NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI - inova

NOVA Lite ® HEp-2 ANA Kit with DAPIDo diagnostyki In VitroZłożoność CLIA: WysokaKod produktu: 708102Przeznaczenie• NOVA Lite ® HEp-2 to pośrednie badanie immunofluorescencyjne do badań przesiewowych ioznaczania półilościowego przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w surowicy ludzkiej. Obecnośćprzeciwciał przeciwjądrowych może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymibadaniami serologicznymi, aby wspomóc diagnostykę tocznia rumieniowatego układowego (SLE) lubinnych chorób tkanki łącznej bądź reumatycznych.Podsumowanie i wyjaśnienie testu• Pojęcie „przeciwciała przeciwjądrowe” (ANA) opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą wreakcję ze składnikami jąder komórkowych, w tym z DNA, RNA oraz wieloma białkami irybonukleoproteinami. 1 Te przeciwciała często występują u pacjentów z chorobami tkanki łącznej lubreumatycznymi, szczególnie toczniem rumieniowatym układowym.• Praktycznie wszyscy pacjenci SLE są ANA-pozytywni. Ta czułość diagnostyczna doprowadziła dowłączenia przez podkomisję Amerykańskiego Kolegium Reumatologii testowania ANA dopoprawionych w 1982 r. kryteriów klasyfikacji toczenia rumieniowatego układowego. 2 Pomimo tego,że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktyczniewyklucza aktywne SLE 3 ), w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste.• Pacjenci z innymi chorobami tkanki łącznej, jak reumatoidalne zapalenie stawów, twardzina izapalenie skórno-mięśniowe mają często wyniki pozytywne i w innych stanach chorobowych oraz uosób zdrowych można obserwować niskie miana ANA.• Pozytywne wyniki ANA mogą występować po ciężkich oparzeniach lub infekcjach wirusowych izgłaszano je u niektórych osób zdrowych, zwłaszcza osób starszych.• Ze wzg lędu na brak swoist ości zaleca się, aby wszystkie prób ki pozytywne pod wzg lędem ANAmiar eczkować do punktu końcowego i pr zepr owadzić bardziej swoist e badania pod kątem autopr zeciwciałskier owanych pr zeciwko podwój nej nici DNA ( dsDNA) i ekstrahowalnemu ant ygenowi j ądr owemu ( ENA).• Referencyjną metodą badania ANA jest pośrednia immunofluorescencja. Popularnymi substratami sącienkie skrawki narządów gryzoni lub różne rodzaje linii komórkowych. Ogólnie jest przyjęte, żesubstraty linii komórkowych są preferowane przed skrawkami narządów, ponieważ szybko dzielącesię komórki wykazują wyższe poziomy określonych antygenów istotnych klinicznie, w tymcentromeru, SS-A(Ro), Scl-70 i PCNA/cykliny.• Oprócz rodzaju substratu dla wydajności testu ANA kluczowe są trzy inne czynniki: 1) utrwalaczzastosowany podczas przygotowywania preparatu, 2) współczynnik fluoresceiny do białka (F/P) oraz3) swoistość podklasy immunoglobulin koniugatu.• Niektóre utrwalacze lub ich kombinacje niszczą określone antygeny jądrowe i należy unikać ichstosowania. Czułość i nieswoistość barwienia tła koniugatu jest określana przez współczynnik F/P,natomiast swoistość chorobowa koniugatu jest określana przez reaktywność podklasy immunoglobulin.• Praktycznie wszystkie istotne klinicznie autoprzeciwciała wykazują swoistość podklasy IgG, nawet wobecności ANA swoistych wobec IgM i IgA. 4 Dla odróżnienia ANA występujące u zdrowychkrwiodawców to ogólnie wyłącznie podklasy IgM oraz IgA. 5 Z tego powodu koniugaty swoiste dla IgGmają wyższą swoistość chorobową.• Substrat wybrany dla badania NOVA Lite ® HEp-2 ANA to optymalnie utrwalona linia komórkowanabłonka ludzkiego (HEp-2) a koniugat to oczyszczona metodą powinowactwa IgG przeciwludzkaposiadająca starannie wybrany współczynnik F/P.1

