Medical and Biological Sciences XXI/4 - Collegium Medicum ...
Medical and Biological Sciences XXI/4 - Collegium Medicum ...
Medical and Biological Sciences XXI/4 - Collegium Medicum ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
130<br />
Blanka Ziomkowska i in.<br />
Wzory (4) i (5) dotyczą układu idealnego, to jest<br />
takiego, kiedy światło wzbudzające jest całkowicie<br />
odseparowane od światła fluorescencji i światłem,<br />
które dociera do fotodetektora jest tylko światło fluorescencji.<br />
Dla układu rzeczywistego (tj. takiego, w którym<br />
do detektora oprócz światła fluorescencji dociera<br />
światło rozproszone) mierzona anizotropia mieszaniny<br />
swobodnych i związanych fluoroforów jest wyrażona<br />
wzorem:<br />
r = r f + r f + r f , (6)<br />
F<br />
F<br />
B<br />
B<br />
S<br />
zaś udział fluoroforów (lig<strong>and</strong>ów) związanych równy<br />
udziałowi fluorescencji pochodzącej od fluoroforów<br />
(lig<strong>and</strong>ów) związanych dany jest wzorem:<br />
F<br />
r − r<br />
+<br />
f<br />
S<br />
( r − r )<br />
F S F S<br />
B<br />
= f<br />
B<br />
=<br />
(7)<br />
rB<br />
− rF<br />
r s i f s oznaczają odpowiednio anizotropię światła rozproszonego<br />
i udział natężenia światła rozproszonego w<br />
całkowitym natężeniu światła mierzonym przez detektor.<br />
Mierząc współczynniki anizotropii światła dostarczanego<br />
przez kamptotecyny rozpuszczone w roztworach<br />
osocza (lub zawiesinach liposomów) o różnych<br />
stężeniach albuminy (lub lipidów) można obliczyć F B ,<br />
a następnie na podstawie relacji (3) współczynnik<br />
powinowactwa K.<br />
Aparatura pomiarowa<br />
Anizotropię fluorescencji mierzono za pomocą<br />
spektrofluorymetru PTI (Photon Technology International<br />
Inc. – Birmingham USA) wyposażonego w polaryzator<br />
(umieszczony w kanale wzbudzenia) i analizator<br />
(umieszczony w kanale emisji). Pomiary wykonywano<br />
w formacie „L”. Stosowano kuwety kwarcowe o<br />
wymiarach drogi optycznej 10 x 6 mm. Próbki wzbudzano<br />
światłem o długości fali 370 nm. W celu zwiększenia<br />
czystości spektralnej światła wzbudzającego<br />
zastosowano w kanale wzbudzenia filtr SPF 380<br />
(short-pass filter), przepuszczający światło wzbudzające<br />
o długość fali poniżej 380 nm. W kanale emisyjnym<br />
w celu oddzielenia rozproszonego światła wzbudzającego<br />
od światła fluorescencji zastosowano filtr LPF<br />
420 (long-pass filter) przepuszczający światło o długości<br />
fali powyżej 420 nm. Utrzymywano stałą temperaturę<br />
badanych roztworów równą 37°C stosując ultratermostat<br />
TW2.03 (ELMI).<br />
WYNIKI POMIARÓW I DYSKUSJA<br />
Pomiar anizotropii fluorescencji dostarcza użytecznych<br />
informacji o zachowywaniu się CPT i SN-38 w<br />
osoczu. Ryc. 2 przedstawia zależność czasową anizotropii<br />
fluorescencji form laktonowych i karboksylowych<br />
kamptotecyny oraz 7-etylo-10-hydroksykamptotecyny<br />
wprowadzonych do roztworu osocza. W<br />
przypadku kamptotecyny obserwuje się odmienne<br />
zachowanie formy laktonowej i karboksylowej. Wartość<br />
anizotropii formy karboksylowej w roztworze<br />
osocza jest duża (0,25) i nie zmienia się w miarę upływu<br />
czasu. Świadczy to o szybkim i nieodwracalnym<br />
wiązaniu się tej formy z dużymi cząsteczkami albuminy.<br />
Wartość anizotropii fluorescencji dla formy laktonowej<br />
bezpośrednio po wprowadzeniu do roztworu<br />
osocza jest mała (0,025). Jest to efekt braku wiązania<br />
lub słabego wiązania formy laktonowej z albuminą.<br />
Jednak anizotropia wzrasta w miarę upływu czasu.<br />
Spowodowane jest to stopniowym przejściem formy<br />
laktonowej w karboksylową, która natychmiast łączy<br />
się z albuminą. Cząsteczki kamptotecyny związane<br />
z albuminą nie powracają do aktywnej formy laktonowej.<br />
Po upływie około 110 minut, jak pokazuje ryc. 2,<br />
anizotropia formy laktonowej osiąga wartość taką, jak<br />
otrzymana dla formy karboksylowej. Dowodzi to całkowitej<br />
hydrolizy formy laktonowej. Przedstawione<br />
wyniki wyjaśniają powód utraty właściwości przeciwnowotworowych<br />
CPT w osoczu. Jest to wynik całkowitej<br />
przemiany aktywnej formy laktonowej w nieaktywną<br />
karboksylową.<br />
Na ryc. 2 przedstawione są również wyniki analogicznych<br />
pomiarów dla SN-38. Można zauważyć, że<br />
związek ten zachowuje się odmiennie od CPT. Anizotropia<br />
obu form SN-38 utrzymuje się na poziomie ok.<br />
0,09 i praktycznie jest niezależna od czasu. Świadczy<br />
to o raczej słabym wiązaniu się obu form SN-38<br />
z albuminą osocza.<br />
Ryc. 2. Ewolucja czasowa anizotropii fluorescencji form<br />
laktonowych i karboksylowych CPT oraz SN-38 rozpuszczonych<br />
w roztworze osocza o stężeniu albuminy<br />
20 µM<br />
Fig. 2. Time evolution of fluorescence anisotropy of lactone<br />
<strong>and</strong> carboxylate forms of CPT <strong>and</strong> SN-38 dissolved<br />
in plasma solution at albumin concentration equal to<br />
20 µM
Change language