TRANSFEKTION - H941 Department für Angewandte Genetik und ...

MOLEKULARBIOLOGIE ÜBUNGEN II
(Beispiel D: Transfektion)
Beispielverantwortlicher:
Dr. Lukas Mach
Kolloquien: Donnerstag, 11:00 Uhr
Praktischer Teil: Montag, 12:30 - 17:30
Dienstag, 13:00 - 17:30
Mittwoch, 13:00 - 17:30
Donnerstag, 13:00 - 17:30
durchgeführt am
Department für Angewandte Genetik und Zellbiologie
Seite 1 von 24, Erstelldatum 12.09.2011

Generelle Hinweise zur Durchführung von Beispiel D
(Transfektion)
1. Durchführung des „Kolloquiums“:
Das „Kolloquium“ wird schriftlich durchgeführt. Jede Kandidatin/jeder Kandidat erhält fünf
Fragen, die in maximal 60 Minuten schriftlich zu bearbeiten sind. Eine dieser Fragen wird eine
Berechnung sein, daher bitte Taschenrechner zum „Kolloquium“ mitnehmen.
2. Beim Kolloquium verlangtes Wissen:
Das beim Kolloquium verlangte Wissen ist nicht auf die in den Kolloquiumsunterlagen
angeführten Fragen 1-17 beschränkt. Zusätzlich muss folgendes beherrscht werden:
� Normalisierung von Zellextrakten mittels Gesamtproteingehalt
� Prinzipien der Transkription und Genregulation
� Unterschiede zwischen Plasmiden und chromosomaler DNA
� Funktionsweise von Promotoren
� Kriterien für Reportergene und Reporterproteine (siehe auch Ergänzende Unterlagen unter
Literatur)
� Funktionsweise von Enzymen (generell)
� Eigenschaften von Säugetierzellen (generell)
� Eigenschaften von Bakterien (generell)
� Berechnungen: DNA-Bestimmung, Zellzahlbestimmung, spezifische Luziferase-
Aktivität und Induktionsindex (Beispiele siehe Anhang 4)
3. Verfassung des Protokolls:
Das Protokoll ist selbst zu verfassen und darf nur eigene Daten enthalten. Deswegen müssen
alle Rohdaten (DNA-Bestimmung, Luminometrie, Proteinbestimmung) dem Protokoll
beigelegt werden. Die Rohdaten sind eindeutig zu bezeichnen – es muss nachvollziehbar sein
von wem die jeweiligen Proben stammen, und um welche Probe es sich handelt. Unklar
beschriftete Rohdaten verschlechtern die Note. Der Code des ausgegebenen
Bakterienstammes (A oder B) muss angeführt werden. Es wird ausdrücklich vor der
Verwendung von Vorlagen aus den vergangenen Jahren gewarnt.
Die Protokolle sollten möglichst rasch verfasst werden. Eine Abgabe nach über 6 Monaten
bedingt eine Verschlechterung der Note. Protokolle mit manipulierten Daten werden
ausnahmslos mit Nicht Genügend beurteilt.
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EINLEITUNG
Liebe Übungsteilnehmerin, lieber Übungsteilnehmer!
In diesem Beispiel sollst Du die Aktivität eines Promotors in transfizierten Säugerzellen
untersuchen. Hierzu wird ein Plasmid, welches ein Reportergen unter der Kontrolle des zu
studierenden Promotors enthält, durch Elektroporation in kultivierte Mausfibroblasten
eingebracht. Die Produktion des Reportergenproduktes in den transfizierten Zellen ist als ein
Indiz für die Aktivität des Promotors zu sehen.
Das Beispiel kann in folgende experimentelle Abschnitte gegliedert werden:
q Säugerzellkultur
q Plasmid-Reinigung
q Transiente Transfektion
q Reportergenanalyse
Du erhältst folgende Ausgangsmaterialien: eine Gewebekulturflasche mit LTK - -Zellen sowie
eine Kolonie eines Escherichia coli-Stammes, der mit dem zu untersuchenden Plasmid
transformiert ist. Deine Aufgabe wird es sein, die LTK - -Zellen zu kultivieren (�
Säugerzellkultur), die Bakterien zu züchten und deren Plasmid zu isolieren (� Plasmid-
Reinigung), das gereinigte Plasmid in LTK - -Zellen zu transfizieren (� transiente Transfektion)
und abschliessend die Expression des Reporterenzyms Luziferase in den transfizierten LTK - -
Zellen enzymatisch nachzuweisen (� Reportergenanalyse).
Reportergen? transiente Transfektion?? nur noch Bahnhof??? Als eines der wichtigsten Lehrziele
dieser Übungen gilt es, Dich mit dem Vokabular des Molekularbiologen-Jargons vertraut zu
machen.
Reportergen: darunter versteht man die genetische Information für den "Reporter", welcher die
Aktivität des Promotors widerspiegelt. Meistens handelt es sich bei Reportern um Enzyme, die in
den transfizierten Zellen nicht vorkommen und einfach nachzuweisen sind. In unserem Fall wird
Luziferase, ein lichtbildendes Glühwürmchen-Enzym, als Reporter verwendet. Andere häufig
verwendete Reporter sind E. coli �-Galaktosidase (LacZ), E. coli �-Glukuronidase (GUS) und
das der Qualle Aequoria victoria entstammende Green Fluorescent Protein (GFP).
Transiente Transfektion: wenn bakterielle Plasmide in Säugerzellen eingebracht werden, blüht
ihnen meistens ein baldiger Rauswurf - nach einigen Tagen sind die meisten Zellen wieder
plasmidfrei. Deswegen wird dieser Vorgang als transiente Transfektion bezeichnet. In wenigen
transfizierten Zellen gelangt die Plasmid-DNA in den Zellkern und wird in die Wirt-DNA
eingebaut - diese Zellen sind stabil transfiziert. Während unter optimalen Bedingungen mehr als
50% der eingesetzten Zellen transient transfiziert werden können, liegt die Ausbeute an stabilen
Transfektanten meist unter 0.1%.
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Das Enzym Luziferase wurde ursprünglich aus Photinus pyralis, einem Leuchtkäfer, isoliert.
Dieses 62 kDa-Protein katalysiert in biolumineszenten Organismen die Produktion von Licht und
benötigt dafür Luziferin, ATP und molekularen Sauerstoff als Substrate:
Luziferase + Luziferin + ATP � Luziferase � Luziferyl-AMP + PPi
Luziferase � Luziferyl-AMP + O2 � Luziferase + Oxyluziferin + AMP + CO2 + h�
In der ersten Reaktion wird unter Verbrauch von ATP und der Produktion von Pyrophosphat
(PPi) Luziferyl-AMP als Zwischenprodukt gebildet, das im zweiten Schritt oxidativ zu
Oxyluziferin dekarboxyliert wird. Dabei werden Kohlendioxid, AMP und Licht (h�) freigesetzt.
Das Enzym benötigt Mg 2+ als Kofaktor.
Luziferase bietet sich vor allem aus folgenden Gründen als Reporter an: erstens kommt dieses
Protein in Säugerzellen normalerweise nicht vor, und zweitens sind die Bestimmungsmethoden
für dieses Enzym äusserst sensitiv - es können bereits Femtogramm-Mengen an Luziferase
nachgewiesen werden.
