiilor tehnologice pentru diagnosticarea
medicală şi pentru îngrijirea pacienţilor. Ea poate furniza servicii de îngrijire medicală
când furnizorul şi clientul sunt separaţi de distanţă. O reţea Bayesian sau o reţea de
probabilităţi, B=(Pr,G), este un model al unei distribuţii de probabilităţi peste o
mulţime de varibile aleatoare; constă dintr-o structură grafică G şi o distribuţie
asociată Pr. Construirea unui model se bazează pe procesul de selectare a
variabilelor care reprezintă anumite caracteristici. În modelele medicale, variabilele
sunt determinate de: factorii de risc, simptome, rezultatele examenului fizic şi ale
testelor de laborator. Deoarece numărul variabilelor este de obicei foarte mare este
necesară o sintetizare a datelor.
Programul COMSOL Mutyphisics, aşa cum este conceput, este un program
• Usor de folosit
- efortul este concentrat asupra problemei ce trebuie rezolvată, nu
asupra soft-ului;
- permite utilizarea cu uşurinţă a programului, ceea ce nu este de
neglijat in domeniile aplicative şi în industrie;
- permite alegerea unui model predefinit, cel mai apropiat de legile
fizice ce guvernează modelul studiat
• Flexibil
- Modelele predefinite nu sunt asa zise „cutii negre”, ele pot fi
personalizate
- Se pot introduce ecuaţiile direct in program sau pot fi cuplate, după
caz.
• Deschis
- Se pot construi noi modele
- Permite modelarea pe baza de ecuaţii
Toate aceste considerente permit învăţarea cu uşurinţă a programului şi folosirea lui
pentru rezolvarea problemelor de modelare şi simulare.
Modelare şi simulare în COMSOL Multiphysics
Modelarea matematică reprezintă o parte importanta a muncii de cercetare
in dezvoltarea domeniilor ştiinţifice şi inginereşti. Latura competitiva a acestei
dezvoltări necesită o legătură intre idee şi prototip, pe de o parte şi modelarea şi
simularea matematică, pe de altă parte, ceea ce permite înţelegerea rapidă a
aspectelor cantitative şi calitative ale studiului atât din punct de vedere ştiinţific cât şi
ingineresc. COMSOL Multiphysics oferă, în acest sens, adevărate performanţe fiind
construit cu ajutorul limbajelor Jawa pentru realizarea interfeţelor şi C/C++ pentru
metodele de rezolvare.
COMSOL Multiphysics conţine o serie de metode pentru rezolvarea problemelor
guvernate de ecuaţii cu derivate parţiale (problema PDE). După discretizarea
ecuaţiilor rezolvarea problemelor conduce la rezolvarea unor sisteme de ecuaţii,
metodele descrise mai jos se referă la rezolvarea acestor sisteme.
Nume Metoda Utilizarea metodei
Stationary liniar solver Pentru problema PDE liniară sau liniarizată şi

Stationary nonliniar solver
staţionară
Pentru problema PDE neliniară şi staţionară
Time-dependent solver Pentru problema PDE dependentă de timp (liniară
sau nelineară)
Eigenvalue solver Pentru probleme PDE de valori proprii
Parametric linear solver Pentru probleme PDE liniare şi staţionare ce depind
de un parametru
Parametric
solver
nonlinear Pentru probleme PDE neliniare şi staţionare
Adaptive solver Pentru probleme ce utilizează reţele redefinite (mai
fine)
5. ANEXE (DOCUMENTATIE DE EXECUTIE, CAIET DE SARCINI, TEME DE
PROIECTARE, BULETINE DE INCERCARI, ATESTARI, CERTIFICARI, ETC.
