Подсекция «Антропология

Среди огромного разнообразия данных о пространственной структуре водорастворимых
белков в Protein Data Bank данные о МБ составляют лишь 1% от общего числа. Главным
образом, это связано с отсутствием эффективных технологий получения МБ. Наработка
каждого нового функционально-активного МБ в количествах, достаточных для физикохимических
методов исследования, является значимым событием для структурных биологов.
Для разработки эффективных методик получения МБ были выбраны белки семейства
KCNE (KCNE1, dKCNE1 – укороченный вариант KCNE1, KCNE3), длина которых
варьируется от 103 до 123 а.о. Эти белки содержат один трансмембранный сегмент и
взаимодействуют с α-субъединицами потенциал зависимых калиевых каналов.
Формирование стабильных комплексов приводит к изменению таких свойств каналов, как
проводимость, селективность, потенциалы активации, деактивации и инактивации,
чувствительность к лекарственным препаратам и др.
Для достижения высокого уровня экспрессии каждого из генов целевых белков собраны
различные конструкции. В случае KCNE1 использована прямая система экспрессии. Для
очистки белка на 3'- конце гена KCNE1 предусмотрена нуклеотидная последовательность,
кодирующая шесть гистидинов (гистидиновый таг). В случае dKCNE1 и KCNE3 применена
гибридная система экспрессии. В качестве белка партнера выбран тиоредоксин E. coli.
Гибридные конструкции содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие:
тиоредоксин, гистидиновый таг, сайт расщепления высокоспецифичной протеиназы
(энтерокиназы в случае dKCNE1 и тромбина в случае KCNE3) и гибкие линкеры. Собранные
гены клонированы в экспрессионный вектор pGEMEX-1 под контроль Т7 промотора.
Процесс культивирования рекомбинантных штаммов (BL21(DE3)pLysS) оптимизирован для
«богатой» и «бедной» сред (TB и М9, соответственно). Процесс очистки dKCNE1 и KCNE3
включает следующие основные стадии: металл-хелатная аффинная хроматография (МХАХ),
гидролиз гибридного белка, повторная МХАХ и дополнительная хроматография
(ионообменная – в случае dKCNE1; гидрофобная – в случае KCNE3). Очистка KCNE1
проведена с использованием МХАХ и гидрофобной хроматографии. Итоговый выход для
всех белков и их 15 N-, 15 N- 13 C- производных составляет не менее 10 мг/л культуры. На
данный момент предложенный способ экспрессии генов и очистки МБ уже позволил
получить структурную информацию о KCNE3, что свидетельствует в пользу высокого
качества полученных по представленной технологии белковых препаратов.
Авторы выражают благодарность к.б.н. А.А. Шульге , к.б.н. Я.С. Ермолюку, к.х.н. Р.В.
Тихонову, к.х.н. Э.В. Бочарову, д.х.н. А.С. Арсеньеву и акад. М.П. Кирпичникову за
консультации, помощь и финансирование при проведении настоящей работы; поддержке
грантов РФФИ и Российского Федерального Агентства по Науке и Инновациям.
Бактериальный синтез и очистка трансмембранных фрагментов рецепторных
тирозинкиназ для структурно-функциональных исследований
Гончарук М.В., Гончарук С.А. (Москва, goncharuki@gmail.com)
Рецепторные тирозинкиназы занимают центральное место в ключевых процессах
жизнедеятельности клетки. Трансмембранные (ТМ) домены участвуют в гомо- и
гетеродимеризации этих белков. Значительная часть современных лекарственных
препаратов направлена на рецепторные протеин киназные системы, однако детальные
механизмы функционирования последних до конца не изучены. Понимание аспектов,
связанных с ролью ТМ доменов в активации и функционировании рецепторных
тирозинкиназ, расшифровка их пространственной структуры поможет понять на
молекулярном уровне процессы, происходящие в живой клетке и заложит основу
рационального дизайна лекарственных препаратов нового поколения.
Для исследования выбраны рецепторы эпидермального фактора роста (ErbB2, ErbB4) и
рецептор фактора роста фибробластов в норме (FGFR3) и патологии (с точечными
мутациями G380R и A391E). Разработана методика препаративного бактериального
получения ТМ доменов этих белков (ТМ пептидов), а также их 15 N-, 15 N- 13 C- меченых
производных для структурно-функциональных исследований. Синтетические гены ТМ
пептидов экспрессированы в составе с тиоредоксином А Escherichia coli (TrxA).
18