Grundsätzlich steht eine Reihe von Transfektionsmethoden zur Auswahl, um Plasmid-DNA in
Säugerzellen einzubringen. Prinzipiell unterscheidet man chemische und physikalische
Verfahren:
Die gängigsten chemischen Methoden beruhen auf der Ko-Präzipitation der Probe-DNA mit
Kalziumphosphat oder der Komplexierung des Plasmides mit einem positiv geladenen Träger,
zum Beispiel DEAE-Dextran oder kationischen Lipiden. Letztere werden häufig in der Form
von Liposomen eingesetzt.
Das wichtigste physikalische Transfektionsverfahren beruht auf Elektroporation der Zellen,
wobei deren Membranen durch das Anlegen eines elektrischen Feldes für Makromoleküle
durchlässig gemacht werden. In speziellen Fällen wie zum Beispiel der DNA-Impfung werden
Gewebe mittels Partikel-Beschusses transfiziert.
Worin liegen die Vorzüge der Elektroporation? Diese Technik zeichnet sich in erster Linie durch
ein breites Anwendungsspektrum aus. Viele Zelltypen sind durch andere Methoden gar nicht
oder nur schlecht transfizierbar. Die Elektroporation ist insbesondere für Suspensionskulturen
die Transfektionsmethode der Wahl. Ausserdem sind für die meisten gängigen Zellinien die
optimalen Elektroporationsparameter bereits bekannt. Es sollte aber auch festgehalten werden,
dass es sich bei der Elektroporation um ein experimentell relativ aufwendiges Verfahren handelt,
welches die Verfügbarkeit von kostspieligen Spezialgeräten erfordert und vieler Zellen bedarf.
Ein weiterer Nachteil der Elektroporation ist in der hohen Mortalität (meist grösser als 50%) von
optimalen Transfektionsbedingungen begründet.
Welche Parameter steuern den Prozess der Elektroporation? In erster Linie sind hier die
angelegte Spannung, die Kapazität des Gerätes und der Widerstand der eingesetzten
Zellsuspension anzuführen. Letztere Grösse wird durch die Zeitkonstante erfasst. Die
Zeitkonstante einer Elektroporation entspricht jener Zeit in Millisekunden, die nach dem
elektrischen Puls bis zum Abfall der Spannung auf 37% des ursprünglichen Wertes verstreicht.
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Eine Erhöhung des Widerstandes (sprich: eine Reduktion der Leitfähigkeit der Probe) führt zu
einer grösseren Zeitkonstante, was sowohl die Elektroporationseffizienz als auch die Mortalität
der Zellen erhöht. Die Zeitkonstante ist nicht mit der tatsächlichen Pulsdauer zu verwechseln,
welche 10-20 Sekunden beträgt.
Bis jetzt haben wir uns mit transienter Transfektion beschäftigt, aber wie könnte man permanent
oder stabil transfizierte Zellinien erhalten? Wie schon oben ausgeführt, handelt es sich beim
Vorgang der stabilen Transfektion um einen verhältnismässig ineffizienten Prozess. Es werden
daher spezielle Selektionsmarker benötigt, welche die Isolierung der wenigen stabil
transfizierten Zellen erlauben. Das für den jeweiligen Selektionsmarker kodierende Gen wird
entweder in das Probe-Plasmid eingebaut ("kloniert") oder als Bestandteil eines separaten
Selektionsvektors kotransfiziert. Bei den meisten Selektionsmarkern handelt es sich um
bakterielle Antibotikaresistenzgene. Daneben kommen auch einige Säugergene zum Einsatz.
Die am häufigsten eingesetzten bakteriellen Antibiotikaresistenzgene kodieren für
Aminoglykosid-Phosphotransferase (neo r ), Hygromycin B-Phosphotransferase (hyg r ) und
Puromycin-N-Acetyltransferase (pac r ). Allen diesen Enzymen ist gemein, dass sie die
Modifikation von mikrobiellen Translationshemmern katalysieren und diese dadurch
entschärfen. Weiters wird das Bleomycin-Resistenzgen eingesetzt, dessen Produkt das Zellgift
Bleomycin stöchiometrisch bindet und dadurch inaktiviert. Während mit ersteren
Selektionsmarkern isolierte Zellinien in der Regel nur wenige Kopien des heterologen Gens
tragen, kann durch Selektion mit Bleomycin eine höhere Kopienzahl erreicht werden.
Antibiotikaresistenzgene können generell in allen Säugerzellen als Selektionsmarker eingesetzt
werden.
►► Frage 1: welches der genannten Systeme würdest Du auswählen, um ein rekombinantes
Protein mit therapeutischer Relevanz, wie zum Beispiel einen
Blutgerinnungsfaktor, im biotechnologischen Maßstab zu produzieren?
Die Gruppe der als Selektionsmarker geeigneten Säugergene umfasst im Wesentlichen die
Enzyme Thymidinkinase (TK), Dihydrofolatreduktase (DHFR), Adenosindeaminase und
Glutaminsynthetase. Diese Marker können nur für die Transfektion von Zellinien mit einer
Defizienz des jeweiligen Enzyms (zum Beispiel LTK - -Zellen) verwendet werden. Der Einsatz
von DHFR und Adenosindeaminase erlaubt aus noch ungeklärten Gründen die nachträgliche
Amplifikation der stabil transfizierten DNA, was oft zur Erhöhung der Kopienanzahl der
eingeschleusten Gene ausgenützt wird. Mittels Selektion auf DHFR wurden bereits Zellinien mit
mehr als 1000 Kopien eines fremden Gens isoliert.
►► Frage 2: welchen grundsätzlichen Vorteil bietet die Verwendung säugereigener Selektionsmarker
gegenüber dem Einsatz von bakteriellen Antibiotikaresistenzgenen?
Soweit zur Theorie, erhole Dich kurz und gehe dann weiter zum praktischen Teil!
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ZEITPLAN FÜR MOLEKULARBIOLOGIE ÜBUNGEN II
(TRANSFEKTION)
12:30
13-15
15-16
16-17
17-17:30
!!9:00!!
13-14
14-15
15-16
16-17
17-17:30
MONTAG DIENSTAG
Platzübernahme
Zellkultur
Bakterien animpfen
Plasmidpräparation
MITTWOCH DONNERSTAG
DNA-Bestimmung
Zellen ernten
Transfektion
Kadmiumchlorid-
Zugabe*
Luminometrie
Proteinbestimmung
Platzrückgabe
Abschlussbesprechung
* Bitte entweder Lukas Mach (Raum 05/63) oder Barbara Svoboda (Raum 05/62)
kontaktieren, falls das Übungslabor verschlossen sein sollte. Es ist zulässig dass
eine(r) die Kadmiumchlorid-Zugabe (zu je einem Probe- bzw. Kontrollansatz) für
alle TeilnehmerInnen durchführt.
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PRAKTISCHE ANLEITUNGEN
Alle Arbeitsschritte sollten unter Verwendung von sterilen Glas- und Einwegpipetten, sterilen
Kunststoff-Röhrchen und -Platten sowie sterilen Lösungen durchgeführt werden. Für die
Analysen (Photometrie, Luminometrie, Proteinbestimmung) kann davon abgesehen werden.
Tierische Zellkultur
MONTAG
Die Zellinie LTK - entstand aus Bindegewebszellen der Maus. Es handelt sich dabei um eine
Thymidinkinase-negative Variante von L-Zellen, eine der ältesten etablierten Säugetierzellinien.
►► Frage 3: ist der TK - -Phänotyp dieser Zellinie für dieses Beispiel von Bedeutung?
Kulturmedium: 500 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)
50 ml FKS (Fötales Kälber-Serum)
5 ml Glutamin (0.2 M)
5 ml Penicillin/Streptomycin (je 10 mg/ml)
►► Frage 4: wieso wird FKS benötigt? wozu dienen Penicillin und Streptomycin?
