Kalibriergerade des Markers
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A) Einleitung<br />
Proteine tragen wesentlich zum Aufbau und Funktionieren einer Zelle bei. Nachfolgend soll<br />
der Aufbau, die Einteilung und die Bildung von Proteinen besprochen werden.<br />
1. Aufbau<br />
Proteine sind aufgebaut aus Aminosäuren, deren allgemeine Formel hier abgebildet ist.<br />
Abb.: 1 Aufbau Aminosäure (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)<br />
Ein solches Molekül bildet einen Baustein eines Proteins. Im Molekül sind zwei funktionelle<br />
Gruppen zu sehen: die Carboxylgruppe -COOH und die Aminogruppe -NH2. Mit diesen<br />
Gruppen wird die Verbindung zu den anderen Aminosäuren geknüpft. Es gibt 20 für den<br />
Proteinaufbau wichtige Aminosäuren. Manchmal wird auch noch eine 21 Aminosäure, das<br />
selten vorkommende Selenocystein, zu diesen dazugezählt. In eukaryotischen Zellen kommen<br />
nur die so genannten L – Aminosäuren vor. In der Fischer-Projektion liegt bei der<br />
L-Konfiguration die Aminogruppe auf der linken Seite <strong>des</strong> Moleküls, bei der D-Aminosäure<br />
auf der rechten Seite (von dexter, lat. rechts und laevus, lat. links).<br />
Man unterscheidet Aminosäuren mit hydrophoben (Rest nicht wasserlöslich), hydrophilen<br />
(Rest wasserlöslich), sauren (Protonendonator), basischen (Protonenakzeptor) und<br />
aromatischen (Phenylring) Resten.<br />
1
Abb.: 2 Einteilung Aminosäuren (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)<br />
Es gibt zwei Aminosäuren die eine Sonderrolle spielen. Zum einen das Glycin, welches an<br />
seinem α – C-Atom keine Chiralitätszentrum hat und zum anderen das Prolin, welches mittels<br />
der Amino-Gruppe und seinem Rest einen Ringschluss vollzieht.<br />
2
Die Bindung zwischen zwei Aminosäuren über die Carboxyl-gruppe der einen und<br />
Aminogruppe der anderen heißt Peptidbindung. Dabei wird ein Wassermolekül abgespalten.<br />
Solche Reaktionen, bei denen Wasser abgespalten wird, heißen Kondensationsreaktionen. Die<br />
Spaltung dieser Bindung nennt man Hydrolyse. Dazu wird je ein H2O-Molekül benötigt.<br />
Die Abbildung unten zeigt relativ gut, dass die Verbindung der Aminosäuren über die<br />
Peptidbindung räumlich zu einer "Zick-Zack"-Kette führt.<br />
Abb.: 3 Peptitbindung (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)<br />
2. Struktur der Proteine<br />
Betrachtet man die Struktur der Proteine so kann man diese in verschiedene Unterstrukturen<br />
unterteilen.<br />
Zum einen gibt es die Primärstruktur welche nur aus der spezifischen Reihenfolge der<br />
Aminosäuren gegeben ist.<br />
Die Primärstruktur <strong>des</strong> blutzuckersteigernden Hormons Glucagon sieht z.B. so aus:<br />
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe<br />
Val Gln Trp Leu Met Asn Thr<br />
3
Eine weitere Struktur ist die Sekundärstruktur.<br />
Abb.: 4 α-Helix und β-Faltblatt (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)<br />
Man unterscheidet zwischen der helikal angeordeten α-Helix und dem antiparallel laufenden<br />
β-Faltblatt. Die Ausbildung der Strukturen wird durch Wasserstoffbrückenbindungen<br />
stabilisiert. Bin Übergang von der einen Struktur in die andere kommt es oft zur aus<br />
Ausbildung einer so genannten β-Schleife. Meist ist die Ursache für die Schleifenbildung die<br />
Aminosäure Prolin.<br />
Die Tertärstruktur wird durch die räumliche Faltung <strong>des</strong> Proteins gebildet. Hierbei haben<br />
