Tillverkning av DNA-konstrukt med hjälp av enzymatiska metoder

J Verifikation för att linjära DNA-molekyler erhållits från
virusgenom
I Tabell J-1 visas innehåll i de olika brunnarna på denaturerande 5 % polyakrylamidgel vid verifikation
av att linjära DNA-molekyler erhållits. Proverna RE1, RE2, PCR1 och PCR2 är prov från
Bilaga G samt Bilaga I.
Tabell J-1: Följande prov laddades på en denaturerande 5 % polyakrylamidgel.
Provnummer Innehåll
1 1µl ΦX174 (312 pmol DNA-bas)
1µl 6X Orange DNA Loading Dye
8 µl formamid
2 0, 2 µl RE1 (256 pmol DNA-bas)
1 µl 6X Orange DNA Loading Dye
8, 8 µl formamid
3 0, 2 µl RE2 (256 pmol DNA-bas)
1 µl 6X Orange DNA Loading Dye
8, 8 µl formamid
4 0, 28 µl PCR1 (200 pmol DNA-bas)
1 µl 6X Orange DNA Loading Dye
8, 72 µl formamid
5 0, 38 µl PCR2 (238 pmol DNA-bas)
1 µl 6X Orange DNA Loading Dye
8, 62 µl formamid
Koncentrationsbestämning av PCR-produkt
För verifikationen av de linjära DNA-fragmenten behövdes DNA-provernas koncentration, dessa
presenteras i Tabell J-2.
Tabell J-2: Koncentration innan och efter PCR. Koncentrationer av DNA som uppnåddes från
de två PCR-proverna, där det cirkulära ΦX174-genomet användes som templat med vardera Primer1
och Primer2. Notera att cirka tio linjära produkter per substrat skapades under rådande betingelser.
Startkoncentrationen av ΦX174-genom erhölls av tillverkaren (1000 µg/ml).
Komponent Mängd DNA
(ng/µl)
Beräknad
mängd
DNAmolekyler
(pmol/µl)
Beräknad
mängd
DNA-bas
(pmol/µl)
Koncentration DNA innan PCR 20 0,01 62
PCR produkt Primer1 229,15 0,13 715
PCR produkt Primer2 201 0,12 627
40