Passagieren von Zellinien
Die Zellkulturen werden in Zellkulturschalen (100 mm Durchmesser) mit 10 ml Nährmedium
bei 37°C in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit einer Kohlendioxidkonzentration von
5% gezüchtet. Kontaktiere den Tutor für eine Einführung zur Arbeit in einer sterilen Werkbank.
� 1 Schale aus dem Inkubator entnehmen; der Zellrasen sollte konfluent sein (überprüfe dies
mit Hilfe des inversen Mikroskopes)
� Nährmedium mittels Vakuum absaugen, dann Zellrasen einmal mit 10 ml PBS waschen
� 1 ml 0.25% Trypsin (in PBS) auf die Kulturen träufeln; 5-10 Minuten bei 37°C inkubieren
(bis zum Ablösen der adhärenten Zellen � Zellen runden sich ab; überprüfe dies im
Mikroskop)
►► Frage 5: wozu dient, biochemisch gesehen, der Zusatz von Trypsin?
� 9 ml Nährmedium (auf 37°C vorgewärmt, � Wasserbad) mit einer sterilen Glaspipette
zugeben; Zellen durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren von der Platte abspülen und
homogen resuspendieren; kontrolliere im Mikroskop ob die Zellen tatsächlich abgelöst
wurden
� 6 ml Zellsuspension mit 14 ml Nährmedium verdünnen, mittels fünfmaligen Auf- und
Abpipettierens mischen und dann je 10 ml in 2 frische Zellkulturschalen aussäen; Kulturen
bis Mittwoch im CO2-Inkubator züchten
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Animpfen der Bakterienkultur
Jeder Teilnehmer erhält einen E. coli-Stamm, welcher mit einem Plasmid (entweder pHsp70-Luc
oder pCMV-Luc) transformiert wurde. pHsp70-Luc enthält einen durch Schwermetall-Zugabe
induzierbaren Promotor, während pCMV-Luc einen starken konstitutiven Promotor trägt. In
beiden Konstrukten reguliert der jeweilige Promotor die Expression des Reportergens
Luziferase. Mehr Information zu diesen Expressionsvektoren findest Du im Anhang dieser
Anleitungen.
� 50 ml LB-Medium steril in einen Erlenmeyerkolben unter Verwendung einer Einweg-
Plastikpipette (25 ml) überführen, dann 50 �l Ampicillin-Stammlösung (100 mg/ml in
Methanol) steril zugeben
� Mit einem sterilen Zahnstocher eine Kolonie der vom Tutor zur Verfügung gestellten
Agarplatte (entweder Stamm A oder Stamm B) aufnehmen, dann den Zahnstocher in das
Nährmedium überführen; stelle zuerst sicher, dass der ausgegebene Ausstrich nicht älter
als 4 Wochen ist
� Über Nacht bei 37°C (im Brutraum, nicht im Zellkulturlabor!) bebrüten
DIENSTAG
Präparation von Plasmid-DNA für die Transfektion
Jeder Teilnehmer benötigt rund 40 ml seiner (mittlerweile) gesättigten Bakterienkultur als
Ausgangsmaterial. Alle Arbeitsschritte sind in sterilen Gefässen durchzuführen. ACHTUNG:
die Zentrifugenröhrchen sind keine Einwegartikel – bitte die Röhrchen nach Gebrauch in der
Nährbodenküche in die Wanne mit der Aufschrift „Waschen“ stellen!
� Sorvall-Zentrifuge (Tutor) einschalten und SS-34 Rotor einsetzen; blaue Nadel
(gewünschte Temperatur) auf 22°C (Raumtemperatur) positionieren; Maximaltemperatur
(rote Nadel) auf 30°C einstellen
� Ein steriles Zentrifugenröhrchen (50 ml) mit Bakterienkultur bis zum Ring im obersten
Viertel befüllen (�40 ml); Röhrchen auf � 0.1 g austarieren; in der Sorvall-Zentrifuge bei
4000 � g (entspricht 6000 rpm im SS34-Rotor) und 22°C für 15 Minuten zentrifugieren;
bitte die Zentrifuge niemals in Abwesenheit des Tutors starten!
� Überstand in den Erlenmeyerkolben mit der restlichen Bakterienkultur zurückleeren
(� zur Entsorgung autoklavieren)
� Pellet in 4 ml Zellsuspensionspuffer (50 mM Tris/HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 200 µg/ml
RNase A; bei 4°C gelagert; � Tutor) durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren
resuspendieren; wenn dann noch Klumpen vorhanden sind, vorsichtig vortexen
►► Frage 6: wieso wird RNase A zum Zellsuspensionspuffer zugesetzt?
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� Suspension mit 4 ml Zellyselösung (0.2 M NaOH, 1% SDS) versetzen, SEHR vorsichtig
durch fünfmaliges Invertieren (Auf-den-Kopf-Stellen des verschlossenen Röhrchens)
mischen (!! NICHT VORTEXEN !!)
►► Frage 7: was bewirkt der Zusatz von SDS? weshalb wird NaOH zugegeben?
� 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
� 4 ml Neutralisationspuffer (3.1 M Kaliumacetat, pH 5.5) zusetzen und sofort durch
fünfmaliges Invertieren mischen
►► Frage 8: wozu kommt es im Zuge der Neutralisation?
� 10 Minuten bei 20000 � g (entspricht 13000 rpm im SS34-Rotor) und 22°C zentrifugieren
� Überstand in ein frisches steriles Zentrifugenröhrchen (50 ml) überführen und nochmals
für 10 Minuten wie oben zentrifugieren
� In der Zwischenzeit ein Anionenaustauscher-Säulchen mit blauem Haltering versehen, auf
ein Polypropylenröhrchen (50 ml) aufsetzen und 10 ml Äquilibrierungspuffer (0.1 M
Natriumacetat, pH 5.0, 0.6 M NaCl, 0.15% Triton X-100) durchsickern lassen
►► Frage 9: welche Eigenschaft von DNA wird bei der nachfolgenden Anionenaustauscherchromatographie
ausgenützt?
� Sorvall-Zentrifuge auf 4°C vorkühlen: dazu blaue Nadel auf 4°C stellen, leeren Rotor mit
Deckel verschliessen und für 20 Minuten bei 2000 rpm zentrifugieren
� Ein Stück Mullbinde über den Kopf des Säulchens spannen und den
Zentrifugationsüberstand (dieser sollte klar sein und kein Präzipitat aufweisen) durch die
Mullbinde auf das Säulchen auftragen; das Eluat verwerfen
� Säulchen zweimal mit je 10 ml Säulenwaschpuffer (0.1 M Natriumacetat, pH 5.0, 0.8 M
NaCl) waschen
� Säulchen auf ein steriles Corex-Röhrchen (Glas, 12 ml Fassungsvolumen) setzen und mit
Klebeband fixieren; DNA mit 5 ml Elutionspuffer (0.1 M Tris/HCl, pH 8.5, 1.25 M NaCl)
eluieren
� Säulchen abnehmen und verwerfen; Eluat mit 3.5 ml Isopropanol (Raumtemperatur)
versetzen, dann das Corex-Röhrchen mit Parafilm verschliessen und fünfmal invertieren
Dieser Schritt dient zur Aufkonzentrierung der Plasmid-Lösung nach der Anionenaustauscherchromatographie.
