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B L I T Z L I C H T
siRNA-Design
Optimierung des siRNAvermittelten
Gene Silencing
Steve Kulisch, Teresa Esch, Christina Whitman-Guliaev und Teresa Rubio,
Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein intrinsischer zellulärer Mechanismus, der in den meisten Eukaryonten
konserviert ist. Er hilft, die Expression von Genen zu regulieren, die entscheidend für
die Bestimmung des Zellschicksals, für Differenzierung, Überleben und Verteidigung gegen
virale Infektionen sind. Forscher nutzen diesen natürlichen Mechanismus, um synthetische,
Doppelstrang-RNAs (dsRNAs) für das sequenzspezifische Gene Silencing zu entwerfen und
damit die Funktion des Gens aufzuklären 1-3 . Diese Ansätze helfen dabei, schnell von der Entdeckung
und Erforschung zu potentiellen therapeutischen Applikationen zu kommen 4 .
Seit dem erstmaligen Nachweis, daß 19-23
Nukleotide (nts) lange „small interfering
RNAs“ (siRNAs) das genspezifische Silencing
vermitteln 5 , wurde versucht, mittels
siRNA-Design die Spezifität und Wirksamkeit
zu verbessern und off-target-Effekte zu
reduzieren 6-8 . Obgleich traditionelle synthetische
siRNAs wirksam sind, die auf dem
21-23-mer-Design basieren, führte erst ein
besseres Verständnis der genauen Vorgänge
und Enzyme, die in den RNAi-Signalweg
involviert sind, zu deutlichen Verbesserungen
des Designs von siRNAs. Diese wurden
dadurch noch effizientere Werkzeuge für die
Induktion, Kontrolle und Interpretation von
Gene Silencing-Ereignissen in der täglichen
Forschung 9-10 . Dieser Artikel beschreibt
Studien von Forschern der City of Hope
und von Integrated DNA Technologies
(IDT), die zur Entwicklung eines solchen
Werkzeugs führte – der Dicer-Substrat
siRNA – einem hochpotenten Mediator der
RNA-Interferenz.
RNAi-Übersicht
Der RNAi-Signalweg ist Teil eines größeren
Netzwerkes, das kleine RNA-Moleküle als
Regulatoren zellulärer Signale nutzt und basiert
auf dsRNA als Schalter für das sequenzspezifische
Gene Silencing (Abb. 1). In diesem
Signalweg assoziieren längere dsRNAs mit
der Dicer-Endonuklease, einer RNase III,
die die dsRNA exakt in kleinere funktionelle
siRNAs schneidet 11 . Diese siRNAs assoziieren
mit dem sogenannten RNA-induzierten
Silencing-Komplex (RISC), der auf eine
homologe mRNA für den Abbau abzielt.
Vor kurzem wurde vorgeschlagen, daß die
Dicer-Endonuklease zusätzlich zur Spaltung
längerer dsRNAs auch bei der Beladung
prozessierter dsRNAs in RISC und bei der
Bildung von RISC selbst eine Rolle spielt 12-14 .
Diese Hypothese half, die Entwicklung einer
neuen Klasse von siRNAs voranzutreiben,
den Dicer-Substrat siRNAs.
Dicer-Substrat-siRNA
Abb. 1: Aktivierung des RNAi-Signalweges durch dsRNAs. Lange dsRNAs werden durch die Dicer-
Endonuklease gespalten, um 21-23 nt-Duplexe zu bilden. Nach Spaltung werden die siRNA-Duplexe
in RISC eingebaut. Die Entwindung des siRNA-Doppelstranges führt zur Retention des Führungsstranges.
Dieser paart mit den komplementären mRNA-Sequenzen, die durch RISC gespalten und
abgebaut werden. Dies erlaubt das Silencing eines spezifischen Gens. Dicer kann zusätzlich zur
Spaltung von dsRNAs > 21 nt die Beladung von siRNAs in RISC erleichtern. Dies könnte erklären,
warum synthetische 21-mer-dsRNAs, die naturgemäß nicht mehr durch Dicer gespalten werden,
weniger effektiv sind als 27-mere derselben Sequenz. Da Dicer die Beladung beeinflussen kann
und da die siRNA-Struktur die Orientierung der Dicer-Bindung beeinflußt, können Dicer-SubstratsiRNAS
konstruiert werden, die die spezifische Spaltung durch Dicer und die bevorzugte Retention
des zur Ziel-mRNA komplementären Führungsstranges fördern.
Während lange (>30 nt) dsRNAs erfolgreich
zur Regulation der Genexpression in einer
Vielzahl von eukaryotischen Organismen,
wie etwa von Pilzen, Pflanzen und C. elegans,
genutzt werden konnten 15-17 , aktivierten
sie bei Applikation in Säugersystemen oft
intrinsische zelluläre Immunantworten,
die zu einem breiten unspezifischen Abbau
von mRNAs führen 18-19 . Um die Aktivierung
dieser Immunantworten in RNA-Interferenz-
Experimenten zu verhindern, verwenden
Forscher normalerweise kürzere dsRNAs 20 .
Neuere Studien zeigen indessen, daß
dsRNAs mit einer Länge von 25-30 nt stärkere
Effektoren für das genspezifische Silencing
sind als 21-mere. Dabei sind 25-30mere
bis zu hundertfach potenter als 21-mer
18 | 7. Jahrgang | Nr. 6/2006 LABORWELT