Van – der – Waals Kräfte, Dipol – Dipol – Wechselwirkungen, ionische Wechselwirkungen<br />
sowie Disulfitbrücken eine wichtige stabilisierende Wirkung.<br />
Abb.: 5 Tertiärstruktur von Porin (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)<br />
4
Die letzte Struktur ist die Quartiärstruktur. Hier lagern sich mehrer räumlich gefaltete<br />
Proteine zu einem Komplex zusammen.<br />
Abb.: 6 GAPD (= Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase), (Ernst-Georg Beck)<br />
3. Abbau von Proteinen<br />
Er Abbau von Proteinen erfolgt über so genannte Peptidasen. Es gibt Exopeptidasen und<br />
Endopeptidasen. Exopeptidasen schneiden die Polypeptitkette beliebig irgendwo der Mitte<br />
auseinander während Endopeptidasen nur die Enden eines Proteins angreifen können. Dabei<br />
unterscheidet man zwischen Carboxypeptidasen ( können nur am Carboxylende angreifen )<br />
und Aminopeptidasen (greifen an der Aminogruppe an).<br />
4. Bildung von Proteinen<br />
Proteine werden in der Proteinbiosynthese gebildet. Dies besteht aus zwei zentralen<br />
Vorgängen, der Transkription und der Translation. Hier soll nur näher auf die Translation<br />
eingegangen werden. Die Information über die Bildung eines Proteins ist in der DNA<br />
gespeichert. Die prä – mRNA entspricht einer Kopie der DNA, welche Informationen über die<br />
Bildung eines Proteins einhält. Sie wird während der Transkription gebildet.<br />
4.1 Processing<br />
Diese prä – mRNA muss, bevor sie abgelesen werden kann noch verschiedene Stufen <strong>des</strong><br />
Processings durchlaufen. Beim Splicing werden mittels Spleißsosomen die Introns, welche<br />
keine Information zur Realisierung der DNA enthalten, herausgeschnitten. An das 5’-Ende<br />
der Prä-mRNA wird beim Processing ein 7-Methyl-GTP-Rest angehängt, welcher als 5’-Cap<br />
bezeichnet wird. Er dient als Schutz der m-RNA vor der Hydrolyse durch Exonucleasen und<br />
5
als Erkennungsmerkmal für die Ribosomen. An das 3’- Ende wird ein Poly-A-Schwanz<br />
(Polyadenylat-Schwanz) angehängt. Dieser bewirkt ebenso Schutz vor Exonucleasen und<br />
erleichtert der mRNA das Verlassen <strong>des</strong> Zellkerns.<br />
4.2 Translation<br />
In der Translation wird die Information zur Bildung eines Proteins, welche auf der mRNA<br />
gespeichert ist, in Form von einer Aminosäuresequenz realisiert. Diese Information ist in<br />
Form von Basentripletts gespeichert, welche die Aminosäuren nicht erkennen können. Als<br />
Bindeglied zwischen Aminosäure und mRNA dient die tRNA. Sie sichert zu, dass die richtige<br />
Aminosäure dem richtigen Basentriplett zugeordnet wird.<br />
Nachfolgend ist ein t-RNA-Molekül dargestellt.<br />
Abb.: 7 Struktur einer tRNA (Biokurs 2001, Ernst-Georg<br />
Beck)<br />
6<br />
t-RNA-Moleküle bestehen aus ca. 90<br />
Basen und bilden mit sich selbst<br />
Wasserstoffbrückenbindungen aus. So<br />
entsteht im zweidimensionalen die<br />
typische Kleeblatt-Struktur mit drei<br />
Schleifen. Im dreidimensionalen spricht<br />
man von der L – Form. Am 3´-Ende<br />
wird die Aminosäure angelagert.<br />
Die T – Schleife spielt eine wichtige<br />
Rolle bei der Anlagerung an die Aminoacyl – tRNA – Synthetase während die D-Schleife bei<br />
der Anlagerung an die Ribosomen unterstützend wirkt. Das sogenannte Anticodon ist eine<br />
Abfolge von 3 Nukleotiden in der Anticodonschleife, die spezifisch für die einzelnen t-RNA-<br />