Ausserdem würde die hohe Ionenstärke des Elutionspuffers bei der Elektroporation den
Widerstand der Probe reduzieren und dadurch eine niedrigere Elektroporationseffizienz bewirken.
� Parafilm-Verschluss entfernen, dann Corex-Röhrchen auf der Aussenwand mit z.B. Deinen
Initialen markieren und mit passenden Adaptoren (grüngrau) in den SS34-Rotor
transferieren (Markierung soll nach aussen gerichtet sein); Maximaltemperatur der
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Zentrifuge (rote Nadel) auf 15°C einstellen; 30 Minuten bei 20000 � g und 4°C
zentrifugieren
Die Markierung des Röhrchens erleichtert die Lokalisierung des Pellets, welches ansonsten oft nur schwer
erkennbar ist.
� Überstand von jener der Markierung gegenüberliegenden Seite des Röhrchens vorsichtig
abheben und verwerfen; Präzipitat mit 3 ml 70% Äthanol (Raumtemperatur) waschen,
dann erneut für 5 Minuten wie oben zentrifugieren
� Überstand abheben und verwerfen; Pellet im Hybridisierofen bei 55°C trocknen (steht im
MoBiUE-1 Labor; � Tutor), dann mit 100 µl TE-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM
EDTA) versetzen und über Nacht bei 4°C (Kühlschrank) lösen
Quantifizierung der isolierten DNA
MITTWOCH
Die Konzentration des Plasmides wird durch Ermittlung der UV-Absorption der Lösung bei
260 nm ermittelt. Eine optische Dichte (OD) von 1.0 bei dieser Wellenlänge entspricht einem
DNA-Gehalt von 50 µg/ml.
� 5 µl Probe mit 995 µl TE-Puffer versetzen (Verdünnung 1:200), durch Vortexen mischen
� Quarzküvette (aus Lade unter Spektralphotometer) mit 1.0 ml TE-Puffer beschicken,
Nullwert des Photometers für OD260 und OD280 einstellen (� Tutor)
� Küvette entleeren; OD260 und OD280 der verdünnten DNA-Lösung bestimmen
� Küvette entleeren und gründlich mit ddW spülen; verdünnte DNA-Lösung verwerfen
� DNA-Konzentration der ursprünglichen Probe berechnen: OD260 � 10 = µg DNA/µl; ergibt
sich aus dem Verdünnungsfaktor und dem Extinktionskoeffizienten �260 � 20 für 1 mg/ml
DNA
� Reinheitsquotienten (OD260/OD280) berechnen (sollte 1.8 bis 2.0 betragen)
►► Frage 10: wodurch wird ein zu niedriger Reinheitsquotient bedingt? Wie würde sich dies
auf Dein Transfektionsexperiment auswirken?
� Ursprüngliche Probe mit TE auf eine Konzentration von 0.5 µg/µl verdünnen
� 20 µl der verdünnten Probe für Elektroporation einsetzen
Transiente Transfektion von Säugetierzellen
Plasmid-DNA kann, wie im theoretischen Teil bereits detaillierter ausgeführt, mittels
verschiedener Techniken in Säugetierzellen eingeschleust werden. Wir haben uns für die
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Methodik der Elektroporation entschieden. Dabei werden wie gesagt die Zellen einem
elektrischen Feld ausgesetzt, wodurch die Plasmamembran löchrig wird und exogene Plasmid-
DNA in die Zellen eindringen kann. Die transfizierte DNA kann in den Zellkern transportiert
und dort transkribiert werden. Allerdings kommt es dabei meist nur zu einer transienten
Transfektion, da der Grossteil der exogenen Plasmid-DNA mit der Zeit wieder aus den Zellen
verschwindet.
Die Zellen sollten für die Transfektion dicht angewachsen sein. Kontrolliere dies vor dem Weiterarbeiten unter
Zuhilfenahme des inversen Mikroskopes.
� Nährmedium von beiden Platten absaugen, dann beide Zellrasen einmal mit je 10 ml PBS
waschen
� 1 ml 0.25% Trypsin (in PBS) auf die Kulturen träufeln; 5-10 Minuten bei 37°C inkubieren
(bis zum Ablösen der adhärenten Zellen)
� Reaktion mit je 9 ml Nährmedium stoppen, dann Zellsuspensionen in einem sterilen
Polypropylenröhrchen (50 ml) vereinigen; mehrmals Auf- und Abpipettieren um eine
homogene Verteilung der Zellen zu gewährleisten
� Probe (50 µl) für Zellzahlbestimmung entnehmen
� Gesamte restliche Zellsuspension (20 ml) für 5 Minuten bei 300 � g (1300 rpm) in der
Kühlzentrifuge (� Tutor) abzentrifugieren
In der Zwischenzeit....... Zellzahlbestimmung:
Ansicht eines Grossquadrates einer mit Zellen beschickten Fuchs-Rosenthal-Kammer (jedes
Grossquadrat besteht aus 16 Kleinquadraten):
..... schwarze Zellen liegen innerhalb des Quadrates, daher zählen
..... weisse Zellen liegen ausserhalb des Quadrates, daher ignorieren
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� Deckglas korrekt auf Fuchs-Rosenthal-Kammer positionieren (� Tutor); Probe in Fuchs-
Rosenthal-Kammer pipettieren (die Zellsuspension soll den Zwischenraum zwischen
Deckglas und Kammer komplett ausfüllen)
� Zellen zweier Grossquadrate im inversen Mikroskop bei 100-facher Vergrösserung
auszählen
� Mittelwert berechnen
� Kalkulation: Gesamtzellzahl in 20 ml Zellsuspension = Zellen pro Grossquadrat � 10 5
Das gesamte Zellpellet soll im Elektroporationspuffer (HBS-Puffer) aufgenommen werden. Zuerst muss
allerdings ermittelt werden, wieviel Puffer zuzusetzen ist. Die gewünschte Zellkonzentration für die
Elektroporation beträgt 8 � 10 6 Zellen pro ml Suspension.
� Das für 8 � 10 6 Zellen pro 1 ml benötigte Volumen HBS-Puffer berechnen
HBS-Puffer (Zusammensetzung): 21 mM Hepes/NaOH, pH 7.5
137 mM NaCl
0.7 mM Na2HPO4
5 mM KCl
6 mM Glukose
� Überstand der in der Zwischenzeit pelletierten Zellsuspension absaugen; Zellen im
berechneten Volumen HBS-Puffer durch Auf- und Abpipettieren resuspendieren
� 800 µl dieser Suspension in ein steriles Hütchen überführen
� vorsichtig mit 10 µg gereinigter Plasmid-DNA in 20 µl TE mischen
� in sterile Einweg-Elektroporationsküvette (4 mm Schichtdicke) transferieren
� Anordnung des Elektroporators überprüfen (� Tutor)
Das Hauptgerät muss mit einer Einheit zur Kapazitätserweiterung ("capacitance extender") in Verbindung
stehen. Dazu sind insgesamt drei (je ein metallisches, rotes und schwarzes) Kabel erforderlich. Das Element
zur Pulskontrolle ("pulse controller") muss abgekoppelt werden. Der am Hauptgerät befindliche Kapazitätswahlschalter
muss auf externe Quelle ("EXT") eingestellt sein.
!!!Gerät bitte nur in Anwesenheit des Tutors verwenden!!!
