Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des ...

Material und Methoden
einer 20 minütigen Zentrifugation bei 13000 g und 4°C wurde das Pellet in 100 µl
Solution D gelöst. Es folgte eine weitere Isopropanolfällung. Das Pellet wurde mit
75 % Ethanol gewaschen, nochmals abzentrifugiert und schließlich luftgetrocknet.
Der Niederschlag wurde in 20-50 µl DEPC-H2O resuspendiert. Die Reinheit und
Konzentration der so gewonnenen RNA wurde photometrisch bestimmt.
2.11.3 Konzentrationsbestimmung und RNA-Spektrum
RNA hat sein Absorbtionsmaximum bei 260 nm. Mit einem Spektrometer (Perkin
Elmer, Lamda 25 UV/VIS Spektrometer) wurde die Absorbtion der Lösung bei 260
nm gemessen und die RNA-Konzentration berechnet. Eine OD260 = 1 hat eine RNA-
Konzentration von 40 µg/ml. Des Weiteren war eine Aussage über die Reinheit der
Probe mit einem Spektrum von 220-320 nm möglich, da das Absorbtionsmaximum
von Phenol bei 220 nm und das von Proteinen bei 280 nm liegt.
2.11.4 Denaturierende RNA-Agarosegel-Elektrophorese
Für ein 1 %-iges Gel wurde 1 g Agarose in 62,1 ml DEPC-H2O aufgekocht, auf 60°C
abgekühlt, 20 ml 5 x Laufpuffer (0,1 M MOPS ( 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure )
pH 7,0, 40 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA pH 8,0) und 17,9 ml 37 % Formaldehyd
zugegeben und in einen Agarosegelschlitten gegossen. Zur Probenvorbereitung
wurden je 6 μl RNA Probe, die zuvor für 15 min bei 65°C denaturiert wurde und 6µl 2
x RNA-Ladepuffer (2 x Loading Dye Solution, Fermentas) in die Taschen des Gels
pipettiert. Die Gelelektrophorese erfolgte in 1 x Laufpuffer bei 5 V/cm und wurde
gestoppt, sobald der Farbmarker 2/3 des Gels durchlaufen hatte. Abschließend
wurde 30 min mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid in 0,1 M Ammoniumacetat gefärbt und
die RNA auf einem UV-Transluminator überprüft.
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