Moleküle ist und an die komplementären Basentripletts der mRNA bindet.<br />
Die Bindung der Aminosäure an die tRNA erfolgt mit dem Enzym Aminoacyl – tRNA –<br />
Synthetase. Unter ATP – Verbrauch wird die Aminosäure an das 3´-Ende der tRNA<br />
gebunden.<br />
Dies geschieht mittels folgender Reaktionen:<br />
Aminosäure + ATP + Enzym Aminoacyl-AMP-Enzym + PPi<br />
Aminoacyl-AMP-Enzym + tRNA Aminoacyl-tRNA + AMP + Enzym
In der nachfolgenden Abbildung ist das Schema dieser Reaktion noch einmal bildlich in Form<br />
eines Kreislaufes dargestellt.<br />
Abb.: 8 Beladen einer tRNA (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)<br />
Die Translation lässt sich grob in die Initiation, die Elongation und die Termination<br />
Abb.: 9 Initiation der Translation (Campbell,<br />
Biologie, 2.korrigierter Nachdruck 2000,<br />
Spektrum-Verlag)<br />
unterteilen. Bei der Initiation lagert sich die<br />
kleine Untereinheit der Ribosomen an ein<br />
Startcodon am 5´- Cap – Ende der mRNA. Nun<br />
bindet die Initiations – tRNA (bei Eukaryoten<br />
immer Methionyl – tRNA) an der mRNA. Darauf<br />
hin lagert sich noch die große ribosomale<br />
Untereinheit an. Nun, da sich die A - (Aminoacyl<br />
– tRNA) Stelle und die P – (Peptidyl – tRNA)<br />
Stellen gebildet haben, kann mit der Elonation<br />
begonnen werden. Die Methionyl – tRNA sitzt<br />
auf der P – Stelle. An die A – Stelle kann sich<br />
eine neue tRNA anlagern. In einem Schritt, den<br />
die Peptit – Transferase katalysiert wird die<br />
Aminosäure auf der P – Stelle mit der auf der A –<br />
Stelle verknüpft. Nun wandert das Ribosom<br />
weiter. Die tRNA, welches auf der P – Stelle war<br />
wird nun frei und die tRNA, welche auf der<br />
7
Abb.: 10 Elongation ( Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)<br />
8<br />
A – Stelle war nimmt ihren<br />
Platz ein. Die A – Stelle ist nun<br />
frei und eine neue tRNA kann<br />
sich anlagern. So wird der<br />
Prozess immer weitergeführt<br />
und die Peptitkette immer<br />
länger.<br />
Beendet wird der Vorgang durch die Termination. Sie wird eingeleitet durch ein so genanntes<br />
Stoppcoden z.B. UAG, UGA, UAA. Außerdem sind noch Release – Faktoren nötig. Befindet<br />
sich ein Stoppcoden an der A-Stelle dann lagert sich keine tRNA, sondern der eben genannte<br />
Release - Faktor an. Dieser Faktor bewirkt den Zerfall <strong>des</strong> Komplexes aus großer und kleiner<br />
ribosomaler Untereinheit sowie der mRNA. Damit ist die Translation beendet und die<br />
Polypeptitkette wird freigesetzt.<br />
Abb.: 11 Termination der Translation (Campbell, Biologie, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag)
5. Stickstofffixierung<br />
Pflanzen benötigen Ammonium für den Aufbau von Proteinen. Dies bekommen sie entweder<br />
direkt über Symbionten (z.B. Rhizobien), welche den Luftstickstoff fixieren können und der<br />
Pflanze zur Verfügung stellen oder sie gewinnen mittels Nitrat- und Nitritreduktasen<br />
Ammonium aus Nitrat oder Nitrit, welches sich im Boden befindet.<br />
6. Sodiumdodecylsulfat – Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)<br />
Die SDS-PAGE ist eine molekularbiologische Methode zur Auftrennung von Proteinen nach<br />
ihrem Molekulargewicht. Hierbei ist es wichtig, dass die Proteine dieselbe räumliche Struktur<br />
aufweisen (eindimensional) und dieselbe Ladung tragen (negativ). Diese Voraussetzungen<br />
werden in der denaturierenden, diskontinuierlichen PAGE durch die Zugabe der Detergens<br />
