PDF Download - Laborwelt

R E P O R T
Zur Induktion der RNAi können siRNAs entweder
als DNA-basierte Expressionssysteme
(shRNAs) oder direkt als RNA-Oligonukleotide
(siRNAs) in die Zelle gebracht werden.
in vivo-siRNA-Drug Delivery
Tab. 1: Applikationsformen von siRNAs zur
Induktion von RNAi in vivo
Applikationsform
Nackte siRNA
Liposomen
Lipoplexe
Kationische Lipide
Virosomen + kationische Lipide
Polyamine
Chemische Modifikationen
Chemische Modifikationen +
Lipid-Einkapselung
Elektropulsation
Histidin-Lysin-Komplexe
Atelocollagen-Komplexierung
Inaktivierte HVJ-Suspension
Kopplung an Protamin-Antikörper-
Fusionsprotein
Kopplung an Cholesterin
Nanoplexe
Polyethylenimin-Komplexe
niger Sekunden in die Schwanzvene injiziert
werden, entsprächen rund drei Litern einer
intravenösen Bolus-Injektion im Menschen.
Alternative Strategien zur Applikation
nackter siRNAs sind häufig auf die lokale
Anwendung oder zumindest eine Applikation
nahe dem Zielgewebe oder Zielorgan begrenzt.
So wurden etwa intravenöse, intraperitoneale,
subretinale, intrathecale, intranasale,
intratracheale, intradermale, intratumorale,
intraoculare oder intraventrikulare Applikationen
beschrieben. Beachtet werden sollte
auch, daß zahlreiche Studien relativ große
Mengen siRNA (im Bereich zehn bis hundert
mg/kg Körpergewicht) verwenden, was die
Gefahr unspezifischer Nebenreaktionen wie
einer intrazellulären Immunantwort erhöhen
kann. Alternative Ansätze für die Applikation
von siRNAs basieren auf ihrer Verpackung
in verschiedenen, teilweise modifizierten
Liposomen oder kationischen Lipiden zur
systemischen oder lokalen Anwendung.
Mit gegen apoB gerichteten siRNAs in sogenannten
SNALPs (stable nucleic acid lipid
particles) wurde kürzlich die erste Studie in
Primaten veröffentlicht. Schließlich sind eine
Reihe anderer Strategien, wie beispielsweise
chemische Modifikationen von siRNA-Molekülen,
Elektropulsation, Virosomen, die Verwendung
von Polyaminen, anderer basischer
Komplexe oder Atelocollagen zur Komplexierung,
sowie die Kopplung an bestimmte
Protein-Präparationen oder niedermolekulare
Verbindungen beschrieben worden (vgl. Tab.
1). Obwohl die Entwicklung von auf siRNAs
basierenden Therapeutika erst vor wenigen
Jahren begonnen wurde, haben erste Phase
I-Studien bereits begonnen oder sind bereits
abgeschlossen. Acuity Pharmaceuticals (Philadelphia,
USA) testeten erfolgreich eine gegen
VEGF gerichtete siRNA bei der feuchten Form
der Altersblindheit (Altersabhängige Maculadegeneration
AMD), von der in Deutschland
etwa 490.000 Personen betroffen sind; auch Alnylam
(Respiratory Syncytial Virus, RSV) und
die von Merck Inc. Ende Oktober akquirierte
Sirna (AMD) haben Phase I-Studien initiiert.
Polyethylenimin-Komplexierung
Polyethylenimine (PEIs) sind synthetische
Polymere, die linear oder verzweigt in einem
breiten Molekulargewichtsbereich von 1000 kDa vorliegen können. Aufgrund
einer protonierbaren Stickstoffgruppe in
jeder dritten Position besitzen sie eine hohe,
vom pH-Wert abhängige, aber bereits unter
physiologischen Bedingungen kationische
Ladungsdichte. Daher sind sie in der Lage,
negativ geladene DNAs nicht-kovalent zu
komplexieren. Da die so gebildeten kompakten
kolloidalen Partikel von Zellen über verschiedene
Endozytosewege aufgenommen werden
können, wurde PEI zunächst als in vitro-DNA-
Transfektionsreagenz eingeführt 3,4 . Dem Mischungsverhältnis
zwischen Stickstoffatomen
Abb. 2: Einschleusen von siRNA-Molekülen
durch Polyethylenimin (PEI)-Komplexierung.
