TRANSFEKTION - H941 Department für Angewandte Genetik und ...

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ZEITPLAN FÜR MOLEKULARBIOLOGIE ÜBUNGEN II (TRANSFEKTION) 12:30 13-15 15-16 16-17 17-17:30 !!9:00!! 13-14 14-15 15-16 16-17 17-17:30 MONTAG DIENSTAG Platzübernahme Zellkultur Bakterien animpfen Plasmidpräparation MITTWOCH DONNERSTAG DNA-Bestimmung Zellen ernten Transfektion Kadmiumchlorid- Zugabe* Luminometrie Proteinbestimmung Platzrückgabe Abschlussbesprechung * Bitte entweder Lukas Mach (Raum 05/63) oder Barbara Svoboda (Raum 05/62) kontaktieren, falls das Übungslabor verschlossen sein sollte. Es ist zulässig dass eine(r) die Kadmiumchlorid-Zugabe (zu je einem Probe- bzw. Kontrollansatz) für alle TeilnehmerInnen durchführt. Seite 6 von 24, Erstelldatum 12.09.2011
PRAKTISCHE ANLEITUNGEN Alle Arbeitsschritte sollten unter Verwendung von sterilen Glas- und Einwegpipetten, sterilen Kunststoff-Röhrchen und -Platten sowie sterilen Lösungen durchgeführt werden. Für die Analysen (Photometrie, Luminometrie, Proteinbestimmung) kann davon abgesehen werden. Tierische Zellkultur MONTAG Die Zellinie LTK - entstand aus Bindegewebszellen der Maus. Es handelt sich dabei um eine Thymidinkinase-negative Variante von L-Zellen, eine der ältesten etablierten Säugetierzellinien. ►► Frage 3: ist der TK - -Phänotyp dieser Zellinie für dieses Beispiel von Bedeutung? Kulturmedium: 500 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 50 ml FKS (Fötales Kälber-Serum) 5 ml Glutamin (0.2 M) 5 ml Penicillin/Streptomycin (je 10 mg/ml) ►► Frage 4: wieso wird FKS benötigt? wozu dienen Penicillin und Streptomycin? Passagieren von Zellinien Die Zellkulturen werden in Zellkulturschalen (100 mm Durchmesser) mit 10 ml Nährmedium bei 37°C in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit einer Kohlendioxidkonzentration von 5% gezüchtet. Kontaktiere den Tutor für eine Einführung zur Arbeit in einer sterilen Werkbank. � 1 Schale aus dem Inkubator entnehmen; der Zellrasen sollte konfluent sein (überprüfe dies mit Hilfe des inversen Mikroskopes) � Nährmedium mittels Vakuum absaugen, dann Zellrasen einmal mit 10 ml PBS waschen � 1 ml 0.25% Trypsin (in PBS) auf die Kulturen träufeln; 5-10 Minuten bei 37°C inkubieren (bis zum Ablösen der adhärenten Zellen � Zellen runden sich ab; überprüfe dies im Mikroskop) ►► Frage 5: wozu dient, biochemisch gesehen, der Zusatz von Trypsin? � 9 ml Nährmedium (auf 37°C vorgewärmt, � Wasserbad) mit einer sterilen Glaspipette zugeben; Zellen durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren von der Platte abspülen und homogen resuspendieren; kontrolliere im Mikroskop ob die Zellen tatsächlich abgelöst wurden � 6 ml Zellsuspension mit 14 ml Nährmedium verdünnen, mittels fünfmaligen Auf- und Abpipettierens mischen und dann je 10 ml in 2 frische Zellkulturschalen aussäen; Kulturen bis Mittwoch im CO2-Inkubator züchten Seite 7 von 24, Erstelldatum 12.09.2011
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