4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek orazinnymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnościąwyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratoriumjest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badańmieszczą się w akceptowalnych limitach.5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkowąodczynników, moc żarówki używanego mikroskopu, dokładność i powtarzalność technikipipetowania, dokładność płukania oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskaniedokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji.6. Z czasem koniugat IgG przeciwludzkiej może zmienić kolor z powodu ekspozycji na światło.Jednak zmiana barwy nie ma wpływu na wynik badania.7. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.Warunki przechowywania1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać.Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używanezgodnie z instrukcjami.2. Rozcieńczony bufor do płukania jest stabilny przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°C.Pobieranie próbek• Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantówdo próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierającychwidoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowiciezhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek.• Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zalecanastępujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowejnie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkędo temperatury 2–8°C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadkutransportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki porozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane.BadanieDostarczone materiałyDostarczony elementPreparaty substratu HEp-2, 12 dołkówKoniugat FITC przeciwludzkiej IgG z DAPIMożliwy do miareczkowania wzór kontroli ANASystemu negatywnej kontroli FAKoncentrat PBS (40x)Środek do osadzania preparatuIlość20 x 12 dołków1 x 15 ml1 x 0,5 ml1 x 0,5 ml2 x 25 ml1 x 7 mlSzkiełka nakrywkowe 1 x 203

Wymagane materiały nie dołączone do zestawuMikropipety o objętości 15–1000 μlWoda destylowana lub dejonizowanaGruszki laboratoryjne lub pipety PasteuraKomora wilgotnaPojemnik 1 l (do rozcieńczania PBS)Barwiacz CoplinaMikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nmSposób przygotowaniaPrzed rozpoczęciem1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20–26°C) i dobrze wymieszać.2. Rozcieńczyć koncentrat PBS. WAŻNE: Rozcieńczyć koncentrat PBS w stosunku 1:40, dodajączawartość butelki koncentratu PBS do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej i dokładniewymieszać. Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor dopłukania. Rozcieńczony bufor może być przechowywany maksymalnie przez 4 tygodnie wtemperaturze 2–8°C.3. Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta:a. Wstępne badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pacjentów rozcieńczonym buforemfosforanowym 1:40 (np. dodać 50 μl surowicy do 1,95 ml buforu fosforanowego).b. Miareczkowanie: Z początkowego rozcieńczenia przesiewowego dla wszystkich próbekpozytywnych wykonać serię 2-krotnych rozcieńczeń za pomocą rozcieńczonego buforuPBS (tj. 1:80, 1:160... 1:2560).Procedura badania1. Przygotować preparat substratu: Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąćtemperaturę pokojową. Oznaczyć ołówkiem i umieścić w odpowiedniej komorze wilgotnej. Dodać 1kroplę (20–25 μl) nierozcieńczonej kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio do dołka 1 i 2.Dodać 1 kroplę (20–25 μl) rozcieńczonej próbki pacjenta do pozostałych dołków.2. Inkubacja preparatu: Inkubować preparat przez 30 ± 5 minut w komorze wilgotnej (zwilżony ręcznikpapierowy włożony na płasko na spodzie zamkniętej torebki lub szklanego pojemnika zapewniodpowiednie warunki wilgotności). Nie dopuścić do wyschnięcia substratu podczas badania.3. Wypłukać preparaty: Po inkubacji użyć plastikowej gruszki laboratoryjnej lub pipety, abydelikatnie przepłukać surowicę rozcieńczonym buforem PBS. Ustawić preparat oraz strumieńbufora PBS w taki sposób, aby ograniczyć wypłukiwanie próbek między dołkami. Unikaćkierowania strumienia