Lokalisation von mRNA-Transkripten auf Gewebeschnitten des ...

Tab. 6: Reaktionsansatz für die in vitro Synthese von RNA-Sonden
Material und Methoden
Volumen Konzentration
Geschnittener Vektor X µl 1 µg
5 x Puffer 10 µl
RiboLock 2 µl 80 Units
DIG-RNA-Labeling Mix 2 µl 10 mM/Nukleotidart
Polymerase SP6/T7 2 µl 40 Units
DEPC-H2O Ad 50 µl
Die Substanzen des Reaktionsansatzes wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß
gegeben und für 2 h bei 37°C inkubiert. 2 Units DNase 1, RNase-frei (MBI
Fermentas), verdaute in 15 Minuten bei 37°C die eingesetzte Plasmid-DNA. Die
Enzymreaktion wurde mit 5 µl 0,2 M EDTA-Lösung pH 8, welche die für die
Polymerasen nötige Mg 2+ Ionen bindet, gestoppt.
112,5 µl einer alkalischen Hydrolyse-Lösung (5µl 1 M DTT, 40µl 1 M NaHCO3, 60µl 1
M Na2CO3, 395µl DEPC-H2O) sorgte für eine Hydrolyse der RNA-Sonden in etwa
200 Basen lange Fragmente. Die Inkubationszeit betrug 45 min bei 60°C. Die
Reaktion wurde durch Abkühlen auf 4°C gestoppt und mit 112,5 µl eines
Neutralisationspuffers (5µl 1 M DTT, 5 µl CH3COOH, 100 µl Na(CH3COO), 390 µl
DEPC-H2O) neutralisiert.
Die RNA-Sonden wurden mindestens 1 h lang durch Zugabe von 28,4 µl
Lithiumchlorid und 750 µl Ethanol bei -80°C ausgefällt. Nach Zentrifugation bei
13000g für 20 min bei 4°C wurde das RNA-Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen,
abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet luftgetrocknet. Die RNA-
Sonden wurden in 30 µl Formamid (deionisiert) und 5 x SSC (im Verhältnis 3:1)
aufgenommen und bei -70°C gelagert. Die Sonden, die aus dem Antisense-Strang
der DNA entstanden sind, wurden als Negativkontrolle benutzt.
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