Tillverkning av DNA-konstrukt med hjälp av enzymatiska metoder
Tillverkning av DNA-konstrukt med hjälp av enzymatiska metoder
Tillverkning av DNA-konstrukt med hjälp av enzymatiska metoder
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Sammandrag<br />
Mekaniska studier <strong>av</strong> enskilda <strong>DNA</strong>-molekyler i en optisk pincett har visat att vid ett<br />
kraftintervall nära 65 pN genomgår dubbelsträngat <strong>DNA</strong> en fas <strong>av</strong> reversibel bistabilitet,<br />
vilket innebär att dess konformation alternerar mellan B- och S-form. Kraftintervallet varierar<br />
dock mellan mätningar <strong>av</strong> olika “individer” <strong>av</strong> samma <strong>DNA</strong>-molekyl, vilket antas bero på<br />
att längden <strong>av</strong> de befintliga <strong>DNA</strong>-handtagen på cirka 40 baser är för kort. När dessa <strong>DNA</strong>handtag<br />
används i den optiska pincetten förmodas de orsaka så kallade ändeffekter. Av den<br />
anledningen var projektets syfte att tillverka <strong>DNA</strong>-handtag för att dels minimera eventuella<br />
ändeffekter och dessutom studera den reversibla bistabiliteten. Ett cirkulärt enkelsträngat<br />
genom från bakteriofagen ΦX174 bestående <strong>av</strong> 5386 baser användes som utgångsmaterial till<br />
<strong>DNA</strong>-handtagen.<br />
Problemställningen bestod inledningsvis i att erhålla linjära <strong>DNA</strong>-molekyler från det cirkulära<br />
ΦX174-genomet. Dessa skulle därefter hybridiseras och ligeras till den dubbelsträngade<br />
<strong>DNA</strong>-molekylen <strong>av</strong> intresse. Dessutom behövde de linjära <strong>DNA</strong>-molekylerna märkas in <strong>med</strong><br />
affinitetstaggar för att kunna fästas till polystyrenkulor. Slutligen skulle det tillverkade <strong>konstrukt</strong>et<br />
analyseras i den optiska pincetten.<br />
Den slutgiltiga verifikationen <strong>av</strong> de framställda <strong>DNA</strong>-<strong>konstrukt</strong>en visade att då kraften<br />
60 pN applicerades på <strong>DNA</strong>-<strong>konstrukt</strong>en gick kraften snabbt ner till 0 pN. Kraftminskningen<br />
tyder på att <strong>DNA</strong>-<strong>konstrukt</strong>et inte längre var sammanlänkat mellan de båda polystyrenkulorna.<br />
Där<strong>med</strong> kunde fenomenet reversibel bistabilitet inte studeras. Det kunde däremot bekräftas,<br />
då det gick att applicera en kraft på <strong>konstrukt</strong>et, att de tillverkade <strong>DNA</strong>-handtagen var<br />
betydligt längre än de tidigare använda.<br />
Anledningen till att den reversibla bistabiliteten aldrig kunde studeras antas bero på att<br />
kärnsekvensen inte hybridiserade. Att det ändå applicerats kraft på långa enkelsträngade<br />
<strong>DNA</strong>-molekyler i den optiska pincetten antas bero på att <strong>DNA</strong>-handtagen hybridiserade <strong>med</strong><br />
varandra.<br />
i
Change language