TRANSFEKTION - H941 Department für Angewandte Genetik und ...
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� Nährmedium entfernen, Zellen zweimal mit je 2 ml PBS waschen<br />
� Zellen mit je 0.3 ml Luziferase-Puffer lysieren<br />
� 100 µl Probe bzw. Luziferase-Puffer (Blindwert) in eine 96 well-Platte (weiss)<br />
transferieren; den Rest des Lysates in ein Hütchen überführen <strong>und</strong> in der Zwischenzeit in<br />
einem Eisbad aufbewahren<br />
� Auswertung im Multikanal-Luminometer (� Tutor)<br />
Quantifizierung von Proteinen<br />
Der Proteingehalt der Zellextrakte wird nach der Methode von Bradford ermittelt, welche auf der<br />
Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G-250 durch<br />
Bindung an Proteine beruht. Für die Proteinbestimmung wird ein kommerziell erhältliches<br />
Farbreagenz (Fa. Bio-Rad) verwendet. Der Proteingehalt der Proben wird mittels einer mit<br />
Rinderserumalbumin (BSA) generierten Kalibrationskurve bestimmt.<br />
� Das Farbreagenz unmittelbar vor Verwendung mit ddW 1:5 verdünnen<br />
� Eine Verdünnungsreihe des Standardproteins (BSA) herstellen: dazu die Stammlösung<br />
(1 mg/ml BSA in ddW) mit ddW auf 0.2, 0.4, 0.6 <strong>und</strong> 0.8 mg/ml BSA verdünnen<br />
� je 10 µl Probe bzw. Standardlösung (0.2 bis 1.0 mg/ml BSA) mit 1 ml verdünntem<br />
Farbreagenz in einem Hütchen mischen<br />
� Als Blindwerte ddW (Standards) sowie Luziferase-Puffer (Proben) mitführen<br />
� in eine Kunststoff-Küvette (!! keine Quarzküvette verwenden !!) überführen<br />
Alle Proben können in derselben Küvette gemessen werden. Dazu analysiert man zuerst den Standard-<br />
Blindwert <strong>und</strong> die Standardreihe in aufsteigender Konzentration. Nach Spülen der Küvette mit dem<br />
Blindwertansatz werden der Luziferasepuffer-Blindwert <strong>und</strong> die Proben bestimmt. Bitte alle ausgemessenen<br />
Ansätze in einem Polypropylenröhrchen sammeln <strong>und</strong> dann in einem direkt in den Ausguss eines<br />
Waschbeckens leeren, um ein Färben der Beckenwände zu vermeiden.<br />
� OD595 im Spektralphotometer (� Tutor) ermitteln<br />
� Kalibrationskurve (0.2 bis 1.0 mg/ml BSA) erstellen<br />
� Proteingehalt der Extrakte berechnen<br />
!!!GESCHAFFT!!!<br />
Seite 14 von 24, Erstelldatum 12.09.2011
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