– DUPA CAZ);
Centrul : Spitalul
(anexa 1) CONSIMTAMANT INFORMAT AL PACIENTULUI
Numarul protocolului de Studiu: 42105/ 2008
Numarul protocolului de etica:
Numarul pacientului pentru identificare:
Titlul proiectului CORELATII CLINICE, ANATOMOPATOLOGICE SI MOLECULARE IN
VEDEREA STABILIRII UNOR MODELE MATEMATICE UTILE IN PREDICTIA EVOLUTIEI
CANCERULUI DE PROSTATA
Numele conducatorului de proiect (CO): dr Camelia Doina Vrabie
Responsabil de Proiect:
Bifati casutele:
1. Confirm ca am citit si am inteles toate datele informative din acest studiu si
am avut posibilitatea sa pun intrebari
ٱ
2. Inteleg ca participarea mea e voluntara si sunt liber sa ma retrag in orice
moment, fara sa motivez, iar ingrijirea medicala si drepturile mele legale nu
vor fi afectate ٱٱ

3. Doresc sa mi se permita accesul la fisele mele medicale pentru a verifica
daca studiul este efectuat correct. Am fost asigurat ca stricta
confidentialitate va fi mentinuta. ٱٱ
4. Inteleg ca orice fragment tisular folosit in acest studiu va fi trimis la un alt
centru . ٱٱ
5. Sunt de acord ca medicul meu de familie sa inregistreze participarea mea in
acest studiu. ٱٱ
6. Inteleg ca mi se preleveaza sange, proba ce poate fi pastrata permanent
ٱٱ
7. Daca vreo modificare genetica cu semnificatie clinica se gaseste in probele
mele si ale rudelor mele in viitor, eu/rudele mele dorim sa fim informati.
ٱٱ
8. Doresc sa las echipa de cercetare sa aiba acces la fisele mele medicale sa
cerceteze alte interventii relevante pe care le-am suferit in trecut precum si
efectul oricarui tratament prescris in viitor. ٱٱ
9. Sunt de acord sa particip la acest studiu. ٱٱ
10. Doresc/ nu doresc sa fiu informat despre rezultatele acestui studiu
ٱٱ
------------------------------- ------------------------ -------------
Nume pacient Data Semnatura
-------------------------------- ----------------------- -------------
Persoana care a obtinut consimt data Semnatura
------------------------------- ------------------- -------------
Conducator de proiect Data Semnatura
O copie pentru pacient, o copie pentru CO, o copie pentru spital/ laborator
(anexa 2) CATRE COMISIA DE ETICA A SPITALULUI ……
Subsemnat dr……, medic primar anatomopatolog in laboratorul de anatomie
patologica a Spitalului ………va aduc la cunostinta urmatoarele.
La Competitia Centrului National Management Programe (CNMP), Programe
Nationale II (PNII/ Parteneriate) din 2008 am castigat un proiect de cercetare cu
tema” CORELATII CLINICE, ANATOMOPATOLOGICE SI MOLECULARE IN VEDEREA

STABILIRII UNOR MODELE MATEMATICE UTILE IN PREDICTIA EVOLUTIEI CANCERULUI DE
PROSTATA”.
Toate analizele si rezultatele acestuia, care se vor lucra in spitalul clinic „Sfantul
Ioan”, la Institutul National de Patologie „Victor Babes”, la Universitatea Bucuresti
(Baza de cercetare cu utilizatori multiplii-Biologie Moleculara), Spitalul Clinic Theodor
Burghele si Institutul National Fundeni, sunt provenite de la fragmente tisulare
prelevate de la pacienti operati in Spital. Subliniez ca Departamentul Anatomie
Patologica al carui Responsabil de Proiect este dr …….impreuna cu echipa sa (din
partea Spital……..”) este furnizor al pieselor operatorii si alte probe biologice ale
pacientilor si rudelor acestora. Va rog respectuos a analiza si aproba de catre
membrii comisiei a posibilitatii de a avea consimtamantul documentat al pacientilor
din aceasta unitate sanitara inclusi in studiu si care au ca diagnostic „tumora
prostata”.
Atasez alaturat varianta de document ce o supun analizei Comisiei.
