Tillverkning av DNA-konstrukt med hjälp av enzymatiska metoder

5.5 Analys av kärnan med överlappssekvenser
Resultatet från de absorbansmätningar som utfördes i temperaturintervallet 15-90 ◦ C för att verifiera
hybridisering av kärnsekvenserna tyder på att hybridisering av kärnsekvensen inte har skett,
se Figur 5-10. Nerkylningen från 90 ◦ C till 15 ◦ C samt den upprepande cykeln visade samma resultat
(visas ej i figur). I graferna presenteras den uppmätta absorbansen för proverna innehållandes
DNA-sekvenserna RE-komplement, RE-oligo samt provet innehållandes båda enkelsträngarna som
funktion av temperaturen.
Absorbans
1.25
1.2
1.15
1.1
1.05
1
0.95
RE Oligo
RE Komplement
RE Oligo + RE Komplement
0.9
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatur (°C)
Figur 5-10: Absorbansmätning under temperaturintervallet 15-90 ◦ C. Absorbansen plottad mot
temperaturen för prov innehållandes RE-oligo, RE-komplement samt RE-komplement tillsammans med
RE-oligo. Notera att proven innehållandes RE-oligo, RE-komplement samt provet innehållandes både REoligo
och RE-komplement har samma kurvatur.
Experimentet tyder på att hybridisering av kärnsekvensen inte har skett då de tre smältkurvornas
utseende inte skiljer sig nämnvärt åt. Provet innehållandes både RE-komplement och RE-oligo
uppför sig på samma sätt under temperaturintervallet som de båda enkelsträngarna var för sig.
Absorbansen för de tre proverna ökar med ungefär 10-20 % under temperaturökningen, vilket kan
förklaras med att det finns sekundärstrukturer i sekvenserna för RE-oligo och RE-komplement.
Det ska även poängteras att smältkurvsanalyserna inte utförts under samma betingelser, se avsnitt
4.3.7, som vid hybridiseringen av proverna vid framställningen av DNA-konstrukten. Lösningen
som användes i smältkurvsanalysen i Figur 5-10 innehöll färre komponenter men då proverna inte
hybridiserat under dessa förhållandena i smälkurvsanalysen så antas de inte heller hybridisera i
lösningen som DNA-konstrukten skulle framställas i.
5.6 Analys av design av oligonukleotider
Då smältkurvorna tydde på att ingen hybridisering skett undersöktes sekvenserna hos kärnan för
att kontrollera så att de från början var korrekt designade. Vad som då uppdagades var att kärnans
sekvenser var parallellt komplementära istället för antiparallellt komplementära. Kärnsekvensen i
RE-komplementet har designats felvänd men beställts syntetiserad med den korrekta överlappssekvensen,
se Figur 5-11. Upptäckten betydde i sin tur att kärnsekvenserna hos RE-oligo och
RE-komplement ej kunnat hybridisera och därmed har inte ett korrekt DNA-konstrukt kunnat
skapas. Slutsatsen påverkar dock inte de tidigare analyserna som utförts på DNA-handtagen.
24