inme olgularında protrombin gen mutasyonlarının rolü - Süleyman ...

38EDTA’lı tüpe 3 ml venöz kan örneği alındı. DNA izole edilerek multipleks polimerazzincir reaksiyonu yöntemi ile bu mutasyonların gen dizileri invitro olarak çoğaltıldı.Revers insitu hibridizasyon yöntemi ile "Cardiovaskuler Diseas Strip Assay" (ViennaLab, Austria) kiti kullanılarak mutasyonlar çalışıldı.DNA izolasyonu"Invisorb Spin Blood Mini" (İnvitek, Berlin) kiti kullanılarak, sırası ileaşağıdaki işlemler gerçekleştirilerek yapıldı.1. EDTA’lı kan örneklerinden 1.5 ml’lik tüplere 200 µl koyuldu, üzerine 200µl lizis buffer A eklendi.2. Örneklerin üzerlerine 20 µl proteinaz K koyuldu, vortekslenip 56 °C’determomikserde (Thermo-Rock, Sweden) 10 dakika inkübe edildi.3. İnkübasyondan sonra tüplerin içine 400 µl binding buffer B6 konulup,vortekslendi.4. Spinfilter (süzgeç) 2 ml’lik başka ependorflara yerleştirildi. Numunelerinhepsi bu ependorflara pipetlendi ve bir dakika inkübe edildi. 12.000 rpm deiki dakika santrifüj edildi. Altta kalan sıvı atılıp, spinfilterlar içindekimateryalle birlikte yeni bir 2 ml’lik ependorfa yerleştirildi.5. Örneklerin üzerine 500 µl lik wash buffer I koyuldu ve 12.000 rpm de birdakika santrifüj edildi. Altta kalan sıvı atılıp, spinfilterlar tekrar içindekimateryalle birlikte yeni bir 2 ml’lik ependorfa yerleştirildi.6. Örneklerin üzerine 800 µl wash buffer II koyuldu. 12.000 rpm de bir dakikasantrifüj edildi. Alttaki sıvı döküldü ve son hızda dört dakika tekrarsantrifüj edildi.7. Spinfilterler içlerindeki materyalle birlikte 1.5 ml lik ependorflarayerleştirilip, üzerlerine 200 µl elution buffer D konuldu ve bir dakikainkübe edildi. 10.000 rpm de bir dakika santrifüj edildi. Altta kalanmateryal (DNA) -20 °C de saklandı.Protrombotik genler için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemiFaktör V, MTHFR, Protrombin, PAI-1, ß-Fibrinojen, Faktör XIII ve HPA genzincirlerine çift primerler kullanılarak PCR multipleks tekniği ile invitro amplifikasyonyapılmıştır.