Data Semnatura/
Responsabil Proiect
O copie pentru pacient, o copie pentru CO, o copie pentru spital/ laborator
Dr

Anexa 3. TABEL PRIVIND PRINCIPALELE DATE CLINICO-PATOLOGICE ALE PACIENTILOR CU
CANCER DE PROSTATA
COD
PACIENT
SI SPITAL
VARSTA RUDE CU
MALIGNITATI/ GRAD
RUDENIE/LOCALIZARE
+ / -
inclusi in studiul proiectului 42-105
TUSEU
RECTAL
SUSPEC
T+/-
NODULI
UNICI/
MULTIPLII
ECHO
TRANSRECTAL
SUSPECT
Anexa 4. EXAMEN IMUNOHISTOCHIMIC/ GRADAREA INTENSITATII IMUNOMARCAJULUI SAU NR CELLULE
IMUNOPOZITIVE LA PACIENTII CU CAP DIN PROIECTUL 42-105
COD PACIENT
SI SPITAL
P63 P53 P504S/
AMACR
+/ -
METASTAZE
DECELATE
LA
INTERNARE
+/ -
VAL
PSA
LIBER/
TOTAL
GRAD
TUMORAL
F(ATIPIE)
G1/ G2/
G3
34ΒE12CK EGFR VEGFR? BRCA1 ALTE
MENTIUNI
Recoltare sange dela pacient si rude (frati, surori, veri,) si de trimis la Universitatea din
Bucuresti, Baza de cercetare cu utilizatori multiplii-biologie moleculara de la cele 3
spitale.
Recoltare fragment tisular pe mediu special si de trimis la Universitatea din Bucuresti,
Baza de cercetare cu utilizatori multiplii-biologie moleculara de la cele 3 spitale.
GRAD
GLEASON=
PATTERN
MAJOR+MINOR

(anexa 5) PROTOCOL PENTRU PROCESARE IMUNOHISTOCHIMIE
MATERIAL BIOLOGIC
- fragmente de tesuturi
- celule ce cresc in monostrat
SOLUTII
- H2O2 0.5%
- Avidina (1mg/ml)
- Biotina (0.1mg/ml)
- Tampon citrat ph 6.0
- Solutie DAB stoc
- Solutie DAB de lucru
- Tampon PBS
- Colorant Hematoxilina
PROCEDURA
1. FIXAREA SI INCLUDEREA IN PARAFINA A TESUTULUI
2. IMBRACAREA LAMELOR CU SOLUTIE DE POLI-L-LIZINA
3. SECTIONAREA
4. PRELUCRAREA LAMELOR PRIN IHC
Deparafinare
Lamele se imerseaza pe rand in:
• Xilen 3 x 10 min.
• Etanol 100% 2 x 10 min.
Rehidratarea tesutului
Lamele se imerseaza pe rand in:
• Etanol 100% 1 x 10 min.
• Etanol 95% 1 x 10 min.
• Etanol 90% 1 x 10 min.
• Etanol 80% 1 x 10 min.
• Etanol 70% 1 x 10 min.
• Apa distilata 1 x 5 min.
Demascare pentru restaurarea antigenica
Lamele se imerseaza intr-un recipient care contine tampon citrat pH 6.0 (la temperatura camerei).
Recipientul se scufunda pe jumatate in apa din baia termostat aflata la 98ºC unde se incubeaza 20 de
minute. Dupa incubare se lasa recipientul la racit circa 10 min. la temperatura camerei apoi lamela se
spala de 2-3 x 5 min. in PBS.
Blocarea peroxidazelor endogene
Lamele se imerseaza in:
• 1.5% H2O2 in metanol (2,5ml H2O2 30% + 47.5 ml apa distilata) 10 min.
• 1 x 5 min. apa distilata
Blocare biotina endogena
• Imersarea lamelor in tampon PBS 1 x 15 min. (tamponul la temperatura camerei)
• Incubare lame cu avidina (1mg/ml) 1 x 20 min.; lama scursa bine si incubata cu 50-100 µl de solutie
• Spalare in PBS rapida pentru inlaturarea grosului de solutie de avidina
• Incubare in PBS 1 x 5min.
• Incubare lame cu 100 µl biotina (0.1mg/ml) 1 x 20 min.
• Spalare in PBS rapida pentru inlaturarea grosului de solutie de biotina
• Incubare in PBS 3 x 5min.

Blocarea legarii nespecifice
• Incubare lame in solutie PBS cu 3% ser de capra 1 x 30 min.