bezpośrednio na dołki, aby nie dopuścić do uszkodzenia substratu.Jeśli jest to wymagane, można umieścić preparaty na maks. 5 minut w barwiaczu Coplina zrozcieńczonym buforem PBS.4. Dodanie koniugatu fluorescencyjnego: Strząsnąć nadmiar buforu PBS. Umieścić preparat zpowrotem w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą koniugatufluorescencyjnego. Inkubować preparaty przez dodatkowe 30 ± 5 minut.5. Wypłukać preparaty: Powtórzyć etap 3.6. Szkiełko nakrywkowe: Procedura nakładania szkiełek nakrywkowych różni się w zależności odlaboratorium. Zalecana jest poniższa procedura:a. umieścić szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym.b. nanieść środek do osadzania preparatu w formie ciągłej linii na dolnej krawędzi szkiełkanakrywkowego.4

c. strząsnąć nadmiar buforu PBS i zetknąć dolną krawędź preparatu z krawędzią szkiełkanakrywkowego. Delikatnie opuścić preparat na szkiełko nakrywkowe, w taki sposób, abyśrodek do osadzania preparatu rozpłynął się do górnej krawędzi preparatu bezformowania pęcherzyków powietrza.Kontrola jakości• Kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA i system kontroli negatywnej IFA powinnybyć oznaczane dla każdego preparatu, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury działająprawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować dzieląc połączonepróbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze poniżej -70°C. Aby wyniki badania mogłybyć uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiekkryterium nie będzie spełnione, wyniki badania powinny być traktowane jako nieważne i badaniepowinno zostać powtórzone.1. Nierozcieńczona kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA musi być >3+.2. System kontroli negatywnej IFA musi być negatywny.Interpretacja wyników• Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli swoiste zabarwienie jest równelub mniejsze niż systemu kontroli negatywnej IFA. Próbki mogą wykazywać różny stopień barwieniatła ze względu na przeciwciała heterofilne lub niski poziom autoprzeciwciał skierowanych przeciwkoskładnikom cytoplazmatycznym, jak białka kurczliwe.• Reakcja pozytywna. Próbka jest uznawana za pozytywną, jeżeli obserwowane swoiste barwieniejest większe niż systemu kontroli negatywnej IFA.• Ustalić stopień fluorescencji lub intensywności za pomocą tych kryteriów:4+ Jaskrawo jasnozielona fluorescencja3+ Jasna jasnozielona fluorescencja2+ Wyraźnie rozpoznawalna pozytywna fluorescencja1+ Najniższa swoista fluorescencja, która umożliwia wyraźne odróżnienie barwienia jądrowegoi/lub cytoplazmatycznego od fluorescencji tła.Interpretacja wzoru.• Mogą występować różne wzory barwienia jądrowego i/lub cytoplazmatycznego w zależności odwystępujących w próbce rodzajów i względnych ilości autoprzeciwciał.Można obserwować następujące wzory barwienia:Jednorodne: Jednolite barwienie jądra z lub bez widocznego maskowania jąderka.Obecność antygenów jądrowych: dsDNA, ssDNA, histonyPowiązanie z chorobą: Wysokie miana sugerują SLE, niższe miana sugerują SLE lub innechoroby tkanki łącznej.Obwodowe: Jednolite barwienie, głównie wokół zewnętrznego obszaru jądra ze słabszym barwieniemw ierunku środka jądra.Obecność antygenów jądrowych: dsDNA, ssDNA, DNP, histonPowiązanie z chorobą: Wysokie miana sugerują SLE, niższe miana sugerują SLE lub innechoroby tkanki łącznej.5