Negativ geladene siRNAs (rot) und positiv geladenes
PEI (blau) bilden einen nicht-kovalenten
Komplex, der über Endozytose in die Zelle
aufgenommen und dort – vermutlich aufgrund
des „Protonenschwamm-Effektes“ – aus dem
Endosom wieder freigesetzt wird. Die siRNA
kann nach Zerfall des Komplexes in RISC eingebaut
werden und RNAi induzieren.
Vorteile der direkten Applikation von siRNAs
bestehen darin, daß sie chemisch relativ
leicht synthetisiert werden können und ein
geringes Gefahrenpotential aufweisen, da
ihre Einschleusung nicht auf virale Systeme
angewiesen ist und sie nicht in das Genom integriert
werden können. Es müssen allerdings
folgende Bedingungen erfüllt sein: Schutz der
sehr instabilen siRNA gegen Abbau durch
(Serum-) Nukleasen, effiziente zelluläre Aufnahme,
keine intrazelluläre Immunstimulation
und effiziente intrazelluläre siRNA-Freisetzung
sowie in vivo geringe Toxizität und
keine schnelle Elimination durch Leber oder
Niere. In der Zellkultur stehen zahlreiche
Transfektionsreagenzien zur Verfügung. Weit
schwieriger ist die Applikation von siRNAs
zu therapeutischen Zwecken in vivo.
Hierzu ist in den vergangenen Jahren eine
größere Zahl an Studien publiziert worden,
die verschiedene Strategien zur systemischen
oder lokalen Applikation beschreiben. Unterscheidungsparameter
sind unter anderem der
Applikationsort beziehungsweise die Applikationsart,
siRNA-Modifikationen und der
Einsatz verschiedener Carriersysteme.
So können zur systemischen Applikation
chemisch unmodifizierte siRNAs verwendet
werden, deren Injektion häufig ohne weiteres
Reagenz durch die sogenannte hydrodynamische
Transfektion erfolgt. Während diese
Methode in einigen Fällen zur effizienten
Induktion von RNAi in Leber, aber auch in
Lunge, Milz, Pankreas und Niere führte, ist sie
für die Therapie am Menschen ungeeignet: die
mehr als 1 ml, die einer Maus innerhalb wedes
PEI und Phosphoratomen der DNA (sog.
N/P-Verhältnis) sowie der Kettenlänge und
dem Verzweigungsgrad des PEI kommen
dabei im Hinblick auf Größe und Ladung des
Komplexes sowie der Transfektionseffizienz
entscheidende Bedeutung zu.
Vermutlich kommt es nach Endozytose
intrazellulär in den Endosomen/Lysosomen
durch die Protonenakzeptorfunktion des PEI
an den noch nicht protonierten Stickstoffatomen
zu einem „Protonenschwammeffekt“,
der zum Abpuffern des sauren pH-Wertes in
diesen Kompartimenten sowie zum osmotisch
bedingten Platzen der Endosomen/Lysosomen
unter intrazellulärer Freisetzung der
Komplexe führt.
In neueren Studien wurden Polyethylenimin-basierte
Systeme für das Einschleusen
kleiner RNA-Moleküle wie siRNAs etabliert 5-7
(Abb. 2). Während chemisch nicht-modifizierte
siNRAs vergleichsweise rasch degradiert
werden und im Serum nur eine Halbwertszeit
von wenigen Minuten besitzen, sind sie nach
PEI-Komplexierung über Stunden hinweg
fast vollständig gegen enzymatischen oder
Kennziffer 14 LW 06 · www.biocom.de
8 | 7. Jahrgang | Nr. 6/2006 LABORWELT