(1.5 ml ser de capra + 48.5 ml PBS)
Aplicarea anticorpului primar
• Lama se scoate din PBS si se sterge usor cu tifon in jurul sectiunii care se delimiteaza cu markerul
• Lama scursa bine se incubeaza cu 100µl de Ac I diluat corespunzator
(10 µg Ac I/ml)
Pentru fiecare anticorp trebuie aplicata o titrare pentru observarea dilutiei optime la care se obtine
cea mai buna evidentiere a antigenului si cel mai mic background.
Incubarea se face in camera umeda, doar pe lama. Pentru incubarea peste noapte sepot utiliza dilutii
mai mari ale Ac I.
• Spalare lame in PBS:
- imersare in PBS de cateva ori pentru indepartarea Ac I si a lamelelor
- imersare PBS 2 x 10 min.
Aplicarea anticorpului secundar
• Lama scursa bine se incubeaza cu 100µl Ac II (GAM-biotinilat) timp de 30 min.
Ac II se dilueaza in PBS 1/100
• Se prepara solutia ABC:
- 1 ml PBS
- 9 µl solutie A; se amesteca bine
- 9 µl solutie B; se amesteca bine si se incubeaza 30 min. la temperatura camerei pentru obtinerea
complexului
• Spalare lame in PBS
- imersare in PBS de cateva ori pentru indepartarea Ac II si a lamelelor
- imersare PBS 2 x 10 min.
Aplicarea solutiei ABC (HRPO-conjugated avidin-biotin complex)
• Lama scursa bine (evita uscarea) se incubeaza cu 100 µl complex ABC pentru 45 min. in camera
umeda
• Spalare lame in PBS
- imersare in PBS de cateva ori pentru indepartarea complexului ABC si a lamelelor
- imersare PBS 2 x 10 min.
Developarea cu solutia DAB
• solutia DAB se prepara extemporaneum folosindu-se alicotele stoc
- 44 ml PBS
- 1 ml DAB stoc
- 375 µl H2O2 0.3%
• se imerseaza lamele in solutia DAB timp de 10 min. monitorizandu-se reactia sub microscop
• stoparea reactiei in apa de robinet (curgere blanda) 10 min.
Contracolorarea cu Hematoxilina
• imersarea lamelor in solutie de hematoxilina 1min., monitorizarea colorarii sub microscop
• virarea culorii prin imersare in apa de robinet 10 min.(curgere blanda)
Deshidratare
• imersare lame in etanol 95% 3 x 3 min.
• imersare lame in etanol 100% 2 x 3 min.

Clarificare
• imersare lame in xilen 2 x 10 min.
Montare in Balsam de Canada (lamele umede)
Anticorpi
Anti- human CD95, APO-1, Fas
Clona APO-1 Dako
Dilutie 1/200
Biotin conjugated goat anti mouse immunoglobulin specific polyclonal antibody
PharMingen International
Dilutie 1/200
Solutie ABC Compplex/HRP
Dako
Anti- human tumor necrosis factor soluble receptor I (sTNF RI)
Clona 16803.1
1/100
(la care ABII tot 1/100)
Sigma
Anexa 6. Protocol de recoltare de produse biologice (sange) de la pacienti si apartinatori
(rude) inrolate in proiectul CAPMAT 42-105 / 2008
Anexa 7. Primeri investigate ca fiind de utilizat pentru MSI in proiectul CAPMAT / 42-105
D13S171
Forward primer: CCTACCATTGACACTCTCAG
Reverse primer: TAGGGCCATCCATTCT
D13S267

Forward primer: GGCCTGAAAGGTATCCTC
Reverse primer: TCCCACCATAAGCACAAG
D13S1493
Forward primer: ACCTGTTGTATGGCAGCAGT
Reverse primer: GGTTGACTCTTTCCCCAACT
D13S1227
Forward primer: AAGCCATCACTGTGTTCCC
Reverse primer: TGCTTGGGTGGAATGC
D17S856
Forward primer: AAGGCAAGACTTCGTCGAGA
Reverse primer: CATTCCCTGGTCCTGTGC
D7S2506
Forward primer: CAGCAGGGCTTGAAATGAAC
Reverse primer: ACACAGTGGAGCTGGCATAG
D7S2542
Forward primer: CCCTTTGGTCACAGTGAGTT
Reverse primer: AAATGGAGTGATTGAATTTTTGT
D7S2550
Forward primer: AAGTTCCATTTGTCTCGGTT
Reverse primer: AGTCTCCTCGTCTCACACCT