� Elektroporationsparameter einstellen: 300 V (am Hauptgerät), 960 µF (an der Einheit zur
Kapazitätserweiterung); eingestellte Parameter überprüfen (Knöpfe am Hauptgerät)
� Elektroporationsküvette in den Schlitten einsetzen, sodass die Elektroden mit den zwei
metallbeschichteten Wänden der Küvette in Kontakt kommen; die beiden Puls-Knöpfe
eindrücken und bis zum Ertönen des Signaltons gedrückt halten (dauert in der Regel 10-20
Sekunden)
Die Pulsdauer ist nicht mit der Zeitkonstante, einem wichtigen Parameter für die Effizienz der
Elektroporation, zu verwechseln.
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� Zeitkonstante kontrollieren und vermerken (sollte 10-11 msec betragen)
� Zellsuspension zur Erholung für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
� mit 5 ml Nährmedium verdünnen (� Zellzahl entspricht � 1 × 10 6 Zellen/ml)
� 2 × 2 ml dieser Suspension in eine 6 well-Platte aussäen
Kontrollansätze: 2 wells mit je 5 × 10 5 LTK - -Zellen in 2 ml Medium beschicken
Die Kulturen sollten nach 18-24 Stunden für die gewünschten Experimente verwendet werden.
►► Frage 11: wieso werden für die Kontrollansätze wesentlich weniger Zellen ausgesät?
DONNERSTAG
Behandlung von Säugetierzellen mit CdCl2 (um 9:00 starten!)
� Zellkulturen auf eine Endkonzentration von 100 µM CdCl2 einstellen
(Zugabe von 20 µl der Stammlösung zu jeweils einem der beiden wells)
Stammlösung: 10 mM CdCl2 in doppelt destilliertem Wasser (ddW)
� 4 Stunden bei 37°C inkubieren
� Zellen für Luziferase-Nachweis einsetzen
Nachweis von Luziferase-Aktivität
� Kulturen vor dem Ernten im inversen Mikroskop betrachten: es sollten in allen wells
vergleichbar viele adhärente, ausgestreckte Zellen vorhanden sein. Vergleiche Deine
Proben mit den Kontrollansätzen. Zeige Deine Zellen dem Tutor, bevor Du mit dem
Ernten beginnst.
� Luziferase-Puffer erst unmittelbar vor Verwendung herstellen (10 ml; reicht für alle
Teilnehmer aus):
6.3 ml Basis-Puffer
10 mg DTT (ein Reduktionsmittel � stabilisiert Luziferase)
120 µl 0.1 M ATP (pH 7.8)
460 µl 1 mM Luziferin (gesamter Inhalt eines Hütchens)
3.1 ml ddW
Basis-Puffer: 25 mM Tricin, pH 7.8
0.5 mM EGTA (bindet Ca 2+ , welches Luziferase hemmt)
0.54 mM Natriumtripolyphosphat (inhibiert Phosphatasen)
16.3 mM MgSO4 (Kofaktor für Luziferase)
0.1% Nonidet P-40 (ein nicht-ionisches Detergens)
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� Nährmedium entfernen, Zellen zweimal mit je 2 ml PBS waschen
� Zellen mit je 0.3 ml Luziferase-Puffer lysieren
� 100 µl Probe bzw. Luziferase-Puffer (Blindwert) in eine 96 well-Platte (weiss)
transferieren; den Rest des Lysates in ein Hütchen überführen und in der Zwischenzeit in
einem Eisbad aufbewahren
� Auswertung im Multikanal-Luminometer (� Tutor)
Quantifizierung von Proteinen
Der Proteingehalt der Zellextrakte wird nach der Methode von Bradford ermittelt, welche auf der
Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G-250 durch
Bindung an Proteine beruht. Für die Proteinbestimmung wird ein kommerziell erhältliches
Farbreagenz (Fa. Bio-Rad) verwendet. Der Proteingehalt der Proben wird mittels einer mit
Rinderserumalbumin (BSA) generierten Kalibrationskurve bestimmt.
� Das Farbreagenz unmittelbar vor Verwendung mit ddW 1:5 verdünnen
� Eine Verdünnungsreihe des Standardproteins (BSA) herstellen: dazu die Stammlösung
(1 mg/ml BSA in ddW) mit ddW auf 0.2, 0.4, 0.6 und 0.8 mg/ml BSA verdünnen
� je 10 µl Probe bzw. Standardlösung (0.2 bis 1.0 mg/ml BSA) mit 1 ml verdünntem
Farbreagenz in einem Hütchen mischen
� Als Blindwerte ddW (Standards) sowie Luziferase-Puffer (Proben) mitführen
� in eine Kunststoff-Küvette (!! keine Quarzküvette verwenden !!) überführen
Alle Proben können in derselben Küvette gemessen werden. Dazu analysiert man zuerst den Standard-
Blindwert und die Standardreihe in aufsteigender Konzentration. Nach Spülen der Küvette mit dem
Blindwertansatz werden der Luziferasepuffer-Blindwert und die Proben bestimmt. Bitte alle ausgemessenen
Ansätze in einem Polypropylenröhrchen sammeln und dann in einem direkt in den Ausguss eines
Waschbeckens leeren, um ein Färben der Beckenwände zu vermeiden.
� OD595 im Spektralphotometer (� Tutor) ermitteln
� Kalibrationskurve (0.2 bis 1.0 mg/ml BSA) erstellen
� Proteingehalt der Extrakte berechnen
!!!GESCHAFFT!!!
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Noch nicht ganz.........Präsentation der Daten:
Die Rohdaten des Luziferase-Assays entsprechen der Zahl der von der Probe (beachte: 100 µl
Zelllysat) abgegebenen Lichtblitze pro Sekunde (cps � counts per second). Dieser Wert kann
durch Berücksichtigung des Proteingehaltes der Zellextrakte - ein Mass für die Zellzahl -
"normalisiert" werden, um den direkten Vergleich unterschiedlicher Proben zu ermöglichen.
Dazu wird eine spezifische Luziferase-Aktivität in cps/mg Protein berechnet. Dabei muss
berücksichtigt werden, dass der Proteingehalt als Konzentrationsangabe (mg Protein pro ml
Zelllysat) vorliegt.
Wichtig: Blindwert (Luziferasepuffer) von allen Proben abziehen!
Der Effekt von Cd 2+ -Ionen auf den analysierten Promotor wird als Induktionsindex angegeben.
Dieser ergibt sich aus dem Quotienten von cps/mg Protein (Cd 2+ ) und cps/mg Protein
(Kontrolle). In unserem Beispiel deutet ein Ergebnis von 0.5 � Induktionsindex � 2 auf den
konstitutiven Promotor hin, während ein Induktionsindex � 2 für den induzierbaren Promotor
spricht.
