1. Raportul Stiintific si Tehnic (RST) in extenso al proiectului cu titlul ...

Blocarea legarii nespecifice
• Incubare lame in solutie PBS cu 3% ser de capra 1 x 30 min.
(1.5 ml ser de capra + 48.5 ml PBS)
Aplicarea anticorpului primar
• Lama se scoate din PBS si se sterge usor cu tifon in jurul sectiunii care se delimiteaza cu markerul
• Lama scursa bine se incubeaza cu 100µl de Ac I diluat corespunzator
(10 µg Ac I/ml)
Pentru fiecare anticorp trebuie aplicata o titrare pentru observarea dilutiei optime la care se obtine
cea mai buna evidentiere a antigenului si cel mai mic background.
Incubarea se face in camera umeda, doar pe lama. Pentru incubarea peste noapte sepot utiliza dilutii
mai mari ale Ac I.
• Spalare lame in PBS:
- imersare in PBS de cateva ori pentru indepartarea Ac I si a lamelelor
- imersare PBS 2 x 10 min.
Aplicarea anticorpului secundar
• Lama scursa bine se incubeaza cu 100µl Ac II (GAM-biotinilat) timp de 30 min.
Ac II se dilueaza in PBS 1/100
• Se prepara solutia ABC:
- 1 ml PBS
- 9 µl solutie A; se amesteca bine
- 9 µl solutie B; se amesteca bine si se incubeaza 30 min. la temperatura camerei pentru obtinerea
complexului
• Spalare lame in PBS
- imersare in PBS de cateva ori pentru indepartarea Ac II si a lamelelor
- imersare PBS 2 x 10 min.
Aplicarea solutiei ABC (HRPO-conjugated avidin-biotin complex)
• Lama scursa bine (evita uscarea) se incubeaza cu 100 µl complex ABC pentru 45 min. in camera
umeda
• Spalare lame in PBS
- imersare in PBS de cateva ori pentru indepartarea complexului ABC si a lamelelor
- imersare PBS 2 x 10 min.
Developarea cu solutia DAB
• solutia DAB se prepara extemporaneum folosindu-se alicotele stoc
- 44 ml PBS
- 1 ml DAB stoc
- 375 µl H2O2 0.3%
• se imerseaza lamele in solutia DAB timp de 10 min. monitorizandu-se reactia sub microscop
• stoparea reactiei in apa de robinet (curgere blanda) 10 min.
Contracolorarea cu Hematoxilina
• imersarea lamelor in solutie de hematoxilina 1min., monitorizarea colorarii sub microscop
• virarea culorii prin imersare in apa de robinet 10 min.(curgere blanda)
Deshidratare
• imersare lame in etanol 95% 3 x 3 min.
• imersare lame in etanol 100% 2 x 3 min.