Evolution isolierter Teilpopulationen der Laubholz-Säbelschrecke ...

Material und Methoden
Fa. Greiner bio-one) gegeben und mit einem Code versehen, der aus einer maximal
dreistelligen Zahlen-/Buchstabenkombination besteht (Tab. 2.6A-1 für die
RAPD-Analyse und 2.6A-2 für die AFLP-Analyse; Anhang A). Dies sollte verhindern,
dass es durch undeutliche Beschriftung (etwa der kleinen 200 μl-
Reaktionsgefäße) zu Verwechselungen kam. Mit diesem Code wurden vorbereitend
zu jedem Arbeitsschritt Reaktionsgefäße entsprechend markiert. Wurde der
Kopf für die Untersuchungen verwendet, wurde nach dem Abtrennen vom
Rumpf zunächst der Proventriculus entfernt, um sicherzustellen, dass keine
Fremd-DNA in den Aufreinigungsprozess eingeht. Von dem Femur konnte das
Muskelgewebe am einfachsten entfernt werden, indem der proximale Teil des
Postfemurs aufgetrennt wurde. Anschließend konnte das Gewebe schabend herausgedrückt
werden. Kopf und Femurmuskulatur wurden auf einer Petrischale
mit einem Skalpell unter sterilen Bedingungen zerkleinert. Die zerstoßene Gewebeprobe,
die jeweils ein Gewicht von 10-20 μg aufwies, wurde in ein 1,5 ml-
Reaktionsgefäß gegeben. Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen wurden vor ihrem
Einsatz autoklaviert (Autoklav: Bioklav, Fa. Schütt). Die Isolation der DNA erfolgte
nach einem modifizierten Protokoll von Blin & Stafford (1976). Zu dem
Gewebe wurden anschließend 350 μl Gewebelysispuffer und 100 μl Proteinase
K (10 mg/ml) hinzugefügt. Der Ansatz inkubierte über Nacht bei 56 °C im
Wasserbad (1083, Fa. GFL). Am folgenden Tag wurde jede Probe jeweils ein
Reaktionsgefäß mit 500 μl Chlorophorm und ein Reaktionsgefäß mit 96 % unvergälltem
Alkohol vorbereitet. Zum gelösten Gewebe wurden dann 500 μl
Phenol hinzugegeben. Die Proben wurden anschließend durchmischt (Gerät:
Vortex Genie II) und fünf min bei 14000 U/min zentrifugiert (Eppendorf 5417
C). Nun waren zwei Phasen deutlich voneinander getrennt. Die obere Phase
wurde in das jeweils mit 500 μl Chlorophorm vorbereitete Reaktionsgefäß gegeben.
Die Probe wurde durchmischt und fünf min bei 14000 U/min zentrifugiert.
Anschließend wurde die nun sichtbare obere Phase in das mit Ethanol vorbereitete
Reaktionsgefäß gegeben und vermischt. Hierauf fällt die in der Lösung befindliche
DNA aus. Nach abermaligem Zentrifugieren der Probe bei
14000 U/min setzt sich die DNA am Boden des Gefäßes als Pellet ab. Das Ethanol
konnte nun verworfen werden und die isolierte Erbsubstanz wurde an der
Luft getrocknet bevor sie in 50 μl TE (Tris-EDTA) gelöst wurde. Mit einem
Photometer wurde die DNA-Konzentration und der Grad der Verunreinigung
(Quotient der gemessenen Wellenlänge bei 260 zu 280 nm) bestimmt, um zu
ermitteln, welche Menge TE hinzu gegeben werden musste, um in jeder Probe
eine Konzentration von etwa 100 ng/μl zu erhalten (Tabelle 3.7A-1; Anhang).
Nach Verdünnung der DNA-Lösung wurde eine erneute Messung durchgeführt.
Diese diente zur Überprüfung, ob die Konzentration etwa 100 ng/μl betrug. Die
gelöste und verdünnte DNA wurde in einem handelsüblichen Kühlschrank bei
etwa 4±1 °C über kürzere Zeiträume, sowie in einer Thermokammer bei – 20 °C
über längere Zeiträume aufbewahrt.
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