Ein typisches Ergebnis könnte so aussehen:
Luminometrie:
Blindwert
Luziferase-
LTK LTK LTK
+ Plasmid "H"
puffer Kontrolle Cd 2+
Kontrolle
(cps) (cps) (cps) (cps)
59
57
62
2138
Protein-Assay:
LTK LTK LTK
+ Plasmid "H"
Kontrolle
(mg/ml)
0.52
Cd 2+
(mg/ml)
0.44
Kontrolle
(mg/ml)
0.57
LTK
+ Plasmid "H"
Cd 2+
(mg/ml)
0.48
Seite 15 von 24, Erstelldatum 12.09.2011
LTK
+ Plasmid "H"
Cd 2+
(cps)
12362

Das Ergebnis könnte aber auch wie folgt aussehen:
Luminometrie:
Blindwert
Luziferase-
LTK LTK LTK
+ Plasmid "C"
puffer Kontrolle Cd 2+
Kontrolle
(cps) (cps) (cps) (cps)
59
57
62
9954
Protein-Assay:
LTK LTK LTK
+ Plasmid "C"
Kontrolle
(mg/ml)
0.52
Cd 2+
(mg/ml)
0.44
Kontrolle
(mg/ml)
0.47
LTK
+ Plasmid "C"
Cd 2+
(mg/ml)
0.44
Die spezifische Luziferase-Aktivität für die Plasmide "H" und "C" wäre:
LTK
+ Plasmid "H"
Kontrolle
(cps/mg)
36474
LTK
+ Plasmid "H"
Cd 2+
(cps/mg)
256313
LTK
+ Plasmid "C"
Kontrolle
(cps/mg)
210532
LTK
+ Plasmid "C"
Cd 2+
(cps/mg)
179864
Daher wäre der Induktionsindex für die Plasmide "H" und "C":
LTK
+ Plasmid "H"
Kontrolle
-
LTK
+ Plasmid "H"
Cd 2+
7.0
LTK
+ Plasmid "C"
Kontrolle
-
LTK
+ Plasmid "C"
Cd 2+
0.9
LTK
+ Plasmid "C"
Cd 2+
(cps)
7973
Wie bereits erwähnt wird die Aktivität des Hsp70-Promotors in Gegenwart von Kadmium-Ionen
deutlich stimuliert, während der starke konstitutive CMV-Promotor durch den
Schwermetallzusatz nicht nennenswert beeinflusst wird. Daher handelt es sich bei Plasmid "H"
um pHsp70-Luc, während Plasmid "C" pCMV-Luc darstellt.
Seite 16 von 24, Erstelldatum 12.09.2011

Zum Protokoll:
Das Protokoll soll folgendes enthalten:
Inhalt und Ziel des Beispiels (1 Paragraph)
Kurzabriss der Methodik (Zellkultur, DNA-Präparation, Transfektion)
Ergebnisse
Zusammenfassung ("Induzierbar oder nicht, das ist hier die Frage!")
Literatur:
Ergänzende Unterlagen: aus Current protocols in molecular biology : CP / ed.
by Frederick M. Ausubel .... - Losebl.-Ausg.. - New York, NY [u.a.] : Wiley, 1996. –
ISBN: ISBN: 0-471-50338-X. - ISBN: ISBN: 0-471-50337-1
Für dieses Beispiel sind vor allem Kapitel 9, Abschnitte 9.3 und 9.6 von Bedeutung. Ein Auszug daraus
liegt im DAGZ-Sekretariat in der Mappe "Transfektion" auf und kann zum Fotokopieren entlehnt
werden.
Animal cell culture: a practical approach / ed. by R. I. Freshney. - 2.
ed., repr.. - Oxford [u.a.]: IRL Press, 1994. - XIX, 329 S.. - ISBN:
ISBN: 0-19-963213-8. - ISBN: ISBN: 0-19-963212-X
Eine Einführung in die Grundlagen der Säugerzellkultur.
Molecular cell biology / Harvey Lodish ....[et al.]. 4 th ed.
W.H. Freeman and Company, 1999. ISBN: 0-7167-3136-3
Molecular Biology of the Cell / Bruce Alberts …. [et al.]. 4 th ed.
Garland Science, 2002. ISBN: 0-8153-3218-1
Auf diese Lehrbücher sind große Teile der Vorlesungen und Übungen aus Molekularbiologie
und Zellbiologie aufgebaut.
Auf ein gutes Gelingen!
Lukas Mach
Seite 17 von 24, Erstelldatum 12.09.2011

ANHANG 1: VERWENDETE PLASMIDE
Die beiden verwendeten Plasmide, pHsp70-Luc (siehe oben) und pCMV-Luc, unterscheiden sich
nur in der Promotor-Sequenz. Sie enthalten folgende Elemente:
"hsp70" bzw. "CMV": bei "hsp70" handelt es sich um die Promotorregion des Hsp70-Gens des
Menschen. Hsp70 ist ein sogenanntes Hitzeschockprotein mit einer Molekülmasse von 70 kDa.
Säugerzellen produzieren Hitzeschockproteine wie Hsp70 unter Stressbedingungen. Die Präsenz
von Schwermetallen im Kulturmedium bewirkt Stress, wodurch die Transkription des Hsp70-
Gens induziert wird. Beim Promotor des hsp70-Gens handelt es sich daher um einen
induzierbaren Promotor. Bei "CMV" handelt es sich um den Immediate/Early
Promotor/Enhancer des humanen Zytomegalovirus, einem starken konstitutiven Promotor.
►► Frage 12: was ist ein Promotor? was bedeutet konstitutiv?
►► Frage 13: könntest Du Dir einen molekularen Mechanismus vorstellen, wie Kadmium-
Ionen eine Induktion des hsp70-Promotors bewirken?
►► Frage 14: wodurch unterscheiden sich Enhancer-Elemente von Promotoren?
"Luciferase": dies ist das Gen für das Enzym Luziferase des Leuchtkäfers Photinus pyralis. Es
kodiert für ein Protein mit einer Molekülmasse von 62 kDa.
►► Frage 15: kommt Luziferase auch in Säugerzellen vor?
Seite 18 von 24, Erstelldatum 12.09.2011

"SV40 polyA": dies ist ein Polyadenylierungssignal aus der Sequenz des Simian Virus 40.
►► Frage 16: wozu
wird das Poly(A)-Signal benötigt? was würde in der Abwesenheit dieses
Signals
passieren?
"pBR ori": hierbei handelt es sich um den Replikationsursprung von pBR322, einem
Plasmid.
Diese Sequenz wird für die Vermehrung des Plasmides in Bakterien benötigt.
E. coli-
"amp": diese Sequenz kodiert für das Enzym �-Lactamase,
welches transfizierten Bakterien
Resistenz
gegen das Antibiotikum Ampicillin vermittelt.
►► Frage 17: mit welchen Naturstoffen ist Ampicillin verwandt? was bewirkt
nicht-transfizierten
E. coli-Bakterien? ist �-Lactamase spezifisch für Ampicillin?
ANHANG 2: ANTWORTEN ZU DEN FRAGEN 1-17
Ampicillin in
►► Frage 1: welches der genannten Systeme würdest Du auswählen, um ein rekombinantes
Protein mit therapeutischer Relevanz, wie zum Beispiel einen Blutgerinnungsfaktor, im
biotechnologischen
Maßstab zu produzieren?
Die Produktion von Gramm-Mengen eines rekombinanten Proteins in Säugerzellen ist sehr aufwendig und teuer. Es
ist daher äusserst wichtig dass die ausgewählte Zellinie über möglichst viele Kopien des heterologen Gens verfügt.
Mit grösster Wahrscheinlichkeit korreliert die Syntheserate des Proteins unserer Wahl mit jener des kotransfizierten
Selektionsmarkers. Also kann angenommen werden dass in Zellen mit hoher Markerkonzentration auch viel Produkt
gebildet wird. Nun reichen bereits kleinste Mengen an Enzymen wie neo
smässig mehr
kombinantes Protein synthetisieren, was ganz im Sinne einer biotechnologischen Anwendung wäre.
r oder hyg r aus, um relativ grosse Mengen
der für die Selektion eingesetzten Zellgifte (z.B. das Neomycin-Derivat G418 oder Hygromycin) zu inaktivieren.
Von einem stöchiometrisch bindenden Inhibitor wie dem Bleomycinresistenz-Protein wird dafür wesentlich mehr
benötigt. Es kann daher davon ausgegangen werden dass Bleomycin-resistente Wirtszellen verhältni
re
►► Frage 2: welchen grundsätzlichen Vorteil bietet die Verwendung säugereigener
Selektionsmarker
gegenüber dem Einsatz von bakteriellen Antibiotikaresistenzgenen?