D7S499
Forward primer: GCAGGCTCAGTAAGTGGTTG
Reverse primer: CCTAAGTTGGGGATTATCTGTC

D5S663
Forward primer: TTACTGAGATGCAGTCACCTT
Reverse primer: CCTGAAGACATTAATCATGGA
D5S455
Forward primer: TTGGTCAAACCTGATAGGGG
Reverse primer: TTCCCACTTACACTTAGAGCAC
D5S426
Forward primer: AAATTCTTGCTTTCATAGCCA
Reverse primer: AGACTAAATAAAATCACTGCCG
D5S430
Forward primer: TCTGCCCAGCAATTCCATAG
Reverse primer: GGCAAGCAATTTTCACAGTTTT

6. CONCLUZII
Etapa privind elaborarea de protocoale agreate de toti cei sase colaboratori
ai acestui proiect a fost extrem de utila;
Implicarea unitatilor sanitare cu activitate clinica, de diagnostic si cercetare
alaturi de unitati care au ca obiect cercetarea utilizand metode de biologie
moleculara sau modele de biostatistica ce nu sunt accesibile tuturor, s-a
dovedit de un real folos pentru validarea si recunoasterea rezultatelor studiului
de catre toti cei implicati;
Stabilirea comisiilor de etica la nivelul spitalelor, obtinerea acordului acestora,
precum si elaborarea de chestionare pentru pacienti si rude sunt etape
indispensabile oricarui studiu clinic, dar si in procesul valorificarii rezultatelor
stiintifice obtinute;
Trierea pacientilor este un obiectiv foarte important in conditiile in care
echipele de chirurgi din clinicile de Urologie si-au stabilit propriile protocoale
de lucru si de abordare a patologiilor. Sunt Departamente care au
abandonat interventiile mutilante si periculoase in favoarea noilor instrumente
terapeutice. Modalitatea de prelevare va fi consemnata la fiecare partener
participant;
Metodele folosite in histopatologie sunt in general aceleasi pretutindeni, si
consensul a vizat in primul rand gradarea si stadializarea, ca parametri utili in
analiza biostatistica a cazurilor;
Consideram ca documentarea stiintifica a relevat faptul ca markerii
imunohistochimici sunt specifici patologiei investigate, iar metodele
moleculare, aplicate la pacienti si rude, vor fi in masura sa ofere un tablou
privind particularitatile chiar si geografice in CaP;
Modalitatea de prelevare a materialului biologic in cadrul acestui proiect este
foarte importanta dat fiind ca nici o unitate sanitara nu are dotare standard
pentru fragmentele ce vor fi procesate molecular si genetic;

7. BIBLIOGRAFIE;
Albertsen PC, Hanley JA, Fine J. 20-year outcomes following conservative management of clinically
localized prostate cancer. JAMA 2005;293:2095–101.
Bill-Axelson A, Holmberg L, Ruutu M, et al. Radical prostatectomy versus watchful waiting in early
prostate cancer. N Engl J Med 2005;352:1977–84.
Borgstrom I, Bourdon MA, Hillan KJ, et al: Neutralizing anti-vascular endothelial growth factor antibody
completely inhibits angiogenesis and growth of human prostate carcinoma micro tumors in vivo.
Prostate 35:1–10, 1998.
Breier G, Breviario F, Caveda U, et al: Molecular cloning and expression of murine vascular endothelialcadherin
in early stage development of cardiovascular system. Blood 87: 630–641, 1996.
Catalona WJ, Smith DS, Ratliff TL, et al. Detection of organ-confined prostate cancer is increased
through prostate- specific antigen-based screening. JAMA 1993;270: 948–54.
Claffey KP, and Robinson GS: Regulation of VEGFNPF expression in tumor cells: consequences for tumor
growth and metastasis. Cancer Metast Rev 15: 165–176, 1996.
