TRANSFEKTION - H941 Department für Angewandte Genetik und ...

Das Enzym Luziferase wurde ursprünglich aus Photinus pyralis, einem Leuchtkäfer, isoliert.
Dieses 62 kDa-Protein katalysiert in biolumineszenten Organismen die Produktion von Licht und
benötigt dafür Luziferin, ATP und molekularen Sauerstoff als Substrate:
Luziferase + Luziferin + ATP � Luziferase � Luziferyl-AMP + PPi
Luziferase � Luziferyl-AMP + O2 � Luziferase + Oxyluziferin + AMP + CO2 + h�
In der ersten Reaktion wird unter Verbrauch von ATP und der Produktion von Pyrophosphat
(PPi) Luziferyl-AMP als Zwischenprodukt gebildet, das im zweiten Schritt oxidativ zu
Oxyluziferin dekarboxyliert wird. Dabei werden Kohlendioxid, AMP und Licht (h�) freigesetzt.
Das Enzym benötigt Mg 2+ als Kofaktor.
Luziferase bietet sich vor allem aus folgenden Gründen als Reporter an: erstens kommt dieses
Protein in Säugerzellen normalerweise nicht vor, und zweitens sind die Bestimmungsmethoden
für dieses Enzym äusserst sensitiv - es können bereits Femtogramm-Mengen an Luziferase
nachgewiesen werden.
Grundsätzlich steht eine Reihe von Transfektionsmethoden zur Auswahl, um Plasmid-DNA in
Säugerzellen einzubringen. Prinzipiell unterscheidet man chemische und physikalische
Verfahren:
Die gängigsten chemischen Methoden beruhen auf der Ko-Präzipitation der Probe-DNA mit
Kalziumphosphat oder der Komplexierung des Plasmides mit einem positiv geladenen Träger,
zum Beispiel DEAE-Dextran oder kationischen Lipiden. Letztere werden häufig in der Form
von Liposomen eingesetzt.
Das wichtigste physikalische Transfektionsverfahren beruht auf Elektroporation der Zellen,
wobei deren Membranen durch das Anlegen eines elektrischen Feldes für Makromoleküle
durchlässig gemacht werden. In speziellen Fällen wie zum Beispiel der DNA-Impfung werden
Gewebe mittels Partikel-Beschusses transfiziert.
Worin liegen die Vorzüge der Elektroporation? Diese Technik zeichnet sich in erster Linie durch
ein breites Anwendungsspektrum aus. Viele Zelltypen sind durch andere Methoden gar nicht
oder nur schlecht transfizierbar. Die Elektroporation ist insbesondere für Suspensionskulturen
die Transfektionsmethode der Wahl. Ausserdem sind für die meisten gängigen Zellinien die
optimalen Elektroporationsparameter bereits bekannt. Es sollte aber auch festgehalten werden,
dass es sich bei der Elektroporation um ein experimentell relativ aufwendiges Verfahren handelt,
welches die Verfügbarkeit von kostspieligen Spezialgeräten erfordert und vieler Zellen bedarf.
Ein weiterer Nachteil der Elektroporation ist in der hohen Mortalität (meist grösser als 50%) von
optimalen Transfektionsbedingungen begründet.
Welche Parameter steuern den Prozess der Elektroporation? In erster Linie sind hier die
angelegte Spannung, die Kapazität des Gerätes und der Widerstand der eingesetzten
Zellsuspension anzuführen. Letztere Grösse wird durch die Zeitkonstante erfasst. Die
Zeitkonstante einer Elektroporation entspricht jener Zeit in Millisekunden, die nach dem
elektrischen Puls bis zum Abfall der Spannung auf 37% des ursprünglichen Wertes verstreicht.
Seite 4 von 24, Erstelldatum 12.09.2011