SDS gewährleistet. SDS lagert sich an Proteine an, spaltet alle nichtkovalenten Bindungen<br />
und verleiht dem Protein eine negative Gesamtladung. Um auch die kovalenten<br />
Disulfidbrücken in einem Protein spalten zu können wird unterstützend ein Reduktionsmittel<br />
wie z.B. β-Mercaptoethanol oder DTT, dazugegeben. Wird nun ein elektrisches Feld an das<br />
Gel angelegt, so wandern kleine Proteine mit einem geringen Molekulargewicht schneller<br />
durch die Maschen <strong>des</strong> Polyacrylamids in Richtung der Anode, als große Proteine mit einem<br />
hohen Molekulargewicht.<br />
9
B) Material und Methoden<br />
1. SDS – PAGE<br />
Zur Auftrennung der Proteine aus Senfkeimlingen, die zum einen unbelichtet (etioliert) waren<br />
und zum anderen 14h vorbelichtet waren, wurde eine SDS – PAGE (siehe Theorie 1..........)<br />
von der Betreuerin vorbereitet. Die Pufferkammern der PAGE wurden mit Laufmittel gefüllt<br />
und anschließend die Proben geladen. Hierfür wurden je 2g Senfhypokotyle mit etwas<br />
Seesand und 5ml Boratpuffer homogenisiert, 10min bei maximaler Stufe zentrifugiert und der<br />
Überstand in Eis aufbewahrt. Vom Überstand wurden je 60µl der beiden Pflanzen mit 20µl<br />
Ladepuffer versetzt und in die Taschen gefüllt. Außerdem wurde ein Standard in eine Tasche<br />
gegeben. Die Anordnung sah wie folgt aus:<br />
unbelichtete<br />
Senfpflanze<br />
Teilgr. 1<br />
belichtete<br />
Senfpflanze<br />
Teilgr. 1<br />
leer<br />
Marker<br />
10<br />
leer<br />
unbelichtete<br />
Senfpflanze<br />
Teilgr. 2<br />
belichtete<br />
Senfpflanze<br />
Teilgr. 2<br />
Zunächst wurde eine Spannung von 100 V angelegt, bis der Indikator Bromphenolblau die<br />
Trennschicht zwischen Sammel- und Trenngel erreicht hatte. Dann wurde die Spannung auf<br />
200 V erhöht, bis das Bromphenolblau das Gel verlassen hatte.<br />
Anschließend wurde das Gel von der Betreuerin mit dem Farbstoff Coomassie angefärbt, über<br />
Nacht wieder entfärbt und zur Kontrastverstärkung in Glycerinlösung gegeben.<br />
2. Anthocyan – und Leucocyanbestimmung<br />
2.1 Anthocyanbestimmung<br />
2g eines belichteten und 2g eines nicht belichteten Senfkeimlings wurden jeweils mit etwas<br />
Seesand und 10ml 1M HCl homogenisiert. Anschließend wurden beide Proben für 10min bei<br />
höchster Stufe zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Von diesem wurde bei 515nm<br />
die Absorption gemessen, wobei als Leerwert HCl verwendet wurde.<br />
2.2 Leucocyanbestimmung<br />
In drei große Reagenzgläser wurden je 8ml der Lösung A (konz. HCl und n-Butanol) und 2ml<br />
der Lösung B (Lösung A und Eisensulfat) pipettiert. Anschließend wurden in zwei der Gläser<br />
2g der beiden, unterschiedlichen Senfpflanzen gefügt und alle bei 95°C für 15min inkubiert.<br />
Nachdem die Proben abgekühlt waren, wurden 0,15ml der Extrakte mit 2,85ml der Lösung A
vermischt und deren Extinktion bei 515nm gemessen. Hierbei diente das dritte Reagenzglas,<br />
dem keine Hypokotyledonen zugefügt wurden als Leerwert.<br />
3. Messung der PAL – Enzymaktivität<br />
3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration<br />
Hierzu wurden jeweils 1,0ml <strong>des</strong> Überstan<strong>des</strong> der beiden, unterschiedlich belichteten<br />
Senfarten mit 4ml Trichloressigsäure gemischt und die Extinktion bei 600nm gemessen. Als<br />
Leerwert wurde hier ein Gemisch aus 1,0ml Wasser mit 4ml Trichloressissäure verwendet.<br />
