In-vitro Untersuchungen zum Einfluss von Kunststoffnetzen auf das ...

2 Material und Methoden Seite
2.4.5 Ki-67-Färbung
Die Zellen (je 5*10 5 ) wurden in PBS resuspendiert und die Suspension mit 0,1 % Natrium-
Azid in PBS gewaschen, um auch hier lösliches CD14 zu beseitigen. Anschließend wurden
die Zellen ebenfalls mit dem CD14-PerCP-Antikörper für 30 min im Dunkeln inkubiert.
Mit staining buffer (2 % FKS in PBS mit 0,1 % Natriumazid) und 0,1 % Natriumazid in
PBS wurde überschüssiger Antikörper ausgewaschen. Das Zellpellet wurde sodann in
50 % FKS in PBS mit 0,1 % Natriumazid gelöst und unter ständigem Schütteln wurde
tropfenweise 70 % Ethanol in ddH2O hinzugefügt. Dann wurde die Zelllösung bei 4 °C
über Nacht inkubiert. Der Alkohol wurde durch zweimaliges Waschen mit 0,1 %
Natriumazid in PBS ausgewaschen und die Zellen mit FITC-konjugiertem monoklonalen
Mäuse anti-humanem Ki-67Antigen (= MIB1) (Fa. DAKO, Glostrup, Dänemark,
Nr. F 0788) inkubiert. Überschüssiger Antikörper wurde mit 0,1 % Natriumazid in PBS
ausgewaschen (vgl. 8.2.3).
Die markierten Zellen wurden in FACS-Diluid resuspendiert, am FACScan ® gemessen
(vgl. Abbildung 3.5 und Abbildung 3.10) und der Proliferationsindex in Prozent (%) als
Anteil der gefärbten an allen Zellkernen angegeben.
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