1. Raportul Stiintific si Tehnic (RST) in extenso al proiectului cu titlul ...

Hematoxilina se prezintă sub formă de cristale galben-brune solubile în apă, alcool, glicerină.
Adevăratul colorant nu este hematoxilina ci produsul său de oxidare, hematina. Pentru
obţinerea acestuia se oxidează hematoxilina cu diverse substanţe (permaganat de potasiu,
hidroxid de potasiu) sau substanţa a fost lăsată să se matureze în aer. Ea colorează specific
nucleii sau substanţele anionice în albastru sau în negru. În prealabil colorantul a fost mordasat,
mordantul acţionând în general în acelaşi timp cu acesta. Amestecul în care sunt conţinute
atât mordantul cât şi colorantul se numeşte în funcţie de mordant (aluminiu, fier, crom). Se
disting diverse tipuri de hematoxilină: aluminică sau hemalaum, ferică, cromică, etc. În
proiectul de faţă vom folosi coloraţia hemalaun Meyer.
În practica medicală, un diagnostic anatomopatologic precis şi complet stă la baza unei
strategii terapeutice ţintite şi eficiente. Criteriile diagnosticului histopatologic au rămas mai mult
sau mai puţin nemodificate din timpul lui Virchow şi coloraţia cea mai utilizată este încă
hematoxilină-eozină. Utilizând exclusiv tehnicile convenţionale de microscopie optică în
examenul histopatologic concordanţa diagnostică poate uneori să nu depăşească 75% chiar
la experţii în domeniu.
Imunohistochimia este o tehnică pentru identificarea constituenţilor celulari sau tisulari prin
reacţii antigen-anticorp, situl legăturii cu anticorpul fiind identificat fie prin marcarea directă a
anticorpului, fie printr-o metodă secundară de marcare.
Mai ales în ultimii 10 ani, imunohistochimia a devenit metoda calitativă cea mai valoroasă
alături de anatomia patologică convenţională permiţând o analiză structurală, topografică şi
fenotipică. Ea utilizează criteriul molecular în diagnosticul histopatologic cu impact imediat
asupra studiului histogenezei, diferenţierii, clasificării şi progresiunii tumorale.
Aceste tehnici se bazează pe legătura antigen tisular.anticorp, acesta din urmă fiind
evidenţiat prin conjugare directă cu molecule trasoare (reacţie directă) sau prin intermediul
unui lanţ de alte legături cu anticorpi liberi sau marcaţi (reacţie indirectă cu două sau mai
multe faze).
Tehnica de lucru:
• secţiunile de 2 microni grosime deparafinate vor fi spălate într-un tampon fosfatsalin
ph=7 (PBS)
• secţiunile se incubează apoi timp de 20 de minute cu ser normal pentru legarea
situsurilor nespecifice, după care se aplică anticorpul primar în diluţia de lucru şi se incubează
peste noapte
• a doua zi se spală în PBS timp de 20 de minute şi se incubează cu anticorpul
secundar drept punte (30 de minute) şi apoi cu complexul avidină-biotină (ABC) 45 de minute
(kit Vector, Burlingame SUA)
• după spălare în apă curentă se developează într-o soluţie de diaminobenzidină
(DAB) 10mg în 88ml PBS şi 0,025% apă oxigenată. DAB scindată de peroxidaza liberă din
complexul ABC produce un precipitat de culoare brună localizând net antigenul căutat, fie în
citoplasmă fie în nucleu
• Contracolorarea nucleară: hemalaun Mayer
• Deshidratare
• Clarificare
• Montare în balsam de Canada.
(B) RAPORT TEHNIC PRIVIND PRINCIPALELE METODE MOLECULARE UTILIZATE
Din probele de sange si de tesut tumoral de la rude si respectiv pacientii cu
neoplasm prostatic se va extrage ADN si ARN utilizand kit-uri dedicate si foarte
scumpe. Materialul genetic va fi ulterior utilizat in tehnici care urmaresc evaluarea
modificarilor la nivelul structurii materialului genetic (ADN) care vor fi corelate cu
evaluarea modificarii expresiei genice. Partenerul CO din proiectul CAPMAT isi asuma
obligatia realizarii urmatoarelor tipuri de tehnici: Secventiere, MLPA, LOH, MSI,
identificare SNP-uri prin microarray, CGH si CGH-array, care vor fi corelate cu