3.2 Photometrische Detektion von Zimtsäure<br />
Es wurden jeweils 1,5ml Boratpuffer mit 1,0ml Phenylalanin und 0,5ml <strong>des</strong> Überstan<strong>des</strong> aus<br />
Versuch 1 in Quarzküvetten pipettiert und die Extinktion bei 290nm bestimmt. Als Nullwert<br />
diente dabei ein Gemisch aus 2,0ml Boratpuffer und 1,0ml Phenylalanin. Die Extinktion<br />
wurde alle 5 min gemessen, bis sich der ermittelte Wert nicht mehr veränderte.<br />
11
C) Ergebnisse<br />
1. SDS – PAGE<br />
Die Betrachtung <strong>des</strong> PA-Gels zeigte keine deutlichen Banden, daher soll zur Auswertung das<br />
Gel der Vorgruppe (Bild siehe Anhang) verwendet werden.<br />
Zur Auswertung der Banden der Proben auf dem Polyacrylamidgel musste zunächst aus den<br />
Laufweiten der Banden <strong>des</strong> <strong>Markers</strong> eine <strong>Kalibriergerade</strong> erstellt werden. Diese ist in der<br />
folgenden Graphik dargestellt.<br />
Graphik 1: <strong>Kalibriergerade</strong> <strong>des</strong> <strong>Markers</strong><br />
log Molekulargewicht<br />
2,3<br />
2,2<br />
2,1<br />
2<br />
1,9<br />
1,8<br />
1,7<br />
1,6<br />
1,5<br />
<strong>Kalibriergerade</strong> <strong>des</strong> <strong>Markers</strong><br />
y = -0,0527x + 2,4255<br />
3 5 7 9 11 13<br />
Laufweite der Banden [cm]<br />
Die Ausmessung der Banden <strong>des</strong> Senfs (rechte Seite <strong>des</strong> Gels) ergab die in der folgenden<br />
Tabelle gezeigten Laufweiten, und das daraus folgende Molekulargewicht.<br />
Tab.: 1 Ermitteltes Molekulargewicht der Banden<br />
Laufweite = x [cm] y = -0,0527x + 2,5255 Molekulargewicht 10 y [kDa]<br />
6,5 2,08295 121,05<br />
6,7 2,07241 118,14<br />
7,9 2,00917 102,13<br />
13,3 1,72459 53,04<br />
12
Die ausgewerteten Banden waren sowohl bei der belichteen, als auch bei der unbelichteten<br />
Pflanze zu erkennen.<br />
2. Anthocyan – und Leucocyanbestimmung<br />
2.1 Anthocyanbestimmung<br />
In der nachfolgenden Tabelle…………….. sind die Ergebnisse der photometrischen<br />
Bestimmung der beiden Senfpflanzen aufgeführt. Eine Extinktion E von 1 entspricht dabei<br />
einem Cyanidingehalt von 0,37µmol.<br />
Tab.2: Betimmung <strong>des</strong> Anthocyangehaltes<br />
Senfpflanze Extinktion E Cyanidingehalt [µmol]<br />
Unbelichtet 0,536 0,198<br />
belichtet 0,906 0,335<br />
In der etiolierten, Senfpflanze waren 0,198µmol Cyanidin enthalten. Die belichtete<br />
Senfpflanze enthielt 0,335µmol Cyanidin.<br />
2.2 Leucocyanbestimmung<br />
Die gemessenen Extinktionswerte der Leucocyanbestimmung sind in Tabelle ……….<br />
dargestellt. Da die Proben hierzu verdünnt wurden, müssen die Werte noch mit einem Faktor<br />
von 20 multipliziert werden. Hierbei entspricht eine Extinktion von 1 einer<br />
Cyanidinkonzentration von 0,37µmol. Von dem somit durch einen Dreisatz berechneten Wert<br />
der Cyanidinkonzentration muss nun noch der Anthocyangehalt aus 2.1 abgezogen werden,<br />
um auf den Leukocyangehalt zu kommen.<br />
Tab. 3: Bestimmung <strong>des</strong> Leucocyangehaltes<br />
Senfpflanze Extinktion Gesamtgehalt in<br />
µmol<br />
13<br />
Anthocyangehalt<br />
aus 2.1 [µmol]<br />
Leucocyangehalt<br />
[µmol]<br />
Unbelichtet 0,028 0,207 0,198 0,009<br />
belichtet 0,083 0,614 0,335 0,279<br />
Der Gehalt an Leucocyan in der unbelichteten, etiolierten Senfpflanze betrug 0,009 µmol. Der<br />
Gehalt an Leuyocyan in der belichteten Senfpflanze war 0,279µmol.