Cooper G., 1984. NESTOR: A Computer-Based Medical Diagnosis that Integrates Causal and
Probabilistic Knowledge, Technical Report HPP-84-48, Stanford University, CA.
Dvorak HF, Detmar M, Claffey KP, et al: Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor:
an important mediator of angiogenesis in malignancy and inflammation. Int Arch Allergy Immunol 107:
233–235, 1995.
Ferrara N: The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis. Breast Cancer
Res Treat 36: 127–137, 1995.
Ferrer FA, Miller U, Andrawis RI, et al: Angiogenesis and prostate cancer: in vivo and in vitro expression of
angiogenic factors by prostate cancer cells. Urology 51: 161–167, 1998.
Ferrer FA, Miller U, Lindquist R, et al: Expression of vascular endothelial growth factor receptors in human
prostate cancer. Urology 54: 567–572, 1999.
Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al: Real time quantitative PCR. Genome Res 6: 986–994,1996.
Henrion M., 1990. Towards Efficient Probabilistic Diagnosis in Multiply Connected Belief Networks, in R.M.
Olivier and J.Q. Smith eds, Influence Diagrams, Belief Nets and Decision Analysis, pp. 385-409, John Wiley
& Sons Ltd., New York.
Hessels D, Klein Gunnewiek JM, van Oort I, et al. DD3(PCA3)-based molecular urine analysis for the
diagnosis of prostate cancer. Eur Urol 2003;44:8–16.
Joseph IB, and Isaacs JT: Potentiation of the antiangiogenic ability of linomide by androgen ablation
involves down- regulation of vascular endothelial growth factor in human androgen- responsive
prostatic cancers. Cancer Res 57: 1054– 1057, 1997.
Joseph IB, Vukanovic J, and Isaacs JT: Antiangiogenic treatment with linomide as chemoprevention for
prostate, seminal vesicle, and breast carcinogenesis in rodents. Cancer Res 56: 3404–3408, 1996.
level < or =4.0 ng per millilitre. N Engl J Med 2004; 350:2239–46.
Marme D: Tumor angiogenesis: the pivotal role of vascular endothelial growth factor. World J Urol
14:166–174, 1996.
McGregor M, Hanley JA, Boivin JF, et al. Screening for prostate cancer: estimating the magnitude of
overdetection. CMAJ 1998;159:1368–72.
Medd JC, Stockler MR, Collins R, et al. Measuring men’s opinions of prostate needle biopsy. ANZ J Surg
2005; 75:662–4.
Melnyk O, Zimmerman M, Kim KJ, et al: Neutralizing antivascular endothelial growth factor antibody
inhibits further growth of established prostate cancer metastases in a preclinical model. J Urol 161: 960–
963, 1999.

Murphy P.K.,2002.Dynamic Bayesian Networks:Representation,Inference and Learning.University of
California Berkeley.
Pearl J. Probabilistic reasoning in intelligent systems. San Mateo, CA: Morgan Kaufman, 1988.
Pearl J., 1986. Fusion, Propagation, and Structuring in Bayesian Networks, Artificial Intelligence, Vol. 28,
pp. 241-288.
Pierce EA, Avery RU, Foley ED, et al: Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor
expression in a mouse model of retinal neovascularization. Proc Natl Acad Sci USA 92: 905–909, 1995.
Postma R, Roobol M, Schroder FH, et al. Lesions predictive for prostate cancer in a screened population:
first and second screening round findings. Prostate 2004;61: 260–6.
Rhodes DR, Sanda MG, Otte AP, Chinnaiyan AM, Rubin MA. Multiplex biomarker approach for
determining risk of prostate-specific antigen-defined recurrence of prostate cancer. J Natl Cancer Inst
2003;95:661–8.
Rocco B, de Cobelli O, Leon ME, et al. Sensitivity and Detection Rate of A 12-Core Trans-Perineal
Prostate Biopsy: Preliminary Report. Eur Urol 2006, in press, doi:10.1016/j.eururo.2005.12.021.
Roddam AW, Duffy MJ, Hamdy FC, et al. Use of prostatespecific antigen (PSA) isoforms for the detection
of prostate cancer in men with a PSA level of 2–10 ng/ml: systematic review and meta-analysis. Eur Urol
2005;48:386– 99.
