TRANSFEKTION - H941 Department für Angewandte Genetik und ...
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� Deckglas korrekt auf Fuchs-Rosenthal-Kammer positionieren (� Tutor); Probe in Fuchs-<br />
Rosenthal-Kammer pipettieren (die Zellsuspension soll den Zwischenraum zwischen<br />
Deckglas <strong>und</strong> Kammer komplett ausfüllen)<br />
� Zellen zweier Grossquadrate im inversen Mikroskop bei 100-facher Vergrösserung<br />
auszählen<br />
� Mittelwert berechnen<br />
� Kalkulation: Gesamtzellzahl in 20 ml Zellsuspension = Zellen pro Grossquadrat � 10 5<br />
Das gesamte Zellpellet soll im Elektroporationspuffer (HBS-Puffer) aufgenommen werden. Zuerst muss<br />
allerdings ermittelt werden, wieviel Puffer zuzusetzen ist. Die gewünschte Zellkonzentration <strong>für</strong> die<br />
Elektroporation beträgt 8 � 10 6 Zellen pro ml Suspension.<br />
� Das <strong>für</strong> 8 � 10 6 Zellen pro 1 ml benötigte Volumen HBS-Puffer berechnen<br />
HBS-Puffer (Zusammensetzung): 21 mM Hepes/NaOH, pH 7.5<br />
137 mM NaCl<br />
0.7 mM Na2HPO4<br />
5 mM KCl<br />
6 mM Glukose<br />
� Überstand der in der Zwischenzeit pelletierten Zellsuspension absaugen; Zellen im<br />
berechneten Volumen HBS-Puffer durch Auf- <strong>und</strong> Abpipettieren resuspendieren<br />
� 800 µl dieser Suspension in ein steriles Hütchen überführen<br />
� vorsichtig mit 10 µg gereinigter Plasmid-DNA in 20 µl TE mischen<br />
� in sterile Einweg-Elektroporationsküvette (4 mm Schichtdicke) transferieren<br />
� Anordnung des Elektroporators überprüfen (� Tutor)<br />
Das Hauptgerät muss mit einer Einheit zur Kapazitätserweiterung ("capacitance extender") in Verbindung<br />
stehen. Dazu sind insgesamt drei (je ein metallisches, rotes <strong>und</strong> schwarzes) Kabel erforderlich. Das Element<br />
zur Pulskontrolle ("pulse controller") muss abgekoppelt werden. Der am Hauptgerät befindliche Kapazitätswahlschalter<br />
muss auf externe Quelle ("EXT") eingestellt sein.<br />
!!!Gerät bitte nur in Anwesenheit des Tutors verwenden!!!<br />
� Elektroporationsparameter einstellen: 300 V (am Hauptgerät), 960 µF (an der Einheit zur<br />
Kapazitätserweiterung); eingestellte Parameter überprüfen (Knöpfe am Hauptgerät)<br />
� Elektroporationsküvette in den Schlitten einsetzen, sodass die Elektroden mit den zwei<br />
metallbeschichteten Wänden der Küvette in Kontakt kommen; die beiden Puls-Knöpfe<br />
eindrücken <strong>und</strong> bis zum Ertönen des Signaltons gedrückt halten (dauert in der Regel 10-20<br />
Sek<strong>und</strong>en)<br />
Die Pulsdauer ist nicht mit der Zeitkonstante, einem wichtigen Parameter <strong>für</strong> die Effizienz der<br />
Elektroporation, zu verwechseln.<br />
Seite 12 von 24, Erstelldatum 12.09.2011
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