3. Messung der PAL – Enzymaktivität<br />
3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration<br />
Die im Photometer ermittelten Extinktionen sind in Tabelle ……….. aufgelistet. Hierbei<br />
entspricht eine Extinktion von 0,22 einer Proteinmenge von 1mg.<br />
Tab.4 : Bestimmung der Proteinmenge<br />
Senfpflanze Extinktion Menge an Protein [mg]<br />
Unbelichtet 0,878 3,991<br />
belichtet 1,280 5,818<br />
In 2g der unbelichteten, etiolierten Senfpflanze waren 3,991mg an Proteinen enthalten.<br />
Dieselbe Menge der belichteten Pflanze wies hingegen 5,818mg an Proteinen auf.<br />
3.2 Photometrische Detektion von Zimtsäure und Bestimmung der PAL-Aktivität<br />
Die im Photometer ermittelten Extinktionen sind in Tabelle ………..erfasst.<br />
Tab. 5: Detektion der Zimtsäure<br />
Zeitpunkt der Messung Extinktion E1 der<br />
unbelichteten Senfpflanze<br />
14<br />
Extinktion E2 der belichteten<br />
Senfpflanze<br />
t0 1,892 2,226<br />
t5 2,015 2,178<br />
t10 2,226 2,226<br />
Aus den obigen Werten lässt sich nun die Enzymaktivität der PAL im belichteten und im<br />
unbelichteten Keimling berechnen. Die Formel für die Berechnung lautet:<br />
A<br />
E =<br />
Zimtsäure[<br />
nmol]<br />
t[min]<br />
* m [ mg]<br />
Pr otein<br />
Für den unbelichteten Keimling ergibt sich nun folgende Enzymaktivität:<br />
- dE = Et10 – Et0 = 2,226 – 1,892 = 0,334<br />
Nach Lambert-Beer ergibt sich also folgende Konzentration der Zimtsäure:<br />
c = ∆E / ε*d = 0,334/(10 7 cm 2 /mol * 1cm) = 33,4 nmol/ml<br />
Da die Probe im Verhältnis 1:6 verdünnt war ergibt sich letztendlich eine Konzentration von<br />
200 nmol/ml.<br />
Die resultierende Enzymaktivität beträgt:<br />
AE = 200nmol/ml / 10 min* 3,991mg = 5 nmol/ (min*mg*ml)
Da bei der belichteten Pflanze die Extinktionswerte zu Beginn und am Ende gleich sind, ist es<br />
nicht sinnvoll eine Berechnung der Enzymaktivität durchzuführen, da hieraus eine<br />
Konzentration der Zimtsäure von 0 resultieren würde und somit auch die Enzymaktivität 0<br />
wäre.<br />
15
D) Diskussion<br />
1. SDS-PAGE<br />
Durch die SDS-PAGE konnte gezeigt werden, dass sowohl in der unbelichteten Probe, als<br />
auch in der belichteten Probe Proteine vorhanden waren. Es wäre jedoch zu erwarten<br />
gewesen, dass das Bandenmuster nicht wie in unserem Fall identisch ist, denn im<br />
unbelichteten Zustand werden andere Proteine synthetisiert als im belichteten. Außerdem<br />
wären in der unbelichteten Probe mehrere verschiedene Proteinbanden zu erwarten gewesen,<br />
da die Speicherproteine oftmals erst bei Belichtung abgebaut werden (siehe Aktivität der<br />
PAL).<br />
2. Anthocyan- und Leukocyanbestimmung<br />
Bei der Bestimmung <strong>des</strong> Anthocyangehaltes zeigte sich, dass in der belichteten Probe mehr<br />
Anthocyane enthalten waren, als in der unbelichteten (0,335 µmol gegenüber 0,198 µmol).<br />
Dies war auch zu erwarten, da die Synthese dieser Farbstoffe durch die Aktivität der PAL<br />
