Подсекция «Антропология

Микрохирургия преимплантационных эмбрионов
при помощи системы лазерный скальпель – лазерный пинцет
Храмова Ю.В., Сергеев С.А., Ракитянский М.М. (Москва, yul.khramova@gmail.com)
Микрохирургия является важной частью работы с преимплантационными эмбрионами и
применяется как в эксперименте, так и в клинической практике. Микрохирургические
операции производят на эмбрионах на стадиях от зиготы (0,5сут. развития) до бластоцисты
(3,5сут.). В клиниках ВРТ для проведения преимплантационной генетической диагностики
производят биопсию редукционного тельца (РТ) или бластомера, разрезают zona pellucida
(ZP) эмбриона при проведении вспомогательного хэтчинга. В экспериментальной
эмбриологии при помощи микрохирургических методов вводят генетические конструкции в
пронуклеус зиготы и генномодифицированные клетки в полость бластоцисты для получения
трансгенных животных. В клиниках и лабораториях для осуществления всех этих процедур
используют микроманипуляторы. Так, например, при биопсии эмбриона двумя стеклянными
иглами механически разрушают участок ZP и через полученное отверстие с помощью иглы
для биопсии изымают бластомер или РТ. В последние годы разрабатываются методы
лазерной микрохирургии эмбрионов.
Нами была разработана методика проведения микрохирургических операций на
преимплантационных эмбрионах мыши с помощью лазерного пинцета (ЛП) и лазерного
скальпеля (ЛС). Мы использовали установку на основе фемтосекундного хромфорстеритового
лазера с длиной волны 620нм, импульсной мощностью 1-15мВт,
длительностью импульсов 100фс и инвертированного микроскопа с эпи-положением
лазерного луча, разработанную в отделе лазерной плазмы Объединенного института
высоких температур РАН. Эмбрионы мыши 1,5-2,5сут. помещали в микрокаплю среды для
манипуляций, покрывали минеральным маслом, для получения отверстия в ZP производили
серию выстрелов в режиме «ЛС» и с помощью ЛП (длина волны лазерного излучения
1060нм) извлекали РТ. Для осуществления слияния бластомеров на стадии двух клеток
также производили одиночные выстрелы в режиме «ЛС». Были подобраны параметры
установки, при которых в наибольшем проценте случаев достигали слияния бластомеров.
Так, если выстрел производили точно по линии контакта бластомеров при наведенном
фокусе, то в не зависимости от энергии удара происходила гибель эмбриона в 90% случаев.
В то же время, если выстрелы проводили при не наведенном фокусе, в 45% случаев
происходило успешное слияние. Для визуализации процесса слияния мембраны эмбрионы
окрашивали флуоресцентным красителем FM4-64 (F34653, Invitrogen) при +4°С и
фиксировали 4% р-ром параформальдегида в ФБС, готовили тотальные препараты, которые
изучали при помощи конфокального микроскопа (Axiovert 200M 510Meta, Zeiss, Германия).
Для получения отверстия в ZP, достаточного для извлечения РТ и/или бластомера в среднем
давали 10 импульсов (эффективность – 97%), а затем с помощью ЛП извлекали клетки.
Эффективность биопсии при извлечении РТ – 50%.
Таким образом, проведение микроопераций при помощи системы лазерный скальпель -
лазерный пинцет, представляется перспективной технологией для микрохирургии
эмбрионов.
Изучение структуры С-терминального домена CAP-комплекса дрожжей
по данным электронной микроскопии
Шаров Григорий Германович (Москва, sharov.grigory@gmail.com)
Процессы сборки и разборки актиновых филаментов, а также направление и скорость
роста регулируются не только концентрацией мономерного актина в определенных частях
клетки, но и большим комплексом актин-связывающих белков (АСБ). В настоящее время
известно более 160 АСБ. Большинство из них взаимодействует с фибриллярным F-актином и
только некоторые с мономерным G-актином (в том числе CAP).
Белок CAP обнаружен в большинстве эукариотических клеток. Он представляет собой
молекулярную машину – высокомолекулярный комплекс с актином, имеющий множество
сайтов связывания с другими АСБ. Участвуя в процессе обновления актиновых филаментов,
N- и C-фрагменты комплекса работают последовательно, освобождая молекулы актина и
38