Tillverkning av DNA-konstrukt med hjälp av enzymatiska metoder

konstruera samt verifiera DNA-konstrukten. En av teknikerna som frekvent användes var gelelektrofores,
där DNA-molekyler separeras efter storlek, för att verifiera laborativa moment. I följande
avsnitt förklaras därför DNA-molekylens uppbyggnad följt av för projektet viktiga enzymatiska
reaktioner samt teorin bakom de använda metoderna.
2.1 DNA-molekylens uppbyggnad
DNA består av repeterande nukleotider som utgörs av en deoxyribos, en fosfatgrupp och en av
kvävebaserna adenin (A), cytosin (C), tymin (T) och guanin (G) [9]. Deoxyribosmolekylen och
fosfatgruppen binds samman via fosfodiesterbindningar mellan fosfat- och hydroxylgruppen på två
närliggande nukleotider, och tillsammans utgör de ryggraden för en DNA-sträng. Uppbyggnaden
av DNA-molekylen illustreras i Figur 2-1.
O
- O
P
5'
O
O
O
- O
4'
3'
P
5'
O
O
O
4'
3'
2'
1'
O
O
N
N
N
1'
2'
N
C
A
H 2N
NH 2
N
O
N
Figur 2-1: Detaljerna i en DNA-helixstruktur. DNA-helixen består av en negativt laddad ryggrad
(svart) hydrofoba kvävebaser (grönt respektive blått). Ryggraden består av en fosfatgrupp och en sockermolekyl
som sammanlänkas via fosfodiesterbindningar. Det som sammanlänkar två olika ryggrader är de
hydrofoba kvävebaserna adenin (A), tymin (T), cytosin (C) och guanin (G) som binder till varandra via
vätebindningar. Guanin och adenin (grönt) är puriner som består av två heterocykler. Tymin och cytosin
(blått) är pyrimidiner vilka består av en heterocykel. Guanin binder till cytosin via tre vätebindningar och
adenin binder till tymin via två vätebindningar.
De fyra olika kvävebaserna delas in i två klasser, puriner och pyrimidiner [9]. Adenin och
guanin är puriner som består av två heterocykler. Tymin och cytosin är pyrimidiner som består
av en heterocykel. Två DNA-strängar sammanlänkas via vätebindningar mellan en purin och en
pyrimidin enligt regeln adenin binder till tymin och guanin binder till cytosin, vilket kallas för
komplementär basparning, se Figur 2-1. Guanin binder starkare till cytosin är vad adenin binder
till tymin. Anledningen till detta är att guanin sammanlänkas med cytosin via tre vätebindningar
medan adenin sammanlänkas till tymin via två vätebindningar.
Det sätt som nukleotiderna är sammanlänkade på resulterar i att DNA-strängen får en kemisk
polaritet [9]. Ena änden, 3’-änden, har en hydroxylgrupp på deoxyribosmolekylens 3’-kol och andra
änden, 5’-änden, har en fosfatgrupp på 5’-kolet hos deoxyribosmolekylen. Per definition anges alltid
riktningen hos en DNA-sträng från 5’- till 3’-änden, vilket är den riktning som DNA-sekvenser
elongeras naturligt i cellen. Två enkelsträngade DNA-molekyler hybridiserar till varandra antiparallellt
via vätebindningar mellan respektive DNA-molekyls baser. Dessa bindningar och andra
typer av intermolekylär växelverkan ger upphov till den dubbelsträngade DNA-helixen.
De negativt laddade syreatomerna i fosfatgrupperna gör ryggraden hydrofil medan kvävebaserna
är hydrofoba [9]. I vatten, ett polärt medium, sker så kallad stacking där den hydrofila
4
O
HN
O
N
H
NH 2
O
G
T
N
N
N
1'
N
1'
2'
O
2'
O
O
O
O
3'
4'
O
3'
O
P
4'
P
5'
5'
O -
O
O -
O