bestimmt wird, welche durch Belichtung induziert wird. Die PAL wandelt Phenylalanin in<br />
trans-Zimtsäure um, aus der im Folgenden verschiedene sekundäre Pflanzenstoffe, u.a.<br />
Anthocyane, synthetisiert werden.<br />
Jedoch sollte man eigentlich erwarten, dass in der unbelichteten Pflanze gar keine Anthocyane<br />
enthalten sind, da deren Synthese wie schon erwähnt lichtabhängig ist. Die geringen<br />
Konzentrationen, die in unserem Fall vorhanden waren, lassen sich dadurch erklären, dass die<br />
Proben im belichteten Raum bearbeitet wurden, so dass die PAL aktiv werden konnte.<br />
Die Bestimmung der Leukocyane zeigte, dass im unbelichteten Keimling bereits<br />
Leukocyane, die Vorläufer der Anthocyane, enthalten waren. Es wäre zu erwarten gewesen,<br />
dass im etiolierten Keimling viele Leukocyane enthalten sind, da die Pflanze diese als<br />
Speicher anlegt, um bei Belichtung sofort mit der Synthese von Anthocyanen beginnen zu<br />
können.<br />
16
3. Messung der PAL-Aktivität<br />
Die Bestimmung der Proteinmasse im belichteten und im unbelichteten Keimling ergab, dass<br />
in der belichteten Pflanze mehr Proteinmasse vorhanden war, als im etiolierten Keimling.<br />
Die Photometrie der Zimtsäure ergab keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Die Werte für die<br />
Extinktion bei der unbelichteten Pflanze zeigen den richtigen Trend, jedoch fiel beim<br />
belichteten Keimling die Extinktion zunächst ab, um bei der nächsten Messung auf den<br />
Ausgangswert zurück zu gelangen. Da der letzte Messwert bei beiden Pflanzen exakt<br />
identisch war, liegt die Vermutung nahe, dass das etwas ältere Photometer keine genauen<br />
Werte lieferte. Es wäre zu erwarten gewesen, dass die Extinktion zu Beginn bei der<br />
belichteten Pflanze höher ist, dass die Extinktion bei der unbelichteten Pflanze im Verlauf der<br />
Messungen jedoch stärker zunimmt, als bei der belichteten Pflanze.<br />
Die aus diesen Extinktionsmessungen resultierenden PAL-Aktivitäten sind daher keinesfalls<br />
repräsentativ. Wie dem Ergebnisteil zu entnehmen ist, zeigte die PAL im belichteten Zustand<br />
keinerlei Aktivität.<br />
Es wäre zu erwarten gewesen, dass die PAL-Aktivität bei längerer Belichtung zunimmt.<br />
17
Weiterführende Fragen<br />
Was bedeutet -L-Aminosäure? Welche Aminosäure in Abb.1 <strong>des</strong> Praktikumsskripts<br />
Proteine besitzt unter diesem Aspekt eine Besonderheit?<br />
Eine α-L-Aminosäure ist eine Aminosäure, die eine Amino- und eine Carboxylgruppe an<br />
einem chiralen (assymmetrischen) α - C-Atom gebunden hat. Dies verleiht dem Molekül eine<br />
optische Aktivität. Das L bedeutet, dass das Molekül in der Fischer-Projektion, die<br />
Aminogruppe auf der linken Seite <strong>des</strong> chiralen C-Atoms hat.<br />
Die Aminosäure Threonin hat, im Gegensatz zu den anderen abgebildeten Aminosäuren, ein<br />
zweites chirales Zentrum.<br />
