Tillverkning av DNA-konstrukt med hjälp av enzymatiska metoder

Innehåll
1 Inledning 1
1.1 Syfte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Problemställning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Avgränsningar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2 Teori 3
2.1 DNA-molekylens uppbyggnad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.2 Modifieringar av DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2.1 Restriktionsenzym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2.2 DNA-ligas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2.3 DNA-polymeras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2.3.1 Thermus aquaticus polymeras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2.3.2 Terminal deoxynukleotidyltransferas . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.4 Affinitetskomplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.4.1 Digoxigenin och anti-digoxigenin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2.4.2 Biotin och streptavidin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3 Grundläggande teori om metoder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3.1 Polymeraskedjereaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.3.2 Gelelektrofores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.3.2.1 Polyakrylamidgel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3.2.2 Agarosgel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3.2.3 Infärgning av DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3.3 Spektrometri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.3.4 Optisk pincett . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3 Material 10
4 Metod 10
4.1 Standardutföranden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
4.1.1 Beredning av denaturerande och icke-denaturerande polyakrylamidgel . . . 10
4.1.2 Beredning av agarosgel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.1.3 Infärgning med Sybrgold och gelscanning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.1.4 Rening av DNA-prov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.2 Förberedande experiment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.2.1 Förinfärgning och koncentrationsbestämning av Sybrgold på agarosgel . . . 11
4.2.2 Val av gel för att separera cirkulärt från linjärt ΦX174-genom . . . . . . . . 12
4.3 Metoder specifika för projektet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
4.3.1 Design av oligonukleotider . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.3.2 Från cirkulärt till linjärt virusgenom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.3.2.1 RE-metoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.3.2.2 PCR-metoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.3.3 Verifiering av linjära DNA-sekvenser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.3.4 Inmärkning med biotin och DIG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.3.5 Tillagd rening av DNA-prov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.3.6 Titrering för att verifiera inmärkning av affinitetstaggar . . . . . . . . . . . 14
4.3.7 Hybridisering av DNA-konstrukt med RE-handtag . . . . . . . . . . . . . . 15
4.3.8 Ligering av DNA-konstrukt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.3.9 Sträckning av DNA-konstrukt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.3.10 Analys av sekundärstrukturer i DNA-handtagen . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.3.10.1 Undersökning av hybridisering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
v