Es wird heutzutage vermehrt über die Problematik antibiotikaresistenter Keime nachgedacht. Dieses Problem könnte
zumindestens theoretisch durch die grosstechnische Verwendung von Zellinien, die mit bakteriellen Antibiotikaresistenzgenen
transfiziert wurden, weiter verschärft werden. Daher wird nun intensiv versucht, Alternativen zur
Verwendung dieser Gene zu finden. Eine Möglichkeit beruht auf dem Einsatz von Säugerzellinien mit
metabolischen Defekten, wie z.B. der in diesem Beispiel verwendeten LTK s sollte aber betont werden,
ass die Etablierung solcher Zellinien mit erheblichem Aufwand verbunden sein kann.
- -Zellen. E
d
-
►►
Frage 3: ist der TK -Phänotyp dieser Zellinie für dieses Beispiel von Bedeutung?
transiente Transfektion dieser Zellinien. Der TK - -Phänotyp
er LTK - Die Thymidinkinase-Defizienz von LTK
-Zellen ist daher für uns nicht von Bedeutung.
- -Zellen kann zur Selektion stabil transfizierter Zellinien ausgenützt
werden. In diesem Beispiel beschränken wir uns auf eine
d
►►
Frage 4: wieso wird FKS benötigt? wozu dienen Penicillin und Streptomycin?
FKS enthält Hormone und Wachstumsfaktoren, die für die Kultivierung von Säugerzellen benötigt werden.
Penicillin und Streptomycin sind zwei Antibiotika mit unterschiedlicher Wirkungsweise, um die Kontamination der
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Kulturen mit Bakterien zu vermeiden. Penicillin unterbindet die Ausbildung von Zellwänden und verhindert damit
das Wachstum von gram-positiven und gram-negativen Bakterien, jedoch sind gram-positive Stämme empfindlicher
als gram-negative Keime. Penicillin kann durch das Enzym �-Lactamase, dem Produkt des Ampicillin-
Resistenzgens, inaktiviert werden. Viele Laborkeime, wie zum Beispiel auch die in diesem Beispiel verwendeten E.
coli-Stämme,
sind daher gegen dieses Antibiotikum resistent. Streptomycin greift in die prokaryotische
Proteinsynthese ein und ist daher auch gegenüber �-Lactamase-positiven Bakterien wirksam.
►► Frage 5: wozu dient, biochemisch gesehen, der Zusatz von Trypsin?
Säugerzellen sind in eine Matrix extrazellulärer Proteine und Proteoglykane eingebettet, welche die Anhaftung der
Zellen an Kunststoffoberflächen mediiert. Trypsin ist ein hochaktives proteolytisches Enzym, das die Komponenten
dieser extrazellulären Matrix abzubauen vermag. Die ursprünglich adhärenten Zellen runden sich dadurch ab und
lösen sich vom Boden des Zellkulturgefässes. Da Säugerzellen durch eine
übergebührliche Trypsinbehandlung
beschädigt
werden können, wird die Reaktion durch Zugabe von Kulturmedium gestoppt. Das dem Medium
zugesetzte FKS enthält Proteaseinhibitoren, die Trypsin rasch inaktivieren.
►► Frage 6: wieso wird RNase A zum Zellsuspensionspuffer zugesetzt?
Plasmid-DNA lässt sich durch das Verfahren der alkalischen Lyse (die nächsten zwei Arbeitsschritte) und die
nachfolgende Ionenaustauscherchromatographie nur schwer vollständig von bakterieller RNA abtrennen. Um eine
Kontamination des Plasmides mit RNA zu vermeiden, wird dem Ansatz RNase A zugegeben. Dieses Enzym ist sehr
stabil und verbleibt auch unter den harschen Bedingungen der alkalischen Lyse aktiv. Die durch die Behandlung mit
RNase A entstandenen RNA-Fragmente können dann durch Anionenaustauscherchromatographie effizient entfernt
werden. Es ist wichtig dass die verwendete RNase A frei von DNase-Aktivität ist. Dies ist experimentell relativ
einfach
durch Kochen der RNase A-Lösung zu erreichen. Das in diesem Beispiel verwendete RNase A-Präparat
wurde bereits entsprechend vorbehandelt, es bedarf also keiner nochmaligen Erhitzung der ausgegebenen
Lösung.
►► Frage 7: was bewirkt der Zusatz von SDS? weshalb wird NaOH zugegeben?
Das anionische Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) löst die Zellmembranen der Bakterien
auf, wodurch es zur
Lyse
der Zellen und damit zum Austritt des Zellinhaltes kommt. Durch den Zusatz von NaOH wird die
chromosomale DNA wie auch die Plasmid-DNA denaturiert, d.h. in Einzelstränge
zerlegt.
►► Frage 8: wozu kommt es im Zuge der Neutralisation?
Durch den Zusatz der schwach sauren Kaliumacetat-Lösung kommt es zu einer Renaturierung der DNA-
Einzelstränge. Während die supercoils der Plasmid-DNA eine nahezu vollständige Renaturierung gewährleisten,
wird die chromosomale DNA durch diese Behandlung quervernetzt und präzipitiert. Durch die Kalium-Ionen
kommt es auch zur Ausfällung von schwerlöslichem Kaliumdodecylsulfat,
welches Proteine und
Zellmembranbruchstücke
mitreisst. Das grossflockige Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt, wodurch eine
substantielle Anreicherung der Plasmid-DNA im Überstand erreicht wird.
►►
Frage 9: welche Eigenschaft von DNA wird
chromatographie ausgenützt?
bei der nachfolgenden Anionenaustauscher-
DNA ist aufgrund der Vielzahl an Phosphatgruppen stark negativ geladen und bindet daher gut selbst an schwach
basische Anionenaustauscher. Verunreinigende Proteine, Polysaccharide und RNA-Fragmente können durch
Waschen der Matrix mit einem Puffer niedriger Ionenstärke entfernt werden. Die gereinigte DNA wird dann mit
einem Puffer hoher Ionenstärke eluiert. Es sollte aber festgehalten werden, dass chromosomale DNA und Plasmid-
DNA durch dieses Verfahren nicht voneinander getrennt werden können. Eine etwaige Verunreinigung der
Plasmidpräparation mit chromosomaler DNA würde eine Überbestimmung des Plasmid-Gehaltes der Probe
bewirken, da sich Plasmid-DNA und chromosomale
DNA in ihren spektralen Eigenschaften nicht voneinander
unterscheiden.
Dies würde dann bei der Transfektion zu einer geringeren Anzahl an plasmidhältigen Zellen und
damit weniger Luziferase-Produktion führen.
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►► Frage 10: wodurch wird ein zu niedriger Reinheitsquotient bedingt? Wie würde sich dies
auf Dein Transfektionsexperiment auswirken?
Ein zu niedriger Reinheitsquotient der Plasmid-Lösung wird durch eine starke Verunreinigung mit Proteinen
bewirkt. Während das Extinktionsmaximum der Basen von DNA und RNA bei 260 nm liegt, absorbieren die
aromatischen Aminosäuren in Proteinen am stärksten bei 280 nm. Da Proteine aber auch bei 260 nm deutlich
absorbieren, würde eine substantielle Verunreinigung der Plasmidpräparation mit Proteinen eine Überbestimmung
des Plasmid-Gehaltes der Probe bewirken. Dies würde dann bei der Transfektion zu einer geringeren Anzahl an
plasmidhältigen
Zellen und damit weniger Luziferase-Produktion führen.
