1. Raportul Stiintific si Tehnic (RST) in extenso al proiectului cu titlul ...

(anexa 5) PROTOCOL PENTRU PROCESARE IMUNOHISTOCHIMIE
MATERIAL BIOLOGIC
- fragmente de tesuturi
- celule ce cresc in monostrat
SOLUTII
- H2O2 0.5%
- Avidina (1mg/ml)
- Biotina (0.1mg/ml)
- Tampon citrat ph 6.0
- Solutie DAB stoc
- Solutie DAB de lucru
- Tampon PBS
- Colorant Hematoxilina
PROCEDURA
1. FIXAREA SI INCLUDEREA IN PARAFINA A TESUTULUI
2. IMBRACAREA LAMELOR CU SOLUTIE DE POLI-L-LIZINA
3. SECTIONAREA
4. PRELUCRAREA LAMELOR PRIN IHC
Deparafinare
Lamele se imerseaza pe rand in:
• Xilen 3 x 10 min.
• Etanol 100% 2 x 10 min.
Rehidratarea tesutului
Lamele se imerseaza pe rand in:
• Etanol 100% 1 x 10 min.
• Etanol 95% 1 x 10 min.
• Etanol 90% 1 x 10 min.
• Etanol 80% 1 x 10 min.
• Etanol 70% 1 x 10 min.
• Apa distilata 1 x 5 min.
Demascare pentru restaurarea antigenica
Lamele se imerseaza intr-un recipient care contine tampon citrat pH 6.0 (la temperatura camerei).
Recipientul se scufunda pe jumatate in apa din baia termostat aflata la 98ºC unde se incubeaza 20 de
minute. Dupa incubare se lasa recipientul la racit circa 10 min. la temperatura camerei apoi lamela se
spala de 2-3 x 5 min. in PBS.
Blocarea peroxidazelor endogene
Lamele se imerseaza in:
• 1.5% H2O2 in metanol (2,5ml H2O2 30% + 47.5 ml apa distilata) 10 min.
• 1 x 5 min. apa distilata
Blocare biotina endogena
• Imersarea lamelor in tampon PBS 1 x 15 min. (tamponul la temperatura camerei)
• Incubare lame cu avidina (1mg/ml) 1 x 20 min.; lama scursa bine si incubata cu 50-100 µl de solutie
• Spalare in PBS rapida pentru inlaturarea grosului de solutie de avidina
• Incubare in PBS 1 x 5min.
• Incubare lame cu 100 µl biotina (0.1mg/ml) 1 x 20 min.
• Spalare in PBS rapida pentru inlaturarea grosului de solutie de biotina
• Incubare in PBS 3 x 5min.