Pełny numer do pobrania (*.pdf) - Archiwum Medycyny SÄ dowej i ...

54 Małgorzata Małodobra, Anna Jonkisz, Elżbieta Kowalczyk, Arleta Lebioda, Beata Bartnik, Barbara Świątek Nr 1Testy analityczne prowadzone w celu analizyprzydatności materiału genetycznego.Stężenie uzyskanego materiału genetycznegooraz stopień czystości (R 260 /280 oraz R 260 /230) ocenianospektrofotometrycznie z użyciem aparatuNanoDrop ND1000 (Thermo Scientific).Materiał genetyczny poddano amplifikacji w testachstosowanych do ustalania spornego ojcostwa(AmpFlSTR Identyfiler PCR Amplification Kit,Applied Biosystems) oraz do analizy osobniczej(AmpFlSTR Y-filer PCR Amplification Kit, AppliedBiosystems). Materiał kliniczny analizowano z zastosowaniemklasycznego PCR, środowisko reakcji zapewniałQiagen Multiplex PCR Kit, Qiagen). RNAw pierwszej kolejności poddawano reakcji odwrotnejtranskrypcji z użyciem High Fidelity cDNASynthesis Kit, Applied Biosystems, następnie cDNAamplifikowano z użyciem starterów dla genu metabolizmupodstawowego GAPDH (1000pz) w obecnościQiagen Multiplex PCR Kit, Qiagen. Warunkireakcji oraz profil temperaturowy dobierano odpowiedniodla każdego odczynnika zgodnie z rekomendowanymprzez firmę protokołem.WYNIKIAnaliza jakości i czystości kwasównukleinowych.Parametry charakteryzujące kwasy nukleinowewyizolowane za pomocą automatycznej stacji Janusprzedstawiono w tabeli numer I. Uzyskane DNAposiadało stężenie oraz współczynniki czystościR 260 /280 oraz R 260 /230 zadowalające, odpowiednie dodalszych aplikacji. Oceniając RNA uzyskane za pomocąstacji Janus, stężenie RNA było zadowalające,natomiast współczynniki czystości nie spełniałyoczekiwań.Analiza przydatności zastosowania uzyskanegoDNA.Uzyskane z użyciem automatycznej stacji JanusDNA zostało poddane analizie sprawdzania przydatnościużycia w rutynowo stosowanych testachdla celów klinicznych oraz medycyny sądowej. DNAizolowane z plam (plamy pobrane od rodzin, u którychdochodzono spornego ojcostwa) poddano amplifikacjiz użyciem zestawu AmpFlSTR IdentyfilerPCR Amplification Kit. Uzyskane produkty byłyspecyficzne, wydajność reakcji była porównywalnado wyników uzyskanych z użyciem DNA izolowanegorutynową metodą manualną.DNA izolowane z krwi pełnej świeżej i mrożonejoraz plam krwi i izolaty z kości analizowanoz użyciem testu do amplifikacji polimorfizmówY-STR, AmpFlSTR Y-filer PCR Amplification Kit.Produkt PCR powstały po amplifikacji DNA uzyskanegoza pomocą stacji Janus, był w praktyce nieodróżnialnyod wyników analiz z wykorzystaniemDNA izolowanego rutynową metodą manualną. Nieuzyskano produktu amplifikacji DNA izolowanegoz kości.DNA uzyskane z materiałów do badań klinicznych,jak mięśnie szkieletowe, tkanka nowotworowa,czy limfocyty, poddawano amplifikacji w klasycznymPCR z użyciem starterów specyficznychdla genu VDR (Gen Receptora Witaminy D), region3’UTR. Wielkość otrzymanego produktu wynosiła220pz. Analizę produktów PCR przedstawiono narycinie 1. Uzyskano produkt amplifikacji dla DNAizolowanego z limfocytów, tkanki mięśniowej, tkankinowotworowej, krwi pełnej świeżej oraz mrożonej.Nie udało się uzyskać produktu dla DNA izolowanegoz kości i z osocza.Analiza przydatności zastosowania uzyskanegoRNA.Wyizolowane RNA poddano w pierwszej kolejnościreakcji odwrotnej transkrypcji w celu przepisaniainformacji z RNA na cDNA. NastępniecDNA amplifikowano w reakcji RT-PCR z użyciemstarterów specyficznych dla cDNA. Przykładowyrozdział elektroforetyczny przedstawiono na rycinie2. Wynik dodatni uzyskano jedynie dla izolacji RNAwykonywanej manualnie (rutynowa metoda izolacji).Brak było produktu amplifikacji cDNA uzyskanegoz RNA izolowanego z limfocytów i guzanerki izolowanego przy użyciu automatycznej stacjiJanus.DYSKUSJAW niniejszej pracy przedstawiliśmy wyniki świadcząceo skuteczności automatycznej izolacji DNAz różnych materiałów klinicznych oraz dowodowych.Wydajność automatycznej izolacji DNA, podobniejak jego czystość, była zadowalająca porównywalnado rutynowo stosowanych metodmanualnych. Jednakże pomimo licznych prób au-2011 © by Polskie Towarzystwo Medycyny Sądowej i Kryminologii, ISSN 0324-8267