Roobol MJ, Kranse R, de Koning HJ, et al. Prostate-specific antigen velocity at low prostate-specific
antigen levels as screening tool for prostate cancer: results of second screening round of ERSPC
(ROTTERDAM). Urology 2004; 63:309–13.
Rubin MA, Zhou M, Dhanasekaran SM, Varambally S, Barrette TR, Sanda MG, et al. Alpha-methylacyl
coenzyme A racemase as a tissue biomarker for prostate cancer. J Am Med Assoc 2002;287:1662–70.
Russell PJ, Bennett S, and Stricker P: Growth factor involvement in progression of prostate cancer. Clin
Chem 44: 705–723, 1998.
Santos E., 1991. On the Generation of Alternative Explanations with Implications for Belief Revision, Proc.
Of the Conf. On Uncertainty in A.I., pp. 339-347.
Schmidt-Kittler O, Ragg T, Daskalakis A, Granzow M, Ahr A, Blankenstein TJ, et al. From latent
disseminated cells to overt metastasis: genetic analysis of systemic breast cancer progression. Proc Natl
Acad Sci USA 2003;100:7737–42.
Schouten, J.P., McElgunn. C.J., Waaijer, R., et al, Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by
multiplex ligation-dependent probe amplification, Nucleic Acid Res e57: 30,.2002.
Sellner, L. N., and Taylor, G. R., MLPA and MAPH: New Techniques for Detection of Gene Deletions, Hum
Mutat 23: 413-419, 2004.
Shaffer DR, Scher HI. Prostate cancer: a dynamic illness with shifting targets. Lancet Oncol 2003;4:407–
14.
Sheibani N, and Frazier WA: Thrombospondin-1, PECAM-1, and regulation of angiogenesis. Histol
Histopathol 14: 285–294, 1999.
Singh D, Febbo PG, Ross K, Jackson DG, Manola J, Ladd C, et al. Gene expression correlates of clinical
prostate cancer behavior. Cancer Cell 2002;1:203–9.
Smith LE, Wesolowski E, McLellan A, et al: Oxygeninduced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol
Vis Sd 35:101–111, 1994.
Smith PC, Hobisch A, Lin DL, Culig Z, Keller ET. Interleukin-6 and prostate cancer progression. Cytokine
Growth Factor Rev 2001;12: 33–40.
Sommer A, Haendler B. Androgen receptor and prostate cancer: molecular aspects and gene
expression profiling. Curr Opin Drug Discov Dev 2003;6:702–11.
Song LN, Herrell R, Byers S, Shah S, Wilson EM, Gelmann EP. b-Catenin binds to the activation function 2
region of the androgen receptor and modulates the effects of the N-terminal domain and TIF2 on
ligand-dependent transcription. Mol Cell Biol 2003;23:1674–87.
Srikantan V, Valladares M, Rhim JS, Moul JW, Srivastava S. Hepsin inhibits cell growth/invasion in prostate
cancer cells. Cancer Res 2002;62:6812–6.
Stamey TA, Yang N, Hay AR, et al. Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of
the prostate. N Engl J Med 1987;317:909–16.
Sun M, Yang L, Feldman RI, Sun XM, Bhalla KN, Jove R, et al. Activation of phosphatidylinositol-3-OH
kinase/Akt pathway by androgen. J Biol Chem 2003;278:42992–3000.
Taplin ME, Bubley GJ, Ko YJ, Small EJ, Upton M, Rajeshkumar B, et al. Selection for androgen receptor
mutations in prostate cancers treated with androgen antagonist. Cancer Res 1999;59:2511–5.
Thompson IM, Pauler DK, Goodman PJ, et al. Prevalence of prostate cancer among men with a
prostate-specific antigen
Torres-Rosado A, O’Shea KS, TsujiA, Chou SH, Kurachi K. Hepsin, a putative cell-surface serine protease, is
required for mammalian cell growth. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:7181–5.
Truica CI, Byers S, Gelmann EP. Beta-catenin affects androgen receptor transcriptional activity and
ligand specificity. Cancer Res 2000;60: 4709–13.