PAL wird in der Pflanzenentwicklung neu synthetisiert. Können sie andere<br />
Mechanismen der Regulierung der Enzymaktivität nennen?<br />
Andere Mechanismen zur Regulierung der Enzymaktivität sind zum Beispiel die Endprodukt-<br />
Repression, die allosterische Hemmung oder Feedforward-Stimulierung. Bei der Endprodukt-<br />
Repression wird durch die Anhäufung <strong>des</strong> Endproduktes die Enzymsynthese gehemmt<br />
(Feedback-Hemmung). Bei der allosterische Hemmung werden die Enzyme durch so<br />
genannte Regulator-Moleküle (Effektoren oder Modulatoren) beeinflusst. Diese Moleküle<br />
hemmen das Enzym durch Binden an ein allosterisches Zentrum am Enzym. Dadurch kommt<br />
es zu einer Konformationsänderung <strong>des</strong> Enzyms und es verliert seine Funktion. Bei den<br />
Regulatoren kann es sich um das Substrat der vom Enzym katalysierten Reaktion oder um<br />
andere Stoffe handeln. Viele Enzyme sind auch nur in Kombination mit einem Cofaktor aktiv.<br />
Fehlt dieser, hat das Enzym keine Wirkung. Eine andere Form der Enzymregulierung ist die<br />
Interkonversion. Hier wird das Enzym durch eine Modifikation, zum Beispiel eine<br />
Phosphorylierung, verändert. Dies kann, je nach Enzym und Modifikation zu einer<br />
Aktivierung oder einer Deaktivierung <strong>des</strong> Enzyms führen. Wird die Enzymsynthese durch ein<br />
Produkt eines vorgeschalteten Stoffwechsels gesteuert, spricht man von einer Feedforward-<br />
Stimulierung.<br />
18
Warum wandern bei der SDS-PAGE alle Proteine zur Anode?<br />
Bei der SDS-PAGE werden die Proteine der Probe mit SDS (Natriumdodecylsulfat), einer<br />
Seife, denaturiert. SDS-Moleküle haben einen hydrophoben Schwanz und einen polaren,<br />
negativ geladenen Kopf. Diese Moleküle lagern sich mit den negativen Ladungen nach<br />
außen an die Proteine an, die somit Kationen gleichen. Kationen wandern immer in Richtung<br />
der Kathode.<br />
Sehen Sie bei der Gelelektrophorese im Vergleich <strong>des</strong> Materials Unterschiede?<br />
Im Gegensatz zur „normalen“ Gelelektrophorese wird hier ein Gel verwendet, das aus zwei<br />
Phasen besteht. Bei der Gelelektrophorese läuft die Probe durch ein einphasiges Gel.<br />
Der Vorteil <strong>des</strong> zweiphasigen Gels ist, dass die Proben auf ein Level gebracht werden und<br />
so alle den gleichen Startpunkt haben. Ein weiterer Vorteil gegenüber der Gelelektrophorese<br />
ist die Verwendung eines ungiftigen Farbstoffes (Coomassie Brilliant Blue G), bei der<br />
Gelelektrophorese wird toxisches Ethidiumbromid verwendet. Doch auch bei der SDS-PAGE<br />
werden giftige Substanzen verwendet (Acrylamid und Bisacrylamid, Bestandteile <strong>des</strong><br />
Trenngels), die aber nach dem Polymerisieren nicht mehr toxisch sind. Ein auf den<br />
Farbstoffen beruhender Unterschied ist, dass das Gel aus der Gelelektrophorese nur auf der<br />
UV-Box betrachtet werden kann, bei dem PAGE-Gel kann man ohne Hilfsmittel das Ergebnis<br />
ablesen.<br />
19