Plamy: Widoczne delikatne lub ziarniste barwienie jąderka, na ogół bez barwienia fluorescencyjnego jąderek.Obecność antygenów jądrowych: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B i inne jeszcze niescharakteryzowane układy antygen / przeciwciało.Powiązanie z chorobą: Wysokie miano wskazujące na SLE (przeciwciało Sm), mieszanąchorobę tkanki łącznej (przeciwciało RNP), twardzinę (przeciwciało Scl-70) lub zespół Sjogrenasuchości(przeciwciało SS-B), niższe miana mogą sugerować inne choroby tkanki łącznej.Jąderkowy: Duże ziarniste nakrapiane plamy w jądrze, zazwyczaj mniej niż 6 na komórkę, z lub bezokazjonalnych drobnych plamek.Obecność antygenów jądrowych: 4-6S RNA i inne nieznane antygeny jądrowe.Powiązanie z chorobą: Wysokie miana występują w twardzinie i zespole Sjogrena.Centromer: Wzór barwienia oddzielnego, plamkowego. Plamki jądrowe są bardzo oddzielone i zwyklesą wielokrotnością 46.Obecność antygenów jądrowych: Centromer chromosomalny (kinetochor).Powiązanie z chorobą: W dużym stopniu sugeruje zespół CREST, odmianę postępującejtwardziny układowej (PSS). CREST to forma PSS z silnym wapnieniem oraz zjawiskiemRaynauda, zaburzeniami czynności przełyku, ograniczonymi objawami skórnymi (częstoograniczonymi do palców lub twarzy) i telangiektazją.Mitochondrialny: Oddzielne plamki cytoplazmy względnie oddalone od obszaru jądra.Obecność antygenu: Różne rodzaje antygenów mitochondrialnych.Powiązanie z chorobą: Wysokie miana wskazują na pierwotną marskość żółciową.• Istotne jest ostrzeżenie użytkownika, aby zachować ostrożność podczas określenia swoistościautoprzeciwciał na podstawie wzorów, z wyjątkiem wzorów jąderkowych i centromerowych, wktórych każdy antygen jest bardzo dobrze określony i ich wzory są charakterystyczne. Ponieważwiele autoprzeciwciał lub ich kombinacji może indukować wzór jednorodny lub plamisty, zalecasię przeprowadzania na wszystkich próbkach plamistych lub jednorodnych kontrolnych badańautoprzeciwciał swoistych (takich jak dsDNA i ENA).Ograniczenia badania1. Wysokie miana ANA sugerują chorobę tkanki łącznej, ale nie powinny być uznawane zadiagnostyczne. Wynik badania ANA powinien być analizowany w połączeniu z innymi wynikamiserologicznymi oraz ogólnym wywiadem klinicznym pacjenta.2. Wzory ANA często zmieniają się, gdy próbka jest miareczkowana do punktu końcowego.Zjawisko to jest spowodowane faktem, że podczas badania bardziej rozcieńczonych próbekniższe miana przeciwciał spadają poniżej czułości systemu.3. Wiele różnych czynników zewnętrznych ma wpływ na wrażliwość testu, np. typ używanego mikroskopuf luorescencyj nego, m oc i wiek lampy, stosowane powiększenie, syst em f iltr ów oraz badacz.4. Jeśli zamiast filtra barierowego 515 używany jest filtr środkowoprzepustowy, może wystąpićzwiększone zabarwienie artefaktowe.5. Do opisywania preparatów należy stosować wyłącznie ołówek. Stosowanie innego przyrządu dopisania może spowodować zabarwienie artefaktowe.6. Wszystkie barwiacze Coplina stosowane do płukania preparatów nie powinny zawierać żadnychpozostałości barwników. Używanie barwiaczy Coplina zawierających pozostałości barwnikówmoże spowodować zabarwienie artefaktowe.7. Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniamiserologicznymi.8. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.6

Piśmiennictwo1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances inImmunology 33: 167-239, 1982.2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritisand Rheumatism 25: 1271-1277, 1982.3. Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus.Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964.4. Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupuserythematosus. The New England Journal of Medicine 274: 1333-1338, 1966.5. Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: 215-220,1976.6. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute ofHealth, 2007, Fifth EditionWyprodukowano przez:INOVA Diagnostics, Inc.9900 Old Grove RoadSan Diego, CA 92131Stany ZjednoczonePomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950support@inovadx.comAutoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:Medical Technology Promedt Consulting GmbHAltenhofstrasse 80D-66386 St. Ingbert, NiemcyTel.: +49-6894-581020Faks: +49-6894-581021www.mt-procons.com628102POL Marzec 2012Wersja 0NOVA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonymi znakami handlowymi.C op yr ight 2012© Wszelkie prawa zastrzeżone8