Udby L, Cowland JB, Johnsen AH, Sorensen OE, Borregaard N, Kjeldsen L. An ELISA for SGP28/CRISP-3, a
cysteine-rich secretory protein in human neutrophils, plasma, and exocrine secretions. J Immunol
Methods 2002;263:43–55.
Uivak KJ, Marmaro J, and Todd JA: Towards fully automated genomewide polymorphism screening. Nat
Genet 9: 341–342, 1995.
van Gils MP, Stenman UH, Schalken JA, et al. Innovations in serum and urine markers in prostate cancer
current European research in the P-Mark project. Eur Urol 2005; 48:1031–41.
Vanaja DK, Cheville JC, Iturria SJ,Young CY. Transcriptional silencing of zinc finger protein 185 identified
by expression profiling is associated with prostate cancer progression. Cancer Res 2003;63: 3877–82.
Varambally S, Dhanasekaran SM, Zhou M, Barrette TR, Kumar- Sinha C, Sanda MG, et al. The polycomb
group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer. Nature 2002;419:624–9.
Veikkola I, Karkkainen M, Claesson-Welsh U, et al: Regulation of angiogenesis via vascular endothelial
growth factor receptors. Cancer Res 60: 203–212, 2000.
Verger A, Perdomo J, CrossleyM. Modification with SUMO.A role in transcriptional regulation. EMBO Rep
2003;4:137–42.
Welsh JB, Sapinoso LM, Su AI, Kern SG,Wang-Rodriguez J, Moskaluk CA, et al. Analysis of gene expression
identifies candidate markers and pharmacological targets in prostate cancer. Cancer Res 2001;
61:5974–8.
WenY, Hu MC, Makino K, Spohn B, Bartholomeusz G,Yan DH, et al. HER-2/neu promotes androgenindependent
survival and growth of prostate cancer cells through the Akt pathway. Cancer Res
2000;60: 6841–5.
World Health Organization. Technical report, http://www.who.int, http://www.med.hokudai.ac.jp/
seniorw/Oth lec/htele/htele2/006.htm.
Wright ME, Tsai MJ, Aebersold R. Androgen receptor represses the neuroendocrine transdifferentiation
process in prostate cancer cells. Mol Endocrinol 2003;17:1726–37.
Wu Q,Yu D, Post J, Halks-Miller M, Sadler JE, Morser J. Generation and characterization of mice deficient
in hepsin, a hepatic transmembrane serine protease. J Clin Invest 1998;101:321–6.
Yang SH, Jaffray E, Hay RT, Sharrocks AD. Dynamic interplay of the SUMO and ERK pathways in
regulating Elk-1 transcriptional activity. Mol Cell 2003;12:63–74.
Yang XJ, Laven B, Tretiakova M, Blute Jr RD, Woda BA, Steinberg GD, et al. Detection of alphamethylacyl-coenzyme
A racemase in postradiation prostatic adenocarcinoma. Urology 2003;62:282–6.
Zegarra-Moro OL, Schmidt LJ, Huang H, Tindall DJ. Disruption of androgen receptor function inhibits
proliferation of androgenrefractory prostate cancer cells. Cancer Res 2002;62:1008–13.
Zhang L, Johnson M, Le KH, Sato M, Ilagan R, Iyer M, et al. Interrogating androgen receptor function in
recurrent prostate cancer. Cancer Res 2003;63:4552–60.
Zheng SL, Chang BL, Faith DA, Johnson JR, Isaacs SD, Hawkins GA, et al. Sequence variants of alphamethylacyl-CoA
racemase are associated with prostate cancer risk. Cancer Res 2002;62:6485–8.
Zhou M, Chinnaiyan AM, Kleer CG, Lucas PC, Rubin MA. Alphamethylacyl- CoA racemase: a novel
tumor marker over-expressed in several human cancers and their precursor lesions. Am J Surg Pathol
2002;26:926–31.
Zhou M, Jiang Z, Epstein JI. Expression and diagnostic utility of alpha-methylacyl-CoA-racemase (P504S)
in foamy gland and pseudohyperplastic prostate cancer.AmJ Surg Pathol 2003;27:772–8.