►► Frage 11: wieso werden für die Kontrollansätze wesentlich weniger Zellen ausgesät?
Im Zuge der Elektroporation stirbt ein Grossteil der Zellen ab. Unter den in diesem Beispiel verwendeten
Bedingungen kann die Mortalität bis zu 75% betragen. Um vergleichbar
viele vitale Zellen in Probe- und
Kontrollansätzen
zu erhalten, wird für die Kontrollen nur ein Viertel der nominellen Probenzellzahl eingesetzt.
►► Frage 12: was ist ein Promotor? was bedeutet konstitutiv?
Unter einem Promotor versteht man eine vor dem 5'-Ende des zu exprimierenden Gens liegende Regulatorsequenz,
die Bindungsstellen für RNA-Polymerase II und Transkriptionsfaktoren aufweist. Durch die Interaktion von
Transkriptionsfaktoren
mit der Promotor-Region
wird die Expressionsrate des jeweiligen Gens gesteuert.
Sogenannte starke Promotoren bewirken hohe Expressionsraten der von ihnen regulierten Gene. Wenn
die
Expression eines Gens durch Veränderung der Kulturbedingungen nicht oder nur unwesentlich beeinflusst wird,
besitzt dessen Promotor konstitutive Aktivität.
►► Frage 13: könntest Du Dir einen molekularen Mechanismus vorstellen, wie Kadmium-
Ionen eine Induktion des hsp70-Promotors bewirken?
In
der Promotor-Region des hsp70-Gens liegen einige sogenannte Hitzeschock-Elemente.
Diese Sequenzen können
von Hitzeschockfaktor (HSF), einem Transkriptionsfaktor, gebunden werden, was dann zu einer
gesteigerten
transkriptionellen Aktivität des Promotors führt. HSF kann durch verschiedenste Mechanismen aktiviert werden,
unter
anderem auch durch die Interaktion mit Schwermetall-Ionen.
►► Frage 14: wodurch unterscheiden sich Enhancer-Elemente von Promotoren?
Enhancer-Elemente liegen meist in grösserem Abstand zum Zielgen, können
in beide Richtungen des DNA-Stranges
aktiv
werden und weisen keine Bindungsstelle für RNA-Polymerase II auf.
►► Frage 15: kommt Luziferase auch in
Säugerzellen vor?
Säugerzellen weisen normalerweise keine endogene Luziferase-Aktivität auf. Bei der Expression von Luziferase in
Säugerzellen gibt es daher keinen Hintergrund.
►► Frage 16: wozu wird das Poly(A)-Signal benötigt? was würde in der Abwesenheit dieses
Signals passieren?
Das Poly(A)-Signal bewirkt eine effiziente Polyadenylierung der transkribierten mRNA. mRNAs ohne Poly(A)-
Region sind in
vivo höchst instabil und werden daher nicht effizient translatiert.
►► Frage 17: mit welchen Naturstoffen ist Ampicillin verwandt? was bewirkt Ampicillin in
nicht-transfizierten E. coli-Bakterien? ist �-Lactamase spezifisch für Ampicillin?
Ampicillin ist ein Derivat des Penicillins und unterbindet daher die Zellwandbiosynthese in Penicillin-sensitiven
Bakterienstämmen. Durch �-Lactamase, dem Produkt des bakteriellen amp r -Gens, wird Ampicillin wie Penicillin
und andere �-Lactam-Antibiotika inaktiviert.
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ANHANG 3: MÖGLICHE FEHLERURSACHEN
Arbeitsschritt
Zellen ernten: zu wenig Zellen
Plasmidreinigung: zu wenig DNA
DNA-Bestimmung: zu niedrige Werte
Fehlerursachen
Zellen hatten sich abgesetzt � wiederhole
Zellzahlbestimmung nach sorgfältiger Resuspendierung
der Zellen
oder:
Zellen verblieben nach der Trypsin-
Behandlung in den Schalen � wiederhole
Trypsinisierung oder verwende Zellen
Deiner Kollegen (wenn möglich)
Starterplatte war zu alt, daher Bakterienkultur
nicht gesättigt
oder:
Ampicillin nicht zugesetzt, daher verloren die
Bakterien das Plasmid
In beiden Fällen: Experiment mit vom Tutor
zur Verfügung gestellter DNA fortsetzen
Kunststoffküvetten verwendet � durch
Quarzküvette ersetzen
oder:
Orientierung der Küvette in der Halterung
falsch � überprüfen
oder:
Falsche Küvettenhalterung verwendet
� überprüfen
In allen Fällen: Messung wiederholen
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Arbeitsschritt
Elektroporation: zu geringe Zeitkonstante
Luminometrie: keine counts
Fehlerursachen
Anschlüsse falsch verbunden � überprüfen
oder:
Kapazitätserweiterungselement nicht
angeschlossen � überprüfen
oder:
Kapazitätswahlschalter am Hauptgerät nicht
auf "EXT" gestellt � überprüfen
In allen Fällen: Elektroporation wiederholen
Keine Zellen in den wells � mittels
Proteinbestimmung überprüfen
oder:
kein oder altes Luziferin verwendet �
frisches Luziferin (5 µl pro Probe) zusetzen
oder:
zu lange mit der Messung gewartet �
Messung sofort nach Lyse der Zellen
durchführen
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ANHANG 4: BERECHNUNGEN
Die Angaben für eine Berechnung im Rahmen des Kolloquiums könnten lauten:
Beispiel 1: DNA-Bestimmung
Verdünnung der DNA-Lösung: 1:200
OD260: 0.38
OD280: 0.21
OD260 = 1.0 entspricht einem DNA-Gehalt von 50 µg/ml. Berechne den DNA-Gehalt Deiner
Lösung sowie den Reinheitsquotienten.
(Auflösung: DNA-Gehalt 3.8 µg/µl; Reinheitsquotient 1.81)
Beispiel 2: Zellzahlbestimmung
Volumen an Zellsuspension: 20 ml
Zellen pro Grossquadrat: 92
Das zwischen Zählkammer und Deckglas eingeschlossene Volumen pro Grossquadrat entspricht
0.2 µl Zellsuspension. Berechne die Zahl der in Deiner Suspension enthaltenen Zellen und
ermittle das Volumen an HBS-Puffer, in dem Du das Zellpellet zur Erstellung einer Suspension
mit 8 � 10 6 Zellen/ml aufzunehmen hast.
(Auflösung: 9.2 � 10 6 Zellen; 1.15 ml HBS-Puffer)
Beispiel 3: spezifische Luziferase-Aktivität und Induktionsindex
Ansatz mit CdCl2: 9630 cps (Luminometrie)
0.62 mg/ml (Proteingehalt)
Kontrollansatz: 5207 cps (Luminometrie)
0.38 mg/ml (Proteingehalt)
Das Probenvolumen für die Luminometrie beträgt 100 µl. Bitte berechne die spezifische
Luziferase-Aktivität jeder Probe, ermittle den Induktionsindex und entscheide, ob es sich um
einen konstitutiven (0.5 � Induktionsindex � 2) oder induzierbaren (Induktionsindex � 2)
Promotor handelt.
(Auflösung: spezifische Aktivität (CdCl2) 155323 cps/mg Protein; spezifische Aktivität
(Kontrolle) 137026 cps/mg Protein; Induktionsindex 1.13 � konstitutiver Promotor)
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