Подсекция «Антропология

использовали раффинозу (α1→6 и α1→2 связи), целлобиозу (β1→4), мальтозу (α1→4),
лактозу (β1→4), ИС-гликозид и α-метил-β-D-глюкозид в концентрациях 10 -10 мМ. Было
показано, что фермент проявлял наибольшую активность, расщепляя ИС-гликозида
(Кm=0,58 мМ). β-Глюкозидаза не расщепляла раффинозу, лактозу и мальтозу, но проявляла
высокую активность в присутствие α-метил-β-D-глюкозида (Кm=0,76 мМ). При анализе
зависимости активности фермента от величины рН среды, V=f(pH) определили значения рК
ионогенных групп белка, участвующих в акте катализа. Они соответствуют рК1 4,3 (близко
карбоксильной группе) и рК2 6,4 (имидазола гистидина (рК=5,6-7,0). Расчеты величины
ΔН оказались равными 5,6 кДж·моль -1 и 33,9 кДж·моль -1 , что соответствовало теплоте
ионизации карбоксильной группы и имидазольной группы. Фотоинактивация фермента в
присутствии метиленового синего и ДЭПК (10 -6 М) доказали наличие имидазольной группы
гистидина в активном центре фермента. Полученные результаты по изучению свойств
цитоплазматической β-глюкозидазы растений гороха показали, что фермент обладает
высокой специфичностью к типу расщепляемой связи субстратов и гидролизует только
β1→4 связи, отщепляя β-глюкопиранозильные остатки. В разрыве гликозидной связи
субстратов принимают участие карбоксильная группа глутаминовой либо аспарагиновой
кислот и имидазольная группа гистидина.
Использование моноклональных антител к α1-субъединице Na,K-АТФазы
в исследованиях механизмов адаптации фермента
в почках гибернирующих сусликов Spermophilus udulatus
Басевич Евгений Викторович (Москва, basevichev@mail.ru)
Состояние гипотермии, наблюдаемое у некоторых мелких млекопитающих в холодное
время года, позволяет выживать в условиях недостатка кормов и воды. Зимняя спячка
(гибернация) наступает из-за десяти- или даже стократного снижения уровня метаболизма
относительно нормотермии, обеспечивающего энергосбережение. Однако и при вялом
обмене веществ сохраняется необходимость периодически выводить накапливающиеся
метаболиты при кратковременных пробуждениях. Таким образом, выделительная система во
время гибернации функционирует в замедленном режиме, а основным потребителем АТФ в
почках является Na,K-АТФаза.
Ранее показано, что при гибернации активность микросомальной Na,K-АТФазы из почек
сусликов при 37°С снижается в 2–3 раза (Charnock, 1978; MacDonald, 1999; Басевич, 2008).
В литературе высказывались предположения, что снижение активности Na,K-АТФазы
связано с уменьшением содержания фермента в почках, однако убедительных доказательств
приведено не было (Charnock, 1978). Поэтому в настоящей работе мы оценили количество
Na,K-АТФазы в микросомальных препаратах по содержанию каталитической
α1-субъединицы, единственной присущей почечной ткани. Так, методом иммуноблоттинга
с использованием моноклональных антител к α1-субъединице Na,K-АТФазы с широкой
межвидовой специфичностью (Clone C464.6, Millipore 05-369) показано, что при гибернации
интенсивность белковой полосы с массой 102 кДа (мономер α-субъединицы) снижается на
25% (p0,15). Таким образом, на фоне стабильного содержания
клеточного белка актина, количество Na,K-АТФазы при гибернации уменьшается на
четверть, что, однако, не объясняет описанное падение активности фермента в 2–3 раза.
Причиной снижения активности Na,K-АТФазы в почках сусликов при гибернации может
быть агрегация фермента, описанная ранее для Ca-АТФазы саркоплазматического
ретикулума скелетных мышц сусликов, активность которой в условиях гипотермии
снижалась более чем в 2 раза (Малышева, 2001). Для оценки олигомерного состояния
Na,K-АТФазы исследуемые препараты были обработаны с разной длительностью инкубации
при 37°С сшивающим агентом о-фенантролином в комплексе с ионами меди,
катализирующим образование ковалентных S–S-связей между близко расположенными
молекулами белков. Наблюдалось прогрессивное уменьшение интенсивности полосы
мономерной формы α-субъединицы Na,K-